本發(fā)明關于一種培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法，尤指一種無菌培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法。

背景技術：

牛樟芝(antrodiacinnamomea)屬于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、樟芝種，乃多年生蕈菌類。樟芝為一種木材腐朽真菌，只生長在臺灣本土的老齡牛樟樹上。菇體表面孔狀，初生時鮮紅色，漸長變?yōu)槿榘咨⒌t褐色、淡褐色或淡黃褐色，子實體于牛樟樹干的中空內部長出，亦有自倒伏牛樟樹枯木底部長出者，有強烈的牛樟香味。

牛樟芝一直以來被視為珍貴的真菌類藥材，在許多研究中發(fā)現(xiàn)，三帖類化合物(triterpenoids)是牛樟芝最重要的成分之一，并且牛樟芝的三帖類化合物含量遠超過靈芝。此外，牛樟芝中所含有的其他化合物，例如多糖體、超氧歧化酶、腺苷、β-d-葡聚糖等生理活性成分，皆對于人體生理機能可發(fā)揮均衡保健的功效。三萜類的主要功能有抑制癌細胞的生長、抑制組織胺的釋放，防止過敏、促進肝功能、促進血小板凝集、以及降血脂等作用。三萜類的含量及種類愈多，則愈有醫(yī)療價值。從實驗證實：三萜類化合物能抑制肝癌細胞的增殖。高血壓患者往往因為血壓高，導致腦血管破裂而中風，三萜類化合物能有效的抑制血管緊張素轉化酶(ace)的活性，進而降低血壓。另外三萜類也具有抗發(fā)炎的功用。

由于牛樟樹已列入國家保育類植物，不準砍伐，牛樟芝采集不易，且品質不一。另外由于環(huán)境污染日漸嚴重，天然野生樟芝可能多少含有重金屬污染。因此近年來多以人工栽培方法來培養(yǎng)牛樟芝。根據twi422680揭示，習知的人工栽培方法包括椴木栽培法、固態(tài)栽培法以及液態(tài)發(fā)酵法。

然而，椴木栽培法無法在無菌的環(huán)境中進行，因此容易受到其他 微生物的污染，且椴木來源不易控管，也有受到污染的可能。椴木栽培法的牛樟芝在動物實驗結果中顯示具有腎上腺毒性，也會造成老鼠肝臟與卵巢的重量增加。

固態(tài)培養(yǎng)法主要是利用含有營養(yǎng)物質的太空包來培養(yǎng)牛樟芝(即既有栽培香菇的方法)，所得到的牛樟芝其外觀雖然與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，但其三帖類化合物的含量低，并且其他主要成分與野生及/或椴木栽培的牛樟芝子實體并不相同。

再者，一般藉由液態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)牛樟芝雖然可在短時間內收成牛樟芝液體發(fā)酵產品，但其主要產物為多糖類，并不含有三帖類化合物，并且其他主要成分與野生及/或椴木栽培的牛樟芝子實體相去甚遠。

有鑒于此，必須提供一種新穎的牛樟芝子實體培養(yǎng)方法，在無菌的環(huán)境下可有效的培養(yǎng)出牛樟芝子實體，并且其主要成分如三帖類化合物與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，以有效達到人體保健的效果。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法，包括：將牛樟芝菌種接菌至經滅菌的瓊脂培養(yǎng)基，以繼代培養(yǎng)產生次級菌絲體，并于該繼代培養(yǎng)過程中篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，以及，以該經篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體進行該繼代培養(yǎng)，以產生子實體。

前述瓊脂培養(yǎng)基包含：ym瓊脂培養(yǎng)基質；食用油，且以該瓊脂培養(yǎng)基總重計，該食用油的含量為大于0％至1％；以及酵母提取物，且以該瓊脂培養(yǎng)基總重計，該酵母提取物的含量為大于3％至5％。前述瓊脂培養(yǎng)基中的其余組份為水。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體以后，又自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體，并接種該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體至容器內的經滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)出次級菌絲體及子實體。

前述固態(tài)培養(yǎng)基包含至少一種谷物的固態(tài)部分；以及含有糖類化合物、酵母提取物、及食用油的液態(tài)部分，其中，以該液態(tài)部分總重 計，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％，且該液態(tài)部分在該容器內的高度為自該固態(tài)部分的半高處至與該固態(tài)部分頂面等高處。前述固態(tài)培養(yǎng)基中的其余組份為水。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體以后，自該瓊脂培養(yǎng)基取出該無變種及無毒性的次級菌絲體，并接種該無變種及無毒性的次級菌絲體至容器內的經滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法，包括將該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的無變種及無毒性的次級菌絲體接種至容器內的經滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

本發(fā)明無菌培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法是在無菌環(huán)境中將牛樟芝菌種接種于瓊脂培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)，產生無變種及無毒性的次級菌絲體后，藉此可由該無變種及無毒性的次級菌絲體直接培養(yǎng)得到無毒和無污染的牛樟芝子實體，且該牛樟芝子實體具有與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相同的指標性成分。

附圖說明

圖1為繼代培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片；

圖2為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片；

圖3為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片；

圖4為液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片；

圖5為市售牛樟芝子實體標準品(含11種標準品)的hplc圖譜；

圖6為野生(及/或椴木培養(yǎng))5.5年齡牛樟芝子實體的hplc圖譜；

圖7為本案實施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的hplc圖譜；

圖8為本案實施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的hplc圖譜；

圖9為本案實施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的hplc圖譜。

具體實施方式

以下通過特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，該領域技術人員可由本說明書所揭示的內容輕易地了解本發(fā)明的優(yōu)點及功效。本發(fā)明亦可藉由其它不同的實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節(jié)亦可基于不同觀點與應用，在不悖離本發(fā)明所揭示的精神下賦予不同的修飾與變更。

本文所述“基質”指在整體重量含量中占50％以上者。

一般，當菌種于適當的環(huán)境時可萌發(fā)出菌絲，此菌絲細胞含單細胞核，即為初級菌絲體。本文所述“次級菌絲體”指，當兩個可親和的單核菌絲相遇時，接觸的菌絲壁會融解，雙方的一個細胞核會相互移動到對方的細胞內，進行有絲分裂，形成雙核的菌絲，并以共軛分裂的方式成長，即稱為次級菌絲體。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法，可于繼代培養(yǎng)時獲得牛樟芝子實體，或者在繼代培養(yǎng)后，接續(xù)進行固態(tài)培養(yǎng)或液態(tài)培養(yǎng)，皆可獲得牛樟芝子實體。

在繼代培養(yǎng)的部分，包括：將牛樟芝菌種接菌至經滅菌的瓊脂培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)以產生次級菌絲體，并于該繼代培養(yǎng)過程中篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，以及，以該經篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體進行該繼代培養(yǎng)，以產生子實體。

瓊脂培養(yǎng)基的準備，是以ym瓊脂培養(yǎng)基質為基底，混合食用油及酵母提取物，使該瓊脂培養(yǎng)基中所含的食用油以該瓊脂培養(yǎng)基總重計的含量為大于0％至1％；而該酵母提取物以該瓊脂培養(yǎng)基總重計的含量為大于3％至5％。此外，前述酵母提取物可選擇一般市售的產品，并無特別限制。

接著將瓊脂培養(yǎng)基的溶液置入可滅菌容器中，進行一般常用的滅菌程序，如使用一般實驗室微生物培養(yǎng)常見的滅菌釜，藉由于密閉高壓下，產生高溫飽和的蒸汽進行濕熱滅菌，滅菌后，將該瓊脂培養(yǎng)基的溶液倒入至少一個培養(yǎng)皿中，靜置及待冷卻后，形成固態(tài)的瓊脂培 養(yǎng)基。之后，將牛樟芝菌種接菌至該瓊脂培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)于特定環(huán)境下繼代培養(yǎng)，可生長出牛樟芝的次級菌絲體，接著生長出顆粒狀牛樟芝子實體，該牛樟芝子實體所含的三萜類成份，非常接近于野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝的三萜類成份。

于繼代培養(yǎng)過程中，該無變種及無毒性的次級菌絲體是在培養(yǎng)出至少第1繼代后(包含第1繼代)篩選的，并繼續(xù)進行該繼代培養(yǎng)以產生牛樟芝子實體。

于繼代培養(yǎng)的過程中，例如在第1繼代時，即可篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體，繼續(xù)進行該繼代培養(yǎng)以產生牛樟芝子實體。

此外，本發(fā)明培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法中，該食用油為任何可食用的油脂，如植物油、動物油或食用精油，優(yōu)選牛樟芝精油。優(yōu)選地，以該瓊脂培養(yǎng)基總重計，該食用油的含量為0.5％。

于一具體實施例中，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體以后，自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體，并接種該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體至容器內經滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)出無變種及無毒性的次級菌絲體及子實體。此外，可自該瓊脂培養(yǎng)基取出不同繼代的無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體進行雜交培養(yǎng)。

前述固態(tài)培養(yǎng)基包含至少一種谷物的固態(tài)部分；以及含有糖類化合物、酵母提取物、及食用油的液態(tài)部分。于一具體實施例中，該固態(tài)部分包含復數種谷物，例如二種谷物，且以該固態(tài)部分總重計，各該谷物的含量為40至60％。在非限制性的實例中，谷物選自如黑糯米的米或可選自燕麥米。

于一具體實施例中，該固態(tài)部分包含40至60％黑糯米及40至60％燕麥米，優(yōu)選50％黑糯米及50％燕麥米。

該糖類化合物的選擇上并沒有特別限制，可選自單糖或雙糖，于一具體實施例中，該糖類化合物為選自葡萄糖、甘露糖及海藻糖所組成組的至少一者。

該固態(tài)培養(yǎng)基中，以該液態(tài)部分總重計，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％，且該液態(tài)部分在該容器內的高度為自該固態(tài)部分的半高處至 與該固態(tài)部分頂面等高處。于一具體實施例中，該液態(tài)部分包含20％酵母提取物、20％葡萄糖、20％甘露糖、20％海藻糖及0.5％牛樟芝精油。

在進行固態(tài)培養(yǎng)前，先將該固態(tài)培養(yǎng)基置入可滅菌容器中，進行一般常用的滅菌程序，接著，自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體，并接種該無變種及無毒性的次級菌絲體及/或子實體至容器內該經滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)出子實體。通常，自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出的無變種及無毒性的次級菌絲體，經固態(tài)培養(yǎng)20天至1個月，可繼續(xù)生成次級菌絲體，進行變種及毒性的篩選，僅篩選出無變種及無毒性的次級菌絲體再繼續(xù)培養(yǎng)1個月到3個月，可生成牛樟芝子實體。若自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出無變種及無毒性的子實體，經培養(yǎng)3個月至6個月，可生成牛樟芝子實體。

于另一具體實施例中，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產生無變種及無毒性的次級菌絲體后，自該瓊脂培養(yǎng)基取出該無變種及無毒性的次級菌絲體，并接種該無變種及無毒性的次級菌絲體至容器內經滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

于又一具體實施例中，包括將該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的無變種及無毒性的次級菌絲體接種至容器內經滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

于該容器內的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實體的步驟包括：在培養(yǎng)至停止期前，攪拌該液態(tài)培養(yǎng)基；以及停止攪拌該液態(tài)培養(yǎng)基，提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度，使該無變種及無毒性的次級菌絲體浮至該液態(tài)培養(yǎng)基的液面，以靜置培養(yǎng)出子實體。

該停止期指一般皆知的菌絲體的生長隨時間變化呈現(xiàn)菌絲體數目無凈增加的期間，根據本發(fā)明的方法，可于培養(yǎng)過程檢測以判斷是否達到停止期。于部分具體實施例中，該停止期為培養(yǎng)后的第20天至1個月。

另外，可使用各種方法提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度，于一具體實施例中，通過提升該酵母提取物及糖類的濃度，使該無變種及無毒性的次級菌絲體浮至該液態(tài)培養(yǎng)基的液面，以靜置培養(yǎng)出子實體。此外，于非限制性實施例中，提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度5倍，并可經3個月至6個月的培養(yǎng)，生成牛樟芝子實體。

另外，于一具體實施例中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含4％的酵母提取物、4％的糖類及0.5％的食用油，優(yōu)選為4％的酵母提取物、4％的葡萄糖及0.5％的牛樟芝精油。由于牛樟芝精油含量較低，提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度時，亦可僅提高酵母提取物及糖類的濃度，例如使酵母提取物和葡萄糖的濃度提升為20％的酵母提取物和20％的葡萄糖。

根據本發(fā)明的方法，該特定環(huán)境指于60至70％的相對濕度環(huán)境進行該繼代培養(yǎng)。

于一具體實施例中，該特定環(huán)境指于60至70％的相對濕度環(huán)境進行培養(yǎng)，且每天至少10至14小時的時間控制培養(yǎng)的溫度在24至27℃；每天至少10至14小時的時間控制培養(yǎng)的溫度在19至23℃。

于另一具體實施例中，該特定環(huán)境指于60至70％的相對濕度環(huán)境進行培養(yǎng)，且每天至少10至14小時的時間控制培養(yǎng)的溫度在24至27℃，優(yōu)選令該溫度對應在日照，例如白天的時間；每天至少10至14小時的時間控制培養(yǎng)的溫度在19至23℃，并令該溫度對應在非日照，例如晚上的時間。

于一具體實施例中，不以地理位置不同所造成的差異為限制，當白天的時間為6點至18點，則對應該時段，每天至少10至14小時的時間控制培養(yǎng)的溫度在24至27℃，并施以天然或人工日照，尤其至少90％的控溫時間對應在白天的時間。

于一具體實施例中，不以地理位置不同所造成的差異為限制，當晚上的時間為18點至6點，則對應該時段，每天至少10至14小時的時間控制培養(yǎng)的溫度在19至23℃，且不施以日照，尤其至少90％的控溫時間對應在晚上的時間。

此外，本發(fā)明的培養(yǎng)牛樟芝子實體的方法中，可于任何步驟中針對牛樟芝次級菌絲體及/或牛樟芝子實體進行無變種及無毒性的篩選。

實施例1-繼代培養(yǎng)

以ym瓊脂培養(yǎng)基質(ymagar，購自acumedia)作為基底，混合食用油及酵母提取物(購自豐味通)，使瓊脂培養(yǎng)基包含0.5％牛樟芝精油及4％酵母提取物(其余組份為水)，將混合后的瓊脂培養(yǎng)基的溶液置入可滅菌容器中，將可滅菌容器及其內含的瓊脂培養(yǎng)基的溶液以滅菌釜進行滅菌程序，將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基的溶液倒入多個培養(yǎng)皿中，靜置該瓊脂培養(yǎng)基的溶液，待冷卻后便形成固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基。

將牛樟芝菌種接菌至該固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基，接著將含有該牛樟芝菌種的固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基放置于特定環(huán)境下培養(yǎng)，以生成牛樟芝次級菌絲體，該特定環(huán)境為白天(6點至18點)時保持溫度24至27℃，晚上(18點至6點)時保持溫度19至23℃，且相對濕度范圍為60至70％。

在該繼代的過程中，在第1繼代就進行變種及毒性的篩選，僅挑出無變種及無毒性的次級菌絲體繼續(xù)進行繼代，其中，繼代1代需要20天至1個月。最后由該無變種及無毒性的次級菌絲體長出子實體，并于采收時，再次進行變種及毒性的篩選。圖1為繼代培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片。

實施例2-固態(tài)培養(yǎng)

預先準備固態(tài)培養(yǎng)基至可滅菌容器中，該固態(tài)培養(yǎng)基包括固態(tài)部分及液態(tài)部分，該固態(tài)部分包含50％黑糯米及50％燕麥米，該液態(tài)部分包含20％酵母提取物、20％葡萄糖、20％甘露糖、20％海藻糖及0.5％牛樟芝精油，其中，該液態(tài)部分在該容器內的高度為達該固態(tài)部分頂面等高處。將可滅菌容器及其內含的固態(tài)培養(yǎng)基以滅菌釜進行滅菌程序，自實施例1取出無變種及無毒性的次級菌絲體于該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，該固態(tài)培養(yǎng)基放置于如實施例1的環(huán)境下培養(yǎng)20天至1個月，以生成牛樟芝次級菌絲體，僅篩選出無變種及無毒性的牛樟芝次級菌絲體再繼續(xù)培養(yǎng)1個月到3個月，以生成牛樟芝子實體。最后長出子實體要采收時，再次進行變種及毒性的篩選。圖2為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片。

實施例3-固態(tài)培養(yǎng)

使用與實施例2相同的固態(tài)培養(yǎng)基及滅菌步驟，自實施例1篩選出無變種及無毒性的子實體于該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，該固態(tài)培養(yǎng)基放置于如實施例1的環(huán)境下培養(yǎng)3個月至6個月，以生成牛樟芝子實體。最后長出子實體要采收時再次進行變種及毒性的篩選。圖3為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片。

實施例4-液態(tài)培養(yǎng)

預先準備液態(tài)培養(yǎng)基，該液態(tài)培養(yǎng)基包含4％酵母提取物、4％葡萄糖及0.5％牛樟芝精油，將該液態(tài)培養(yǎng)基置入可滅菌容器中，將可滅菌容器及其內含的液態(tài)培養(yǎng)基以滅菌釜進行滅菌程序，自實施例1取出無變種及無毒性的次級菌絲體于該液態(tài)培養(yǎng)基攪拌培養(yǎng)，該液態(tài)培養(yǎng)基放置于如實施例1的環(huán)境下培養(yǎng)至停(靜)止期時(20天至1個月)停止攪拌，接著將該液態(tài)培養(yǎng)基濃度提高5倍(即提高酵母提取物的濃度至20％，提高葡萄糖的濃度至20％，且不增加牛樟芝精油脂濃度)，此時該無變種及無毒性的次級菌絲體因液體濃度增加而浮至液面，再繼續(xù)培養(yǎng)3個月至6個月，以生成牛樟芝子實體。最后長出子實體要采收時，再次進行變種及毒性的篩選。圖4為液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的照片。

測試例1-三萜類化合物的種類與含量測試

為了證實經由本發(fā)明培養(yǎng)方法所得到的牛樟芝子實體確實具有功能性成分的三帖類化合物，藉由hplc圖譜比對市售牛樟芝子實體標準品(a)及野生及/或椴木培養(yǎng)5.5年齡牛樟芝子實體(b)、本案實施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體(c)、本案實施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體(d)與本案實施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體(e)。

受試樣本三萜類化合物的萃取

分別稱取50毫克的(a)至(e)，加入5毫升去離子水，至于80℃水浴槽中萃取兩次(每次3小時)。接著進行離心并去除上清液(含水溶性物質)，將下層固體物進行冷凍干燥并稱重。干燥后的物質，加入50倍體積的絕對乙醇(購自sigmano.32221)，進行三萜類化合物萃取1.5小時，再離心收集上清液(含三萜類化合物)，重復進行三次。將收集 的上清液，進行冷凍干燥，干燥后以10毫升絕對乙醇覆溶成水溶液(a)至(e)，使用hplc儀器進行三萜類化合物種類分析。

hplc分析方法

吸取2微升(ul)的水溶液(a)至(e)，打入hplc儀器中，以流速200微升/分鐘(ul/min)的速率，通過c18管柱(2.1x100mm，粒徑3微米)，以偵測波長244納米進行分析比對。

hplc分析結果

市售牛樟芝子實體標準品-水溶液(a)：

市售牛樟芝子實體標準品包含11種標準品，如圖5所示各標準品保留時間為(1)樟芝酸k(antcink)為22.94與23.43分鐘，(2)苯并二惡茂(benzodioxole)為25.82分鐘，(3)樟芝甲酯k(methylantcinatek)為31.47與31.77分鐘，(4)樟芝酸c(antcinc)為35.34與36.27分鐘，(5)樟芝酸h(antcinh，zhankuicacidc)為36.99與37.49分鐘，(6)去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenicacid)為41.86分鐘，(7)樟芝酸b(antcinb)為44.82與45.10分鐘，(8)齒孔酸(eburicoicacid)為50.17分鐘，(9)樟芝酸a(antcina)為52.41分鐘，(10)樟芝甲酯b(methylantcinateb)為57.40分鐘，(11)去氫齒孔酸(dehydroeburicoicacid)為73.05分鐘。

野生(及/或椴木培養(yǎng))5.5年齡牛樟芝子實體-三萜類萃取液(b)：

比對市售標準品，如圖6所示，野生(及/或椴木培養(yǎng))5.5年齡牛樟芝子實體的三萜類種類包含9種(1)antcink為24.15與24.65分鐘，(3)methylantcinatek為32.61與32.64分鐘，(4)antcinc為36.67與37.62分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為38.29與38.78分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為43.17分鐘，(7)antcinb為46.28分鐘，(8)eburicoicacid為51.20分鐘，(9)antcina為54.03分鐘，(11)dehydroeburicoicacid為74.97分鐘。

比對出的三萜類化合物的種類含量百分比。計算方式為，計算出圖譜中每個峰(peak)的面積大小，將每個峰(peak)面積相加后為總含量。將比對到的三萜化合物面積除以總含量面積，即可得含量百分比。所得的三萜含量約為：(1)13.26％、(3)1.32％、(4)3.98％、(5)11.94％、(6)33.16％、(7)4.14％、(8)1.32％、(9)2.65％以及(11)21.22％。

本案實施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體-三萜類萃取液(c)：

比對市售標準品，如圖7所示，本案實施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的三萜類種類包含7種(1)antcink為25.28與25.95分鐘，(4)antcinc為36.83與38.01分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為38.69與38.94分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為43.35分鐘，(7)antcinb為46.53分鐘，(9)antcina為54.18分鐘，(11)dehydroeburicoicacid為75.05分鐘。

比對出的三萜類化合物的種類含量百分比，計算方式如前述。所得的三萜含量約為：(1)27.62％，(4)24.86％，(5)15.19％，(6)6.90％，(7)5.52％，(9)1.65％以及(11)2.76％。本案實施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體-三萜類萃取液(d)：

比對市售標準品，如圖8所示，本案實施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的三萜類種類包含7種(1)antcink為24.533與25.179分鐘，(2)benzodioxole4.97％為26.88分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為39.57與40.06分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為43.95分鐘，(7)antcinb為47.21分鐘，(8)eburicoicacid為51.58分鐘，(10)methylantcinateb為61.87分鐘(11)dehydroeburicoicacid為75.42分鐘。

比對出的三萜類化合物的種類含量百分比，計算方式如前述。所得的三萜含量約為：(1)antcink3.98％，(2)benzodioxole4.97％，(5)antcinh(zhankuicacidc)4.97％，(6)dehydrosulphurenicacid9.95％，(7)antcinb7.96％，(8)eburicoicacid5.97％，(10)methylantcinateb1.99％以及(11)dehydroeburicoicacid8.95％。本案實施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體-三萜類萃取液(e)：

比對市售標準品，如圖9所示，本案實施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實體的三萜類種類包含8種(1)antcink為23.15與23.65分鐘，(3)methylantcinatek為34.51與34.78分鐘，(4)antcinc為37.58與37.72分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為39.14與39.52分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為44.09分鐘，(7)antcinb為47.32分鐘，(9)antcina為55.16分鐘，(11)dehydroeburicoicacid為75.85分鐘。

比對出的三萜類化合物的種類含量百分比，計算方式如前述。所得的三萜含量約為：(1)22.76％，(3)5.20％，(4)20.81％，(5)11.38％，(6)16.26％，(7)1.62％，(9)1.30％以及(11)6.50％。

藉由本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法，可有效控制牛樟芝子實體在無菌的環(huán)境下生長，并藉由模擬野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝的生長環(huán)境，使本發(fā)明的牛樟芝子實體的內含最重要的三萜類成份能非常接近于野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝，以達到與野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝同樣的功效，具相當的保健效果。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何該領域技術人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有此項專業(yè)知識者，在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術原理下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由權利要求書范圍所涵蓋。