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本發(fā)明根據(jù)由國(guó)立癌癥研究院(National Institute of Cancer，NCI)授予的撥款號(hào)CA 127541和由國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的撥款號(hào)P30CA033572在政府資助下作出。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。

發(fā)明背景

抗代謝藥物羥基脲(HU)已用于治療多種人癌癥，包括慢性骨髓源性白血病、頭頸部癌癥和其它癌癥(1)。它的主要抗癌靶標(biāo)是使核糖核苷酸還原成它們的相應(yīng)脫氧形式以供給dNTP來(lái)達(dá)成DNA復(fù)制和修復(fù)的核糖核苷酸還原酶(RR)(3,4)。人RR由hRRM1和hRRM2亞單位組成(3,4)。在基因毒性刺激之后，替代性RR酶被誘導(dǎo)以供給dNTP來(lái)達(dá)成DNA修復(fù)，該酶由hRRM1和p53R2(hRRM2的由腫瘤抑制蛋白p53反式活化的同源物)組成(5)。在細(xì)胞內(nèi)，已知HU通過(guò)淬滅自由基介導(dǎo)的催化(3)的氧化轉(zhuǎn)化(6)產(chǎn)生自由基來(lái)抑制兩種類型的RR(4)。然而，在藥理學(xué)上，HU療法因體內(nèi)半衰期短暫和成問(wèn)題的副作用而受損，該副作用最特別是骨髓抑制以及胃腸和皮膚病學(xué)影響(7)。

聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)和PARP2均是在腫瘤發(fā)展中具有作用的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶(ART)。具有PARP活性的ART成員(諸如PARP1)含有具有高度保守的活性位點(diǎn)序列的保守催化結(jié)構(gòu)域(12-14)。在單鏈DNA斷裂之后，PARP1從β-NAD+底物合成ADP-核糖聚合物，并且將這些聚合物轉(zhuǎn)移至接受體蛋白質(zhì)(其自身或其它蛋白質(zhì))的谷氨酸、賴氨酸或天冬氨酸殘基中，該聚合物隨后由聚(ADP-核糖)糖基水解酶(PARG)降解。在單鏈DNA斷裂修復(fù)(SSBR)或堿基切除修復(fù)(BER)期間，PARP1和PARP2與X射線修復(fù)互補(bǔ)蛋白-1(XRCC1)相互作用以將SSBR/BER因子DNA聚合酶β或DNA連接酶III募集至DNA損害位點(diǎn)(12-14)。在無(wú)PARP1下，在DNA復(fù)制期間持續(xù)存在單鏈斷裂將導(dǎo)致復(fù)制叉停滯，其解決需要BRCA1或BRCA2介導(dǎo)的同源性修復(fù)(HR)(15,16)。BRCA1連同BRCA2一起是與家族性乳腺癌的發(fā)作相關(guān)聯(lián)的腫瘤抑制基因(11)。在不存在BRCA1下，雙鏈斷裂因此積累，從而通過(guò)凋亡來(lái)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。BRCA1/2缺陷性腫瘤可對(duì)PARP1抑制劑敏感，但可遭受對(duì)PARP1抑制劑的獲得性抗性。因此，本領(lǐng)域中對(duì)避免與當(dāng)前療法相關(guān)的副作用和/或獲得性抗性的BRCA1/2缺陷性腫瘤治療存在需要。因此，本文提供對(duì)本領(lǐng)域中這些和其它問(wèn)題的解決方案。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本文尤其公開(kāi)通過(guò)施用有效量的COH29(包括其藥學(xué)上可接受的鹽)來(lái)治療BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者的癌癥的方法。也公開(kāi)通過(guò)以組合協(xié)同量施用COH29(包括其藥學(xué)上可接受的鹽)和DNA損害性抗癌劑來(lái)治療受試者的癌癥的方法。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1B.BRCA1狀態(tài)影響COH29細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性：圖1A：與COH29一起孵育72小時(shí)并被溶解的表達(dá)wt(野生型)BRCA1(OV90)或突變BRCA1(UWB1.289)的卵巢癌細(xì)胞的劑量響應(yīng)曲線(細(xì)胞活力通過(guò)MTT測(cè)定來(lái)評(píng)估)，并且描繪的各點(diǎn)代表用誤差棒指示的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；用HCC1937(圖1B)和HCC1937+BRCA1(圖1C)細(xì)胞在雌性NSG小鼠的乳腺脂肪墊中產(chǎn)生的腫瘤外植體的生長(zhǎng)(如所指示用COH29或媒介物治療小鼠-結(jié)果是來(lái)自4只小鼠/組的腫瘤測(cè)量結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

圖2A-2B.患者群組中RRM2表達(dá)與PARP1的關(guān)聯(lián)。(圖2A)乳腺癌和(圖2B)卵巢癌中的從公共臨床結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)提取的RRM2和PARP1表達(dá)的回歸圖。

圖3A-3B.COH29抑制BRCA1缺陷性人乳腺癌細(xì)胞中的PARP1：圖3A)：使用Materials&Methods中所述的程序，一式兩份評(píng)估COH29對(duì)表達(dá)突變或wt BRCA1(在各情況下，wt＝+BRCA1)的各對(duì)等基因乳腺(HCC1937)和卵巢(UWB1.289)癌細(xì)胞系中的PARP1活性的影響；圖3B：通過(guò)使用抗人PARP1抗體作為初級(jí)抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)評(píng)估COH29對(duì)等基因HCC1937/HCC1937+BRCA1細(xì)胞系中的PARP1蛋白表達(dá)的影響。裝載對(duì)照是β-肌動(dòng)蛋白。

圖4A-4B:.BRCA1對(duì)在用COH29和順鉑雙重處理之后的細(xì)胞可存活性的影響：圖4A：用固定濃度的COH29(12.5μΜ)加順鉑(12.5、25、50和100μΜ)處理24小時(shí)的HCC1937和HCC1937+BRCA1細(xì)胞的通過(guò)MTT測(cè)定所評(píng)估的活力(描繪的各點(diǎn)代表用誤差棒指示的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)；圖4B：在單獨(dú)5μΜCOH29、單獨(dú)4μΜ順鉑或兩種藥物在相同濃度下的組合存在下，所指示細(xì)胞中的24小時(shí)活力的直方圖(顯示的是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)。

圖5A-5D.COH29相較于HU在斑馬魚(yú)基因毒性測(cè)定中的作用：圖5A：暴露于如所指示的HU的在4dpf(受精后天數(shù))時(shí)的野生型斑馬魚(yú)胚胎(眼和心臟發(fā)育方面的形態(tài)學(xué)變化由箭頭指示)。圖5B：一系列不同濃度的HU對(duì)斑馬魚(yú)的影響的柱狀圖(0、5、10、20、50mM，n＝50，一式三份進(jìn)行)。圖5C：暴露于如所指示的COH29的在4dpf時(shí)的野生型斑馬魚(yú)胚胎。圖5D：一系列不同濃度的COH29對(duì)斑馬魚(yú)的影響的柱狀圖(0、10、20、50、100μΜ，n＝46，一式三份進(jìn)行)。

圖6.COH29處理使DNA損害檢查點(diǎn)活化。COH29處理對(duì)表達(dá)wt p53(MCF-7)或p53缺陷性(MCF-7p53-/-)的人乳腺癌細(xì)胞中以及三重陰性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468)中的DNA損害檢查點(diǎn)蛋白質(zhì)的影響，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡所評(píng)估。

圖7A-7D.在BRCA1野生型人肺癌細(xì)胞中，COH29活化DDR，并且抑制RAD51表達(dá)。圖7A：通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)評(píng)估COH29對(duì)細(xì)胞質(zhì)和核中的DDR相關(guān)蛋白質(zhì)的影響，其中用COH29在指示的劑量下處理細(xì)胞48小時(shí)，并且使用指示的抗體，使細(xì)胞溶解產(chǎn)物經(jīng)受免疫印跡(FOXO3活性由它的下游靶標(biāo)p27Kip1的水平指示，并且β-微管蛋白和核纖層蛋白A/C代表細(xì)胞質(zhì)和核提取物的分級(jí)分離和裝載對(duì)照)；圖7B-7D：通過(guò)間接免疫熒光測(cè)定來(lái)評(píng)估COH29對(duì)DDR相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸ATM(圖7B)、γ-Η2ΑΧ(圖7C)和磷酸p53(圖7D)與foxo3在核中共定位的影響。對(duì)于各蛋白質(zhì)，分析平均300個(gè)染色細(xì)胞，并且直方圖顯示具有陽(yáng)性核(≥5個(gè)灶)的細(xì)胞的百分比(％)，其中生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)目是3，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，并且P值(配對(duì)t檢驗(yàn))如所指示。

圖8A-8B.COH29對(duì)NHEJ DNA修復(fù)的影響。在所示劑量下的單獨(dú)或與順鉑組合的COH29的活性，通過(guò)在使細(xì)胞暴露于藥物24小時(shí)之后對(duì)EJ2(圖8A)(替代性NHEJ路徑)或EJ5(圖8B)(NHEJ路徑)細(xì)胞進(jìn)行FACS分析所評(píng)估。

圖9A-9B.COH29抑制人肺癌細(xì)胞中的RAD51：圖9A：使用抗人RAD51抗體作為初級(jí)抗體，通過(guò)間接免疫熒光測(cè)定來(lái)評(píng)估COH29對(duì)RAD51蛋白的作用。圖9B：使用抗人RAD51抗體作為用于分析的初級(jí)抗體(裝載對(duì)照是β-肌動(dòng)蛋白)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)評(píng)估COH29對(duì)RAD51蛋白的作用；用COH29在指示的劑量下處理A549肺癌細(xì)胞24小時(shí)，并且在COH-29處理之后的γ-Η2ΑΧ表達(dá)樣式也類似地分析于圖9A和9B中。

發(fā)明詳述

定義

“患者”、“受試者”、“有需要的患者”和“有需要的受試者”在本文中可互換使用，并且是指罹患或易患可通過(guò)施用COH29或COH29與如本文討論的其它抗癌劑組合來(lái)治療的疾病或病狀的活生物體。在實(shí)施方案中，疾病或病狀是癌癥。受試者的非限制性實(shí)例包括人、其它哺乳動(dòng)物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、綿羊、母牛、鹿和其它非哺乳動(dòng)物動(dòng)物。在實(shí)施方案中，患者是人。

如本文所用的“癌癥受試者”是指患有如本文所述的癌癥的受試者。癌癥受試者可患有至少一種本文所述的癌癥。因此，舉例來(lái)說(shuō)，癌癥受試者可指“乳腺癌受試者”(例如患有乳腺癌的受試者)或“卵巢癌受試者”(例如患有卵巢癌的受試者)。癌癥受試者可患有展現(xiàn)特定基因型或表型特征(例如缺陷性基因產(chǎn)物或?qū)μ囟拱﹦┑目剐?的癌癥。因此，癌癥受試者可為“BRCA1缺陷性受試者”，其中BRCA1缺陷性受試者是患有包括BRCA1缺陷性基因或BRCA1缺陷性蛋白(例如“BRCA1缺陷”)的癌的受試者。在實(shí)施方案中，“BRCA1缺陷性受試者”是指至少部分地直接或間接導(dǎo)致受試者的癌癥的BRCA1基因非表達(dá)(例如相對(duì)于對(duì)照或健康受試者，表達(dá)降低)，在受試者中不存在功能性BRCA1(例如相對(duì)于對(duì)照或健康受試者，數(shù)量降低)，或BRCA1表達(dá)降低。在實(shí)施方案中，BRCA1缺陷性受試者顯示BRCA1基因非表達(dá)，在受試者中不存在功能性BRCA1。癌癥受試者可為“PARP1抑制劑抗性受試者”，其中PARP1抑制劑抗性受試者是患有對(duì)至少一種如本領(lǐng)域中已知的PARP1抑制劑具有抗性的癌癥的受試者。癌癥受試者可為“DNA損害性抗癌劑抗性受試者”，其中此受試者患有對(duì)至少一種如本領(lǐng)域中已知的DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥。癌癥受試者可患有展現(xiàn)超過(guò)一種基因型或表型特征的癌癥(例如乳腺癌受試者可患有具有BRCA1缺陷和對(duì)至少一種PARP1抑制劑的抗性的癌癥)。

“COH29”是指具有式(N-(4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羥基苯甲酰胺)的化合物：

COH29和它的合成描述于整體并入本文的美國(guó)專利號(hào)：7,956,076；8,372,983以及國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枺篜CT/US 13/24490中。

可向本文所述的癌癥受試者，包括例如乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者施用COH29。施用可在如本文闡述的治療有效量下。

“BRCA1”是根據(jù)它的常見(jiàn)普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質(zhì)及其功能性片段和同源物。該術(shù)語(yǔ)包括重組或天然存在形式的BRCA1(例如乳腺癌1，早期發(fā)作；GI編號(hào)：1698399)或其維持BRCA1活性的變體(例如相較于BRCA1，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內(nèi))。

“γ-Η2ΑΧ”是根據(jù)它的常見(jiàn)普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質(zhì)及其功能性片段和同源物。該術(shù)語(yǔ)包括任何重組或天然存在形式的γ-Η2ΑΧ(例如γ組蛋白H2AX；GI編號(hào)：4504253)或其維持γ-Η2ΑΧ活性的變體(例如相較于γ-Η2ΑΧ，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內(nèi))。

“Rad51”是根據(jù)它的常見(jiàn)普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質(zhì)及其功能性片段和同源物。該術(shù)語(yǔ)包括任何重組或天然存在形式的Rad51(例如GI編號(hào)：49168602)或其維持Rad51活性的變體(例如相較于Rad51，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內(nèi))。

“PARP1”是根據(jù)它的常見(jiàn)普通含義使用，并且是指具有相同或類似名稱的蛋白質(zhì)及其功能性片段和同源物。該術(shù)語(yǔ)包括任何重組或天然存在形式的PARP1(例如聚[ADP-核糖]聚合酶1；GI編號(hào)：156523968)或其維持PARP1活性的變體(例如相較于PARP1，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性內(nèi))?！癙ARP1抑制劑”是抑制PARP1(NAD⁺ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶1)的活性的組合物(例如化合物、肽、蛋白質(zhì)、核酸或抗體)。

“PARP1抑制劑”是通過(guò)抑制PARP1的活性或表達(dá)來(lái)有效治療癌癥的組合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗體)。PARP1抑制劑的非限制性實(shí)例包括奧拉帕尼(olaparib)、維利帕尼(veliparib)、依尼帕尼(iniparib)和尼拉帕尼(niraparib)。

“DNA損害性抗癌劑”是通過(guò)損害DNA來(lái)有效治療癌癥的組合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗體)。DNA損害性抗癌劑可為化學(xué)治療劑。在實(shí)施方案中，DNA損害劑包括輻照(例如γ輻照)。DNA損害性抗癌劑的相互作用可直接的(例如與DNA自身結(jié)合或相互作用)或間接的(例如與和DNA相互作用的其它分子結(jié)合或相互作用)。在本文中，DNA損害性抗癌劑包括例如烷基化劑(例如氮丙啶、甲基蜜胺、亞硝基脲、氮芥、白消安、環(huán)磷酰胺和甲基芐肼)、抗代謝劑、蒽環(huán)霉素、基于鉑的藥劑、紫杉烷、激酶抑制劑、組蛋白脫乙?；敢种苿?HDAC)、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和核苷酸類似物。在實(shí)施方案中，DNA損害性抗癌劑包括插入在DNA堿基對(duì)之間或結(jié)合在DNA的小溝或大溝中的組合物。在實(shí)施方案中，DNA損害性抗癌劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶I藥劑、喜樹(shù)堿、伊立替康、拓?fù)涮婵?、拓?fù)洚悩?gòu)酶II藥劑、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、亞德里亞霉素(adriamycin)(例如阿霉素(doxorubicin))、依托泊苷、單鏈斷裂劑(例如BCNU(卡莫司汀)、CCNU(洛莫司汀))、DTIC(達(dá)卡巴嗪)、癌得星(Cytoxan)(環(huán)磷酰胺)、異環(huán)磷酰胺、博萊霉素和絲裂霉素C。

“化學(xué)治療”或“化學(xué)治療劑”是根據(jù)它的平常普通含義使用，并且是指具有抗贅生性質(zhì)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的能力的化學(xué)組合物或化合物。

抗癌藥物順鉑已用于治療各種人癌癥，包括例如卵巢癌、睪丸癌、生殖細(xì)胞腫瘤、小細(xì)胞肺癌、淋巴瘤、頭頸部癌和膀胱癌。在本文中，“基于鉑的化合物”或“含有鉑的藥劑”是指含有由有機(jī)和/或無(wú)機(jī)官能基圍繞的中心鉑原子的化合物，其包括重金屬絡(luò)合物。包括在基于鉑的化合物內(nèi)的是基于鉑的藥物?；阢K的化合物的非限制性實(shí)例包括順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑、賽特鉑(satraplatin)、三鉑(triplatin)、四硝酸鹽、其藥學(xué)上可接受的鹽、其立體異構(gòu)體、其衍生物、其類似物及其組合。術(shù)語(yǔ)“順鉑”包括衍生物和類似物，諸如以引用的方式整體并入本文的美國(guó)專利號(hào)4,177,263、4,584,316、5,648,362和5,399,694中所述的那些。

順鉑抗癌活性主要源于靶標(biāo)細(xì)胞中的DNA交聯(lián)，此需要涉及順鉑氯離子與親核試劑基團(tuán)的交換反應(yīng)。順鉑通過(guò)與d(GpG)或d(ApG)序列形成鏈內(nèi)加合物來(lái)在DNA中導(dǎo)致二齒損傷。順鉑也能夠產(chǎn)生可干擾DNA復(fù)制的鏈間交聯(lián)。損傷使DNA損害檢查點(diǎn)活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)展阻滯?；颊咧行纬衫^發(fā)性腫瘤代表與順鉑療法相關(guān)的一個(gè)主要問(wèn)題。順鉑的其它副作用可包括腎毒性、神經(jīng)毒性、惡心、耳毒性、骨髓毒性和電解質(zhì)不平衡。順鉑抗性也見(jiàn)于癌癥患者中。

術(shù)語(yǔ)“治療(treating/treatment)”是指在治療或改善損傷、疾病、病變或病狀方面的任何成功跡象，包括任何客觀或主觀參數(shù)，諸如減輕；緩解；減弱癥狀或使得損傷、病變或病狀更可為患者耐受；減緩?fù)嘶蛩ネ怂俾剩皇沟猛嘶K點(diǎn)的致虛弱性較??；改進(jìn)患者的身體或精神健康狀態(tài)。對(duì)癥狀的治療或改善可基于客觀或主觀參數(shù)；包括身體檢查、神經(jīng)精神病學(xué)測(cè)驗(yàn)和/或精神病學(xué)評(píng)估的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“治療”及其變化形式包括預(yù)防損傷、病變、病狀或疾病。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指見(jiàn)于哺乳動(dòng)物中的所有類型的癌癥、贅瘤、惡性或良性腫瘤，包括白血病、癌瘤和肉瘤。示例性癌癥包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌和胰腺癌。額外實(shí)例包括白血病(例如急性骨髓性白血病(“AML”)或慢性骨髓源性白血病(“CML”))、腦癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、肉瘤和前列腺癌、子宮頸癌、胃癌、頭頸部癌、子宮癌、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性骨癌、神經(jīng)管母細(xì)胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多、原發(fā)性巨球蛋白血病、原發(fā)性腦腫瘤、惡性胰腺胰島瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、惡變前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、內(nèi)分泌和外分泌胰腺贅瘤。

術(shù)語(yǔ)“白血病”廣泛指代形成血液的器官的進(jìn)行性惡性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白細(xì)胞和它們的前體的增殖和發(fā)育不正常。白血病通?；谝韵录右耘R床分類：(1)疾病的持續(xù)時(shí)間和特性-急性或慢性；(2)涉及的細(xì)胞的類型-骨髓性(骨髓源性)、淋巴性(淋巴源性)或單核細(xì)胞性；以及(3)血液中的異常細(xì)胞的數(shù)目增加或不增加-白血病性或非白血性(亞白血病性)。鼠類白血病模型被廣泛接受為可預(yù)測(cè)體內(nèi)抗白血病活性。據(jù)信無(wú)論所治療的白血病的類型如何，在P388細(xì)胞測(cè)定中測(cè)試為陽(yáng)性的化合物都將通常展現(xiàn)一定抗白血病活性水平。因此，本發(fā)明包括一種治療白血病的方法，包括治療急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、嗜堿粒細(xì)胞性白血病、母細(xì)胞白血病、牛白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、嗜酸性粒細(xì)胞性白血病、格羅斯白血病(Gross'leukemia)、毛細(xì)胞白血病、血母細(xì)胞性白血病、造血母細(xì)胞性白血病、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白細(xì)胞減少性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴母細(xì)胞性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞白血病、巨核細(xì)胞白血病、小髓母細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病、髓母細(xì)胞白血病、骨髓性白血癥、骨髓性粒細(xì)胞性白血病、髓單核細(xì)胞性白血病、內(nèi)格利白血病、漿細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、早幼粒細(xì)胞性白血病、里德?tīng)柤?xì)胞白血病、席林氏白血病(Schilling's leukemia)、干細(xì)胞性白血病、亞白血病性白血病和未分化細(xì)胞性血病。

術(shù)語(yǔ)“肉瘤”通常是指由如同胚性結(jié)締組織的物質(zhì)構(gòu)成的腫瘤，并且通常由包埋在原纖維或均質(zhì)物質(zhì)中的緊密堆積的細(xì)胞組成?？捎每官樕虼冀Y(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑的組合治療的肉瘤包括軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內(nèi)西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、腺泡狀軟組織肉瘤、釉母細(xì)胞性肉瘤、葡萄樣肉瘤、綠色瘤肉瘤、絨毛膜癌、胚性肉瘤、韋爾姆斯氏腫瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宮內(nèi)膜肉瘤、基質(zhì)肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纖維母細(xì)胞性肉瘤、巨細(xì)胞肉瘤、粒細(xì)胞性肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤、B細(xì)胞的免疫母細(xì)胞性肉瘤、淋巴瘤、T細(xì)胞的免疫母細(xì)胞性肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤、庫(kù)普弗細(xì)胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間質(zhì)瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、網(wǎng)織紅細(xì)胞性肉瘤、勞斯肉瘤、漿液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛細(xì)管擴(kuò)張性肉瘤。

術(shù)語(yǔ)“黑素瘤”用于意指由皮膚和其它器官的黑素細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的腫瘤?？捎每官樕虼冀Y(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑的組合治療的黑素瘤包括例如肢端雀斑黑素瘤、無(wú)黑色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克勞德曼氏黑素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑素瘤、哈丁-帕西黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑素瘤、惡性小痣黑素瘤、惡性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、甲下黑素瘤和淺表擴(kuò)散性黑素瘤。

術(shù)語(yǔ)“癌瘤”是指由傾向于浸潤(rùn)周圍組織并導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞構(gòu)成的惡性新生物。可用抗贅生硫醇結(jié)合線粒體氧化劑和抗癌劑的組合治療的示例性癌瘤包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺囊性癌、腺樣囊性癌、腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、基底細(xì)胞樣癌、基底鱗狀細(xì)胞癌、細(xì)支氣管肺泡癌、細(xì)支氣管癌、支氣管源性癌、髓樣癌(cerebriform carcinoma)、肝小膽管癌、絨膜癌、膠樣癌、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、鎧甲狀癌、皮膚癌、柱狀癌、柱狀細(xì)胞癌、導(dǎo)管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚性癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外生性癌、潰瘍性癌、纖維癌、凝膠樣癌(gelatinifomi carcinoma)、凝膠狀癌、巨細(xì)胞癌(giant cell carcinoma)、巨細(xì)胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺性癌、粒層細(xì)胞癌、毛發(fā)基質(zhì)癌(hair-matrix carcinoma)、血樣癌、肝細(xì)胞癌、許特萊細(xì)胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌、腎上腺樣癌、嬰兒胚性癌、原位癌、表皮內(nèi)癌、上皮內(nèi)癌、克龍派切爾氏癌(Krompecher's carcinoma)、庫(kù)爾契茨基細(xì)胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細(xì)胞癌、豆?fàn)畎?lenticular carcinoma)、豆?fàn)畎?carcinoma lenticulare)、脂瘤性癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、軟癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液細(xì)胞癌、粘液表皮樣癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麥細(xì)胞癌、骨化性癌、骨樣癌、乳頭狀癌、門(mén)靜脈周圍癌、侵襲前癌、棘細(xì)胞癌、髓樣癌(pultaceous carcinoma)、腎臟腎細(xì)胞癌、貯備細(xì)胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤樣癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細(xì)胞癌、單純癌、小細(xì)胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細(xì)胞癌、梭形細(xì)胞癌、海綿樣癌、鱗狀癌、鱗狀細(xì)胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴(kuò)張性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管擴(kuò)張性癌(carcinoma telangiectodes)、移行細(xì)胞癌、結(jié)節(jié)性癌(carcinoma tuberosum)、結(jié)節(jié)性癌(tuberous carcinoma)、疣狀癌(verrucous carcinoma)和絨毛狀癌。

“癌癥模型生物體”是展現(xiàn)指示癌癥的表型或在生物體內(nèi)展現(xiàn)致癌要素的活性的生物體(例如癌細(xì)胞系)。癌癥模型生物體可展現(xiàn)如本文所述的癌癥的表型。因此，癌癥模型生物體可為例如對(duì)PARP1抑制劑具有抗性，或?qū)NA損害性抗癌劑具有抗性的缺乏BRCA1的癌細(xì)胞系。廣泛多種生物體可充當(dāng)癌癥模型生物體，并且包括例如癌細(xì)胞和哺乳動(dòng)物生物體，諸如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)和靈長(zhǎng)類動(dòng)物(諸如人)。癌細(xì)胞系被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛理解為與體內(nèi)癌展現(xiàn)類似表型或基因型的細(xì)胞。如本文所用的癌細(xì)胞系包括來(lái)自動(dòng)物(例如小鼠)以及來(lái)自人的細(xì)胞系。

“抗癌劑”是根據(jù)它的平常普通含義使用，并且是指具有抗贅生性質(zhì)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的能力的組合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗體)。在一些實(shí)施方案中，抗癌劑是化學(xué)治療劑。在一些實(shí)施方案中，抗癌劑是本文鑒定的在治療癌癥的方法中具有效用的藥劑。在一些實(shí)施方案中，a抗癌劑是由FDA或除美國(guó)以外的國(guó)家的類似管理機(jī)構(gòu)核準(zhǔn)用于治療癌癥的藥劑?？拱﹦┛蓪?duì)某些癌癥或某些組織具有選擇性。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“施用”意指口服施用，以栓劑形式施用，經(jīng)表面接觸，靜脈內(nèi)、胃腸外、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、病變內(nèi)、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下施用，或向受試者中植入緩慢釋放裝置，例如小型滲透泵。施用是通過(guò)任何途徑來(lái)達(dá)成，包括胃腸外和經(jīng)粘膜(例如經(jīng)頰、舌下、經(jīng)腭、經(jīng)齒齦、經(jīng)鼻、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸或經(jīng)皮)。胃腸外施用包括例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、小動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、室內(nèi)和顱內(nèi)。其它遞送模式包括但不限于使用脂質(zhì)體制劑、靜脈內(nèi)輸注、經(jīng)皮貼片等。

就“共同施用”來(lái)說(shuō)，其意指在施用一種或多種額外療法的同時(shí)，就在此舉之前或就在此舉之后施用本文所述的組合物。舉例來(lái)說(shuō)，可向患者單獨(dú)施用COH29，或可向患者共同施用COH29。共同施用意圖包括個(gè)別地或以組合形式(超過(guò)一種化合物或藥劑)同時(shí)或依序施用化合物。因此，當(dāng)需要時(shí)，也可使制劑與其它活性物質(zhì)組合(例如以降低代謝降解)。

本文公開(kāi)的組合物可配制成涂敷棒、溶液劑、混懸劑、乳液、凝膠劑、乳膏劑、軟膏劑、糊劑、膠狀物、涂劑、粉劑和氣霧劑，通過(guò)經(jīng)表面途徑來(lái)經(jīng)皮遞送?？诜苿┌ㄟm于由患者攝取的片劑、丸劑、粉劑、糖衣片、膠囊、液體、糖錠、扁囊劑、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸液等。固體形式制劑包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑和可分散顆粒劑。液體形式制劑包括溶液、混懸液和乳液，例如水溶液或水/丙二醇溶液。本發(fā)明的組合物可另外包括用以提供持續(xù)釋放和/或舒適性的組分。所述組分包括高分子量陰離子擬粘液聚合物、膠凝性多糖和精細(xì)分散的藥物載體基質(zhì)。這些組分更加詳細(xì)討論于美國(guó)專利號(hào)4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中。這些專利的整個(gè)內(nèi)容出于所有目的以引用的方式整體并入本文。本文公開(kāi)的組合物也可以微球體形式遞送以達(dá)成在體內(nèi)緩慢釋放。舉例來(lái)說(shuō)，微球體可通過(guò)皮內(nèi)注射在皮下緩慢釋放的含有藥物的微球體(參見(jiàn)Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995)；以可生物降解和可注射的凝膠制劑形式(參見(jiàn)例如Gao Pharm.Res.12:857-863,1995)；或以用于口服施用的微球體形式(參見(jiàn)例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)來(lái)施用。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的制劑可通過(guò)使用與細(xì)胞膜融合或被胞吞的脂質(zhì)體來(lái)遞送，即通過(guò)采用連接于脂質(zhì)體的結(jié)合細(xì)胞的表面膜蛋白受體，從而導(dǎo)致胞吞作用的受體配體。通過(guò)使用脂質(zhì)體，特別是當(dāng)脂質(zhì)體表面攜帶對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞具有特異性，或另外優(yōu)先針對(duì)特定器官的受體配體時(shí)，可使本發(fā)明的組合物的遞送在體內(nèi)集中至靶標(biāo)細(xì)胞中。(參見(jiàn)例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。組合物也可以納米粒子形式遞送。

“有效量”是相對(duì)于在不存在化合物下，所述化合物的足以實(shí)現(xiàn)陳述的目的的量(例如實(shí)現(xiàn)它被施用所用于達(dá)成的效應(yīng)，治療疾病，降低酶活性，增加酶活性，減弱信號(hào)傳導(dǎo)路徑，或減輕疾病或病狀的一種或多種癥狀)?！爸委熡行Я俊钡囊粚?shí)例是足以促進(jìn)對(duì)疾病的一種或多種癥狀的治療、預(yù)防或減輕的量，其也可被稱為“治療有效量”?！皽p輕”一種或多種癥狀(以及這個(gè)短語(yǔ)的語(yǔ)法等效形式)意指降低所述癥狀的嚴(yán)重性或發(fā)生次數(shù)，或消除所述癥狀。精確量將取決于治療目的，并且將可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知技術(shù)確定(參見(jiàn)例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro編,Lippincott,Williams&Wilkins)。

向哺乳動(dòng)物施用的劑量和頻率(單次或多次劑量)可視多種因素而變化，例如所述哺乳動(dòng)物是否罹患另一疾病以及它的施用途徑；接受者的身材、年齡、性別、健康狀況、體重、身體質(zhì)量指數(shù)和膳食；所治療的疾病的癥狀的性質(zhì)和程度、并行治療的種類、由所治療的疾病所致的并發(fā)癥或其它健康相關(guān)問(wèn)題。其它治療方案或藥劑可與申請(qǐng)人的本發(fā)明的方法和化合物聯(lián)合使用。調(diào)整和操作確立的劑量(例如頻率和持續(xù)時(shí)間)完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力。

本文所述的治療有效量可最初由細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定加以確定。靶標(biāo)濃度將為活性化合物的能夠?qū)崿F(xiàn)本文所述的方法的那些濃度，如使用本文所述或本領(lǐng)域中已知的方法所測(cè)量。

如本領(lǐng)域中所熟知，用于人中的治療有效量也可由動(dòng)物模型確定。舉例來(lái)說(shuō)，可配制用于人的劑量以實(shí)現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物中有效的濃度。如上所述，可通過(guò)監(jiān)測(cè)化合物有效性以及向上或向下調(diào)整劑量來(lái)調(diào)整人中的劑量?；谏鲜龇椒ê推渌椒ㄕ{(diào)整劑量以在人中實(shí)現(xiàn)最大功效完全屬于普通熟練技術(shù)人員的能力。

劑量可視患者的需求和所采用的化合物而變化。在本發(fā)明的情形下，向患者施用的劑量應(yīng)足以隨時(shí)間在患者中實(shí)現(xiàn)有益治療響應(yīng)。劑量的大小也將由任何不利副作用的存在性、性質(zhì)和程度決定。確定適于特定情況的劑量屬于從業(yè)者的技能。通常，治療以小于化合物的最優(yōu)劑量的較小劑量啟始。此后，以小增量增加劑量直至達(dá)到在各情況下的最優(yōu)效應(yīng)。劑量和間隔可個(gè)別地加以調(diào)整以提供施用化合物的對(duì)所治療的特定臨床適應(yīng)癥有效的水平。這將提供與個(gè)體的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性相稱的治療方案。

如本文所定義，關(guān)于蛋白質(zhì)-抑制劑相互作用的術(shù)語(yǔ)“抑制(inhibition/inhibit/inhibiting)”等意指相對(duì)于在不存在抑制劑下蛋白質(zhì)的活性或功能，負(fù)性影響(例如降低)蛋白質(zhì)的活性或功能。當(dāng)關(guān)于抑制某一基因使用時(shí)，“抑制”意指相對(duì)于在不存在抑制劑下所述基因的活性或表達(dá)，負(fù)性影響(例如降低)所述基因的活性或表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，抑制是指減輕疾病或疾病的癥狀。在一些實(shí)施方案中，抑制是指降低特定蛋白質(zhì)或核酸靶標(biāo)的活性。因此，抑制至少部分地包括部分或完全阻斷刺激，降低、阻止或延遲活化，或使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或酶活性或蛋白質(zhì)的量失活、脫敏或下調(diào)。

術(shù)語(yǔ)“協(xié)同”、“協(xié)同作用”、“協(xié)同的”、“組合協(xié)同量”和“協(xié)同治療作用”在本文中可互換使用，并且是指組合施用的化合物的測(cè)量作用，其中所述測(cè)量作用大于單獨(dú)施用的各化合物的個(gè)別作用的總和。

方法

在第一方面的是一種治療有需要的受試者的癌癥的方法。所述方法包括向受試者施用有效量的COH29。受試者是如本文闡述的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者。因此，在實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者。受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個(gè)。因此，受試者可為BRCA1缺陷性受試者以及PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個(gè)(即癌癥具有BRCA1缺陷和對(duì)PARP1抑制劑或DNA損害性抗癌劑中的至少一個(gè)的抗性)。

在實(shí)施方案中，受試者是乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、結(jié)腸癌受試者、肝癌受試者、腎癌受試者、肺癌受試者、非小細(xì)胞肺癌受試者、腦癌受試者、前列腺癌受試者、胰腺癌受試者、黑素瘤受試者、白血病受試者或肉瘤受試者。

受試者可為乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。受試者可為乳腺癌受試者。受試者可為卵巢癌受試者。受試者可為結(jié)腸癌受試者。受試者可為肝癌受試者。受試者可為腎癌受試者。受試者可為肺癌受試者或非小細(xì)胞肺癌受試者。受試者可為腦癌受試者。受試者可為前列腺癌受試者。受試者可為胰腺癌受試者。受試者可為黑素瘤受試者。受試者可為白血病受試者。受試者可為肉瘤受試者。

癌癥受試者(例如乳腺、卵巢、肺、前列腺或胰腺癌受試者)也可為BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個(gè)。因此，在實(shí)施方案中，癌癥受試者是BRCA1缺陷性受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是PARP1抑制劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

因此，在實(shí)施方案中，受試者是患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者。BRCA1缺陷性受試者可患有乳腺癌。BRCA1缺陷性受試者可患有卵巢癌。

在實(shí)施方案中，受試者是患有乳腺癌或卵巢癌的PARP1抑制劑抗性受試者。PARP1抑制劑抗性受試者可患有乳腺癌。PARP1抑制劑抗性受試者可患有卵巢癌。

在實(shí)施方案中，受試者是患有特征在于對(duì)至少一種包括但不限于順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、亞德里亞霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、VP16、CPT11或喜樹(shù)堿的DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，受試者是患有乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、腦癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者。

在實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實(shí)施方案中，受試者是PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可為患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

在實(shí)施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者和BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個(gè)。因此，在實(shí)施方案中，乳腺癌受試者也是BRCA1缺陷性受試者。在實(shí)施方案中，乳腺癌受試者也是PARP1抑制劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，乳腺癌受試者也是DNA損害性抗癌劑抗性受試者。乳腺癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對(duì)PARP1抑制劑具有抗性的癌癥)。乳腺癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對(duì)DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。乳腺癌受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有對(duì)PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。乳腺癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如乳腺癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對(duì)PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。

在實(shí)施方案中，癌癥受試者是卵巢癌受試者和BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者中的至少一個(gè)。因此，在實(shí)施方案中，卵巢癌受試者也是BRCA1缺陷性受試者。在實(shí)施方案中，卵巢癌受試者也是PARP1抑制劑抗性受試者。在實(shí)施方案中，卵巢癌受試者也是DNA損害性抗癌劑抗性受試者。卵巢癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和PARP1抑制劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對(duì)PARP1抑制劑具有抗性的癌癥)。卵巢癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對(duì)DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。卵巢癌受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有對(duì)PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。卵巢癌受試者可為BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者(例如卵巢癌受試者患有具有BRCA1缺陷，并且對(duì)PARP1抑制劑和DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥)。

在實(shí)施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、結(jié)腸癌受試者、肝癌受試者、腎癌受試者、肺癌受試者、非小細(xì)胞肺癌受試者、腦癌受試者、前列腺癌受試者、胰腺癌受試者、黑素瘤受試者、白血病受試者或肉瘤受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是卵巢癌受試者。

受試者可患有如本文所述的癌癥，其中所述癌癥展現(xiàn)BRCA1缺陷、對(duì)PARP1抑制劑的抗性或?qū)NA損害性抗癌劑的抗性中的至少一個(gè)。癌癥可為乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、腦癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤。癌癥可為一種上文提及的具有BRCA1缺陷的癌癥。癌癥可為一種上文提及的對(duì)PARP1抑制劑具有抗性的癌癥。癌癥可為一種上文提及的對(duì)DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥。

在實(shí)施方案中，癌癥具有BRCA1缺陷以及對(duì)PARP1抑制劑的抗性或?qū)NA損害性抗癌劑的抗性中的至少一個(gè)。在實(shí)施方案中，癌癥對(duì)PARP1抑制劑具有抗性，并且具有BRCA1缺陷或?qū)NA損害性抗癌劑的抗性中的至少一個(gè)。在實(shí)施方案中，癌癥對(duì)DNA損害性抗癌劑具有抗性，并且具有BRCA1缺陷或?qū)ARP1抑制劑的抗性中的至少一個(gè)。

癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。癌癥可為乳腺癌。癌癥可為卵巢癌。癌癥可為結(jié)腸癌。癌癥可為肝癌。癌癥可為腎癌。癌癥可為肺癌或非小細(xì)胞肺癌。癌癥可為腦癌。癌癥可為前列腺癌。癌癥可為胰腺癌。癌癥可為黑素瘤。癌癥可為白血病。癌癥可為肉瘤。

在實(shí)施方案中，施用COH29使癌癥受試者(例如BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者)中特定蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低。抑制可由COH-29結(jié)合靶標(biāo)蛋白質(zhì)所致，此可通過(guò)蛋白酶體募集來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)水平變化轉(zhuǎn)而可調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)樣式。在實(shí)施方案中，COH29抑制受試者中PARP1、Rad51或BRCA1的活性或表達(dá)?？蛇M(jìn)行分析(例如微陣列分析)以鑒定由于COH29治療而差異性表達(dá)的基因。因此，施用COH29可降低受試者中BRCA1蛋白活性或表達(dá)。施用COH29可降低受試者中PARP1蛋白活性或表達(dá)。施用COH29可降低受試者中Rad51蛋白活性或表達(dá)。受試者可為如本文所述的癌癥受試者，包括其實(shí)施方案。在實(shí)施方案中，癌癥受試者是乳腺癌受試者、卵巢癌受試者、結(jié)腸癌受試者、肝癌受試者、腎癌受試者、肺癌受試者、非小細(xì)胞肺癌受試者、腦癌受試者、前列腺癌受試者或胰腺癌受試者。癌癥受試者可為乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

在實(shí)施方案中，可將COH29治療的BRCA1缺陷性受試者的RNA表達(dá)譜與COH29治療的BRCA1+(例如完整BRCA1)癌癥受試者的RNA表達(dá)譜進(jìn)行比較。因此，在實(shí)施方案中，COH29在BRCA1缺陷性受試者中比在BRCA1+癌癥受試者中在更大程度上抑制蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)。因此，在實(shí)施方案中，COH29在BRCA1缺陷性受試者中比在BRCA1+癌癥受試者中在更大程度上抑制PARP1。COH29可在BRCA1缺陷性受試者中比在BRCA1+癌癥受試者中在更大程度上抑制Rad51。在實(shí)施方案中，COH29通過(guò)合成致死性(synthetic lethality)來(lái)治療BRCA1缺陷性受試者。BRCA1缺陷性受試者如本文所述，包括其實(shí)施方案。在實(shí)施方案中，BRCA1缺陷性受試者也是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

在實(shí)施方案中，施用COH29使癌(例如是BRCA1缺陷性或?qū)ARP1抑制劑或DNA損害性抗癌劑中的任一者或兩者具有抗性的癌)中特定蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低。抑制可由COH-29結(jié)合靶標(biāo)蛋白質(zhì)所致，此可通過(guò)蛋白酶體募集來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)水平變化轉(zhuǎn)而可調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)樣式。在實(shí)施方案中，COH29抑制癌中PARP1、Rad51或BRCA1的活性或表達(dá)?？蛇M(jìn)行分析(例如微陣列分析)以鑒定由于COH29治療而差異性表達(dá)的基因。因此，施用COH29可降低癌中BRCA1蛋白活性或表達(dá)。施用COH29可降低癌中PARP1蛋白活性或表達(dá)。施用COH29可降低癌中Rad51蛋白活性或表達(dá)。癌癥可為如本文所述的癌癥，包括其實(shí)施方案。在實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、腦癌、前列腺癌或胰腺癌。癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。

在實(shí)施方案中，可將用COH29治療的BRCA1缺陷性癌的RNA表達(dá)譜與用COH29治療的BRCA1+癌的RNA表達(dá)譜進(jìn)行比較。因此，在實(shí)施方案中，COH29在BRCA1缺陷性癌癥中比在BRCA1+癌癥中在更大程度上抑制蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)。COH29可在BRCA1缺陷性癌癥中比在BRCA1+癌癥中在更大程度上抑制PARP1。COH29可在BRCA1缺陷性癌癥中比在BRCA1+癌癥中在更大程度上抑制Rad51。在實(shí)施方案中，COH29通過(guò)合成致死性來(lái)治療BRCA1缺陷性癌癥。癌癥可為如本文所述的癌癥，包括其實(shí)施方案。癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。

COH29可通過(guò)合成致死性來(lái)展現(xiàn)對(duì)BRCA1缺陷性人癌癥的特異性。因此，在實(shí)施方案中，COH29治療BRCA1缺陷性受試者，包括其實(shí)施方案。在實(shí)施方案中，合成致死性由抑制BRCA1缺陷性癌中的第二蛋白質(zhì)引起。第二蛋白質(zhì)可為PARP1?？蓪⒕哂蠦RCA1缺陷的癌的表達(dá)譜與BRCA1+癌細(xì)胞進(jìn)行比較。在實(shí)施方案中，COH29使BRCA1缺陷性癌中的PARP1活性降低約10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，在實(shí)施方案中，相比于BRCA1+癌細(xì)胞中，COH29以更大功效抑制BRCA1缺陷性癌細(xì)胞中的PARP1活性。在實(shí)施方案中，COH29使BRCA1缺陷性癌中的PARP1表達(dá)降低約5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。因此，在實(shí)施方案中，相比于BRCA1+癌細(xì)胞中，COH29以更大功效抑制BRCA1缺陷性癌細(xì)胞中的PARP1表達(dá)。

施用COH29可抑制受試者中的DNA修復(fù)。施用COH29可抑制堿基切除修復(fù)(BER)(例如通過(guò)例如使用特定糖苷酶移除受損害的堿基以修正由于氧化、烷基化、脫氨和脫嘌呤/脫嘧啶損害而產(chǎn)生的堿基損傷來(lái)修復(fù)受損害的DNA)。施用COH29可抑制核苷酸切除修復(fù)(NER)(例如通過(guò)移除短單鏈DNA區(qū)段來(lái)修正產(chǎn)生龐大DNA加合物的DNA損害，諸如由UV暴露所致的損害)。施用COH29可抑制受試者中的雙鏈DNA斷裂修復(fù)(例如使用非同源性末端接合(NHEJ路徑)、微同源介導(dǎo)的末端接合(MMEJ)路徑，或通過(guò)同源性重組(HR))。施用COH29可抑制受試者中的堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)或雙鏈DNA斷裂修復(fù)。

在實(shí)施方案中，可通過(guò)檢測(cè)例如像ATM、foxo3、γ-Η2ΑΧ、p53或Rad51的蛋白質(zhì)的經(jīng)調(diào)節(jié)活性或表達(dá)來(lái)評(píng)估COH29的基因毒性概況以及因此它活化DNA損害檢查點(diǎn)和誘導(dǎo)DNA損害的能力。

調(diào)節(jié)可為蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)增加或蛋白質(zhì)的活性或表達(dá)降低。因此，在實(shí)施方案中，施用COH29使受試者中的γ-Η2ΑΧ活性或表達(dá)增加。在實(shí)施方案中，施用COH29使受試者中的γ-H2AX活性或表達(dá)增加。施用COH29可使受試者中的γ-H2AX活性或表達(dá)增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。γ-Η2ΑΧ活性或表達(dá)增加可指示對(duì)DNA損害檢查點(diǎn)的活化和對(duì)DNA損害的誘導(dǎo)。在實(shí)施方案中，施用COH29使如本文所述的癌(包括其實(shí)施方案)中的γ-Η2ΑΧ活性或表達(dá)增加。在實(shí)施方案中，施用COH29使如本文所述的癌(包括其實(shí)施方案)中的γ-Η2ΑΧ活性或表達(dá)增加。在實(shí)施方案中，施用COH29使三重陰性乳腺癌中的γ-Η2ΑΧ活性或表達(dá)增加。因此，在實(shí)施方案中，施用有效量的COH29治療三重陰性乳腺癌。

COH29可抑制DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)。DSB可通過(guò)例如同源性重組(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)路徑來(lái)修復(fù)。在實(shí)施方案中，COH29抑制HR。在實(shí)施方案中，COH29抑制NHEJ路徑?？赏ㄟ^(guò)抑制HR修復(fù)中涉及的蛋白質(zhì)(例如像BRCA1和Rad51)的蛋白質(zhì)水平來(lái)延長(zhǎng)DNA損害響應(yīng)。在實(shí)施方案中，施用COH29使受試者中或癌中的Rad51活性或表達(dá)降低。在實(shí)施方案中，施用COH29使受試者中或癌中的BRCA1活性或表達(dá)降低。在實(shí)施方案中，受試者中或癌中的BRCA1或Rad51的表達(dá)得以降低。在實(shí)施方案中，受試者中或癌中的BRCA1和Rad51的表達(dá)得以降低。

在另一方面的是一種治療有需要的受試者的癌癥的方法。所述方法包括以組合協(xié)同量施用COH29和DNA損害性抗癌劑。在實(shí)施方案中，受試者如本文所述，包括其實(shí)施方案。因此，在某些實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者或PARP1抑制劑抗性受試者。受試者可為BRCA1缺陷性受試者。受試者可為PARP1抑制劑抗性受試者。

癌癥可為乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、腦癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤。癌癥可為乳腺癌或卵巢癌。因此，在實(shí)施方案中，受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。受試者可為乳腺癌受試者。受試者可為卵巢癌受試者。受試者也可展現(xiàn)一種或多種如本文所述的表型或基因型，包括其實(shí)施方案(例如乳腺癌受試者也可為BRCA1缺陷性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者)。在實(shí)施方案中，受試者是BRCA1缺陷性受試者和DNA損害性抗癌劑抗性受試者。受試者可患有對(duì)DNA損害性抗癌劑具有抗性的癌癥。本文方法可通過(guò)共同施用有效量的COH29來(lái)提供對(duì)癌癥的治療，所述癌癥對(duì)至少一種DNA損害性抗癌劑具有抗性。

在實(shí)施方案中，DNA損害性抗癌劑是化學(xué)治療性DNA損害劑。DNA損害性抗癌劑可為烷基化劑。DNA損害性抗癌劑可為如本文所述的抗代謝劑，包括其實(shí)施方案。DNA損害性抗癌劑可為蒽環(huán)霉素。DNA損害性抗癌劑可為基于鉑的藥劑。DNA損害性抗癌劑可為紫杉烷。DNA損害性抗癌劑可為激酶抑制劑。DNA損害性抗癌劑可為組蛋白脫乙酰基酶抑制劑。DNA損害性抗癌劑可為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。DNA損害性抗癌劑可為核苷酸類似物。在實(shí)施方案中，在DNA損害性癌癥藥劑和COH29存在下，對(duì)癌癥的抑制得以協(xié)同增加。

在實(shí)施方案中，治療方法包括以合成致死性抑制至少兩種蛋白質(zhì)。至少一種蛋白質(zhì)可為BRCA1。至少一種蛋白質(zhì)可為Rad51。至少一種蛋白質(zhì)可為PARP1。在實(shí)施方案中，對(duì)PARP1的抑制可在BRCA1缺陷性受試者中。在實(shí)施方案中，在DNA損害性抗癌劑和COH29存在下，對(duì)PARP1的抑制得以協(xié)同增加。DNA損害性抗癌劑可為吉西他濱、γ輻照或順鉑，包括它的如本文闡述的衍生物。

DNA損害性抗癌劑可為順鉑，包括它的如本文所述的衍生物。在實(shí)施方案中，施用COH29使順鉑的細(xì)胞毒性增加至大于順鉑在單獨(dú)施用時(shí)的細(xì)胞毒性的水平(例如以組合協(xié)同量一起施用COH29和順鉑)。順鉑是一種廣泛使用的化學(xué)治療劑，其抗癌活性主要?dú)w因于靶標(biāo)細(xì)胞中的DNA交聯(lián)。因此，在實(shí)施方案中，共同施用COH29和順鉑導(dǎo)致的癌細(xì)胞可存活性降低大于在單獨(dú)施用COH29或順鉑時(shí)的癌細(xì)胞可存活性降低(例如以組合協(xié)同量一起施用COH29和順鉑)。

DNA損害性抗癌劑可為吉西他濱。在實(shí)施方案中，共同施用COH29和吉西他濱導(dǎo)致的癌細(xì)胞可存活性降低大于在單獨(dú)施用COH29或吉西他濱時(shí)的癌細(xì)胞可存活性降低(例如以組合協(xié)同量一起施用COH29和吉西他濱)。DNA損害性抗癌劑可為γ輻照。在實(shí)施方案中，施用COH29以及用γ輻照治療導(dǎo)致的癌細(xì)胞可存活性降低大于在單獨(dú)施用COH29或γ輻照時(shí)的癌細(xì)胞可存活性降低。COH29可在用γ輻照治療之前、期間或之后施用。

實(shí)施例

DNA損害性藥物的功效受細(xì)胞DNA修復(fù)能力高度影響和調(diào)節(jié)(9)。實(shí)際上，小分子DNA修復(fù)抑制劑已在臨床前研究中與常規(guī)化學(xué)療法藥物組合(18)，從而指示DNA修復(fù)機(jī)構(gòu)是新型癌癥治療的有前途靶標(biāo)。此外，PARP抑制劑已在臨床試驗(yàn)中與鉑化學(xué)療法組合(19,20)。與這些報(bào)道一致，尤其發(fā)現(xiàn)COH29增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，尤其在BRCA1缺乏性細(xì)胞中。這表明COH29合成致死性依賴于HR缺乏性細(xì)胞中的NER或BER。因此，在不受任何特定理論束縛下，我們提出COH29干擾若干DNA修復(fù)路徑(NER、BER和HR)會(huì)促進(jìn)在存在或不存在順鉑下在BRCA1缺乏性細(xì)胞中觀察的細(xì)胞毒性。因此，COH29可作為有效力的DNA修復(fù)抑制劑加以利用。

所有細(xì)胞系都從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,VA,USA)獲得。將細(xì)胞在37℃下于5％CO₂中維持在具有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺以及每毫升培養(yǎng)基100U青霉素和100μg鏈霉素(Sigma)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Mediatech)中。為分離HCC1937+BRCA1細(xì)胞，用表達(dá)全長(zhǎng)BRCA1cDNA的pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染親本HCC1937細(xì)胞。選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子克隆，并且用于藥物敏感性測(cè)定。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，使用6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemical,Monza,Italy)使在30-40％匯合下的細(xì)胞與2mg質(zhì)粒DNA一起孵育過(guò)夜。接著在嘌呤霉素(1μg/ml)(Invitrogen Life Technologies,La Jolla,CA,USA)中選擇細(xì)胞。在20至30天之后，擴(kuò)增并篩選由HCC1937轉(zhuǎn)染獲得的有活力的嘌呤霉素抗性菌落。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)嘌呤霉素，并且保留生長(zhǎng)潛力的克隆的BRCA1表達(dá)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析，我們?cè)u(píng)估BRCA1表達(dá)在嘌呤霉素抗性cDNA/轉(zhuǎn)染子細(xì)胞中的恢復(fù)。這些經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示BRCA1蛋白表達(dá)增加，從而表明蛋白質(zhì)表達(dá)的有效恢復(fù)。

在City of Hope合成和純化COH29。γ-Η2AX購(gòu)自cell signaling(Danvers,MA,USA)。Rad51購(gòu)自Novus(Littleton,CO,USA)。β-肌動(dòng)蛋白來(lái)自Millipore(Billerica,MA,USA)。對(duì)FOXO3(H-144和N-16，1:1000)、磷酸H2AX絲氨酸-139(γ-Η2ΑΧ，1:1,000)、磷酸p53絲氨酸-15(p53-pS15，1:1,000)、Rad51(1:1000)、β-微管蛋白(1:1000)、核纖層蛋白A/C(1:2000稀釋度)、PARP具有特異性的抗體以及抗小鼠和抗兔IgG從Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)獲得。針對(duì)FOXO3(1:1,000)和磷酸ATM絲氨酸-1981(ATM-pS1981，1:1,000稀釋度)的Ab分別從Epitomics(Burlingame,CA)和Millipore(Billerica,MA)獲得。針對(duì)p53-pS15的Ab購(gòu)自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。抗p27Kip1Ab購(gòu)自BD PharMingen(San Diego,CA)。Alexa 488(綠色)和Alexa 594(紅色)綴合的二級(jí)Ab從Molecular Probes(Eugene,OR)獲得?？雇肐gG(完整分子)-FITC抗體購(gòu)自Sigma(St.Louis,MO,USA)。RHODAMINE RED-X^TM山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。

如先前所述進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)(21,22)。具體來(lái)說(shuō)，使A549細(xì)胞在玻璃蓋片上生長(zhǎng)。在用COH29(1或10μΜ)處理24或48小時(shí)之后，用4％多聚甲醛固定細(xì)胞10分鐘，并且用TRITON^TM X-100(0.5％)進(jìn)行可滲透化處理。蓋片用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并且用含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻斷，與對(duì)FOXO3或ATM-pS1981或γ-Η2ΑΧ或p53-pS15具有特異性的Ab(1:50-1:200稀釋度)一起孵育，隨后與Alexa 488綴合的抗兔或抗小鼠(1:200)、Alexa 594綴合的抗山羊(1:100)二級(jí)Ab(Molecular Probes)一起孵育。使細(xì)胞與4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)一起孵育以使核染色。觀察特異性染色，并且用Leica SP2AOBS共焦激光掃描顯微鏡捕集圖像。為測(cè)量灶陽(yáng)性細(xì)胞，我們使用約300個(gè)通過(guò)共焦顯微術(shù)隨機(jī)捕集的細(xì)胞。由含有至少5個(gè)灶的細(xì)胞計(jì)算視為灶陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。呈現(xiàn)的各誤差棒是標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。

對(duì)于亞細(xì)胞分級(jí)分離，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，并且用冷PBS溶液洗滌兩次。在1,200g下離心5分鐘之后，在冰上于補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑(各自5μg/ml的抑肽素(pepstatin)、亮肽素(leupeptin)和抑蛋白酶肽(aprotinin))和磷酸酶抑制劑，含有0.2％NONIDET^TM P-40(NP-40)的緩沖液(50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA)中孵育細(xì)胞5分鐘。在1,000g下離心5分鐘之后，收集上清液(即細(xì)胞質(zhì)部分)，并且用相同緩沖液洗滌集結(jié)塊兩次。在冰上用含有0.5％NP-40的分級(jí)分離緩沖液提取洗滌樣品達(dá)40分鐘以獲得核部分。所有樣品都加以超聲處理，并且通過(guò)在16,000g下離心15分鐘來(lái)澄清化。所有部分的蛋白質(zhì)濃度都用Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)加以測(cè)定。如先前所述進(jìn)行免疫印跡(21,22)。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，使等量的煮沸蛋白質(zhì)樣品經(jīng)受SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，并且轉(zhuǎn)移于硝化纖維素膜(Bio-Rad Laboratories)上。將膜在含3％BSA的含有0.05％吐溫20(Tween 20)的Tris緩沖鹽水(TBST)中阻斷1小時(shí)，并且與在含有1％BSA的TBST中稀釋的初級(jí)抗體(1:500或1:1000)一起孵育1小時(shí)。在用TBST洗滌2次之后，使膜與辣根過(guò)氧化物酶綴合的二級(jí)Ab(1:3000稀釋度)一起在室溫下孵育1小時(shí)。用West-Q化學(xué)發(fā)光試劑盒(GenDEPOT,Barker,TX)觀察膠片上的免疫印跡。

通過(guò)與MTT一起孵育以及用微板讀取器在560nm的波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)由活細(xì)胞形成的MTT甲臜來(lái)進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性測(cè)定；使用下式確定存活率：

(A_測(cè)試–A_空白)/(A_對(duì)照–A_空白)x 100％。使用半自動(dòng)基于熒光的數(shù)字成像顯微術(shù)系統(tǒng)(DIMSCAN)在96孔板中測(cè)定細(xì)胞毒性。DIMSCAN使用數(shù)字成像顯微術(shù)來(lái)定量選擇性積累FDA(二乙酸熒光素；Alfa Aesar,Ward Hill,MA)的活細(xì)胞。DIMSCAN能夠在通過(guò)數(shù)字定限和曙紅Y(eosin Y)(Mallinckrodt Baker,Center Valley,PA)淬滅來(lái)消除本底熒光之后，通過(guò)定量每孔總熒光(其與活細(xì)胞的數(shù)目成比例)來(lái)歷經(jīng)4對(duì)數(shù)動(dòng)態(tài)范圍測(cè)量細(xì)胞毒性。視細(xì)胞系生長(zhǎng)速率而定，將細(xì)胞于100μL完全培養(yǎng)基中在每孔2,000至5,000個(gè)細(xì)胞下接種至96孔板中。在過(guò)夜孵育之后，將測(cè)試化合物于50μL培養(yǎng)基中在各種濃度下添加至各孔中。在37℃下與藥物一起孵育96小時(shí)之后，添加FDA(最終濃度：10mg/mL)和曙紅Y[最終濃度：0.1％(w/v)]至各孔中，并且在37℃下再孵育細(xì)胞20分鐘。接著使用DIMSCAN測(cè)量每孔總熒光，并且將結(jié)果表示為處理孔中的熒光與未處理孔中的熒光的比率(存活分?jǐn)?shù))。

原位腫瘤模型。根據(jù)由City of Hope的IACUC核準(zhǔn)的方案進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)。因?yàn)镠CC1937和HCC1937+BRCA1細(xì)胞形成緩慢生長(zhǎng)腫瘤，所以使用MATRIGEL^TM(Becton-Dickinson Biosciences)將它們進(jìn)行植入。為產(chǎn)生腫瘤，將4x 10⁶個(gè)細(xì)胞于200μL含有50％MATRIGEL^TM的無(wú)血清培養(yǎng)基中注射至一對(duì)8周齡雌性NSG小鼠的腹股溝區(qū)域周圍的乳腺脂肪墊中。一旦初始腫瘤達(dá)到直徑13mm，即將它們解剖出，切碎成3mm塊段，并且植入實(shí)驗(yàn)小鼠的乳腺脂肪墊的腹股溝區(qū)域中。歷經(jīng)28天時(shí)期測(cè)量腫瘤，并且對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)，史都登t檢驗(yàn)(student t-test)用于確定用含400mg/kg COH29的30％聚乙二醇硬脂酸酯(solutol)每日管飼與相應(yīng)媒介物對(duì)照之間的統(tǒng)計(jì)顯著性。小于0.05的p值(雙側(cè))被視為指示統(tǒng)計(jì)顯著性。

產(chǎn)生EJ2細(xì)胞以通過(guò)監(jiān)測(cè)GFP的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)估Alt-NHEJ，并且EJ5細(xì)胞用于如先前所述測(cè)定NJEJ。(23)將細(xì)胞接種至6孔板中，并且用COH29或順鉑在不同濃度下處理24小時(shí)。接著用胰蛋白酶處理細(xì)胞，洗滌，并且通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)分析。

如先前所述進(jìn)行抗人BRCA1siRNA表達(dá)性質(zhì)粒的構(gòu)建(24)。因此，利用先前公布的抗人BRCA1siRNA序列(5’-UCACAGUGUCCU UUAUGUA-3’[SEQ ID NO:1]和5’-UACAUAAAGGACACUGUGA-3’[SEQ ID NO:2])。在各情況下，將編碼siRNA的退火寡核苷酸雙鏈體亞克隆至表達(dá)載體psiRNA-hHlzeo(InvivoGen,San Diego,CA,USA)中以在RNA聚合酶III依賴性H1RNA啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)電穿孔，用指示的質(zhì)粒在等摩爾濃度下轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

使用微型試劑盒(Qiagen Inc.)分離總RNA。以DNA酶I處理來(lái)移除基因組DNA污染。通過(guò)1％瓊脂糖凝膠(SeaKem,FMC,Rockland,ME,USA)電泳或用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)來(lái)考查分離的RNA的完整性。通過(guò)紫外分光光度測(cè)定法來(lái)確定RNA濃度(A₂₆₀/A₂₈₀比率)。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和作為引物的隨機(jī)六聚體(Invitrogen)，從總RNA制備cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR，使用cDNA樣品來(lái)定量基因表達(dá)。針對(duì)BRCA1的引物購(gòu)自APPLIEDFoster City,CA,USA。根據(jù)APPLIED指導(dǎo)方針(PRIMER軟件；APPLIED)設(shè)計(jì)針對(duì)18S和β-肌動(dòng)蛋白的額外引物和探針以符合實(shí)時(shí)PCR要求。引物的序列是

AGGAATTGCGGGAGGAAAATGGGT(SEQ ID NO:3)和

GCCCCCTGAAGATCTTTCTGTCCT(SEQ ID NO:4)。

根據(jù)制造商方案，使用PARP1化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒(BPS Bioscience,San Diego)測(cè)定PARP1活性。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，使用測(cè)試抑制劑、陽(yáng)性對(duì)照、底物對(duì)照和空白反應(yīng)，在25℃下用活化的DNA在PARP測(cè)定緩沖液中進(jìn)行核糖基化反應(yīng)1小時(shí)。通過(guò)抗生蛋白鏈菌素-HRP來(lái)檢測(cè)，其中在光度計(jì)中讀取化學(xué)發(fā)光底物A和B。

斑馬魚(yú)(Zebrafish/Danio rerio)從臺(tái)北醫(yī)學(xué)大學(xué)的斑馬魚(yú)核心研究室(zebrafish Core facility of Taipei Medical University)獲得，并且按照14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)維持在28℃下。在28℃下孵育胚胎，并且如所述確定不同發(fā)育階段(25)。在20hpf時(shí)用不同濃度的HU(0、5、10、20、50mM)或COH29(0、10、20、50、100μΜ)處理野生型胚胎以評(píng)估誘變效應(yīng)。每個(gè)孔條件處理15個(gè)胚胎。在2、3、4、5和6dpf時(shí)觀察處理的胚胎。在6dpf時(shí)，測(cè)定展現(xiàn)發(fā)育異常的魚(yú)的百分比和存活率。使用Olympus LX70-FLA倒置熒光顯微鏡觀察胚胎。使用SPOT數(shù)字照相機(jī)系統(tǒng)(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,Michigan,USA)獲取圖像，并且用ImageJ軟件集合(26)。

使用GENOMICS SUITE^TM(6.6版；Partek,Inc.)對(duì)微陣列樣品進(jìn)行RMA標(biāo)準(zhǔn)化(27)，并且如果基因顯示至少1.2倍變化和<0.05的假發(fā)現(xiàn)率(FDR)，那么它們被確定為差異性表達(dá)。使用Benjamini和Hochberg(28)的方法，由關(guān)于線性對(duì)比p值的ANOVA分布計(jì)算FDR值。在GENOMICS SUITE^TM內(nèi)進(jìn)行基因本體論(GO)(29)富集分析，并且以費(fèi)雪精確檢驗(yàn)(Fisher Exact test)p值<0.05將GO種類確定為顯著。

基于Ivshina等人研究，使用U133A&B(GSE4922)，由對(duì)289個(gè)石蠟包埋的乳腺癌腫瘤樣品的基因表達(dá)剖析來(lái)確定RRM2-PARP1關(guān)聯(lián)分析。(30)使用Bioconductor R程序包(64位，v 3.0.2)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(31)。使用斯皮爾曼氏秩關(guān)聯(lián)(Spearman's rank correlation)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。P<0.05和r>0.5的水平被視為統(tǒng)計(jì)顯著。

如先前所公布(26)，在修改下進(jìn)行含有SV40復(fù)制起點(diǎn)的pSVO+質(zhì)粒的體外復(fù)制。最終25μL反應(yīng)體積含有30mM HEPES(pH＝7.2)、7mM MgCl₂、0.5mM DTT、5μCi[α-³²P]-dCTP、1μΜdCTP、各自100μΜdTTP、dCTP和dGTP、各自200μΜCTP、UTP和GTP、4mM ATP、40mM磷酸肌酸、50μg肌酸磷酸激酶、50ng pSVO+、0.1-1.0μg T Ag(通過(guò)滴定測(cè)定確定的最優(yōu)濃度)和最優(yōu)量的HeLa提取物(通過(guò)滴定測(cè)定所確定)(Chimerx；Milwaukee,WI)。為定量DNA復(fù)制抑制，在開(kāi)始反應(yīng)之前使HeLa提取物與遞增濃度的COH29一起孵育30分鐘。添加HeLa-化合物混合物至其余SV40DNA復(fù)制組分中，在37℃下孵育1小時(shí)，在DE81濾紙上點(diǎn)樣，用100mM焦磷酸鈉(pH 7.4)和300mM甲酸銨(pH 7.4)洗滌，接著干燥。接著通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定并入新合成的子代DNA鏈中的放射性標(biāo)記的物質(zhì)的量。

在不受任何特定理論束縛下，COH29抗癌活性可至少部分地源于抑制人核糖核苷酸還原酶(hRR)，其是一種用于生物合成脫氧核糖核苷酸來(lái)達(dá)成DNA復(fù)制的酶。此外，作為堿基切除修復(fù)復(fù)合物的組分，核糖核苷酸還原酶也涉及于DNA修復(fù)中。因此，在實(shí)施方案中，在本文中發(fā)現(xiàn)COH29靶向修復(fù)復(fù)合物的若干額外組分。此外，在實(shí)施方案中，BRCA1缺陷性人乳腺癌或卵巢癌細(xì)胞比野生型BRCA1對(duì)應(yīng)物對(duì)COH29更敏感。在實(shí)施方案中，在BRCA1突變細(xì)胞中，COH29展現(xiàn)與諸如順鉑的DNA交聯(lián)藥物協(xié)同。在實(shí)施方案中，在本文中發(fā)現(xiàn)COH29抑制RAD51，在不受任何特定理論束縛下，RAD51涉及于通過(guò)同源性重組(HR)路徑對(duì)雙鏈斷裂(DSB)的修復(fù)中。在實(shí)施方案中，COH29靶向多個(gè)DNA修復(fù)路徑，并且潛在調(diào)節(jié)由遺傳背景(突變)所致的備用DNA修復(fù)。在實(shí)施方案中，COH29可克服對(duì)PARP抑制劑(例如PARP1抑制劑)的獲得性抗性。在藥理學(xué)上，以及在不受任何特定理論束縛下，在本文中發(fā)現(xiàn)COH29抑制吉西他濱抗性人癌細(xì)胞增殖，并且與順鉑或γ輻照協(xié)同。

COH29是一種芳族取代的噻唑化合物，在不受任何特定理論束縛下，其占據(jù)hRRM2亞單位上位于hRRM1/hRRM2界面處的在結(jié)構(gòu)上保守的配體結(jié)合袋。在實(shí)施方案中，與這個(gè)袋的結(jié)合抑制hRRM1/hRRM2裝配，從而有效抑制RR活性。在體外，在多個(gè)人癌細(xì)胞系中，COH29是活性的，并且顯示其是高度有效力的，其中在大多數(shù)情況下IC₅₀小于10μΜ。已顯示COH29在NCI-60細(xì)胞系組中具有廣泛活性，并且多個(gè)人乳腺癌細(xì)胞系(包括例如人卵巢癌細(xì)胞系)對(duì)COH29敏感(6)。乳腺癌和卵巢癌在突變BRCA1基因攜帶者中比在一般群體中以更大頻率發(fā)生(32)。因此，在本文中，探究的是BRCA1缺陷性人癌細(xì)胞是否對(duì)COH29顯示更大敏感性。實(shí)際上，如圖1A中所示，由于純合性2594delC突變而表達(dá)截短BRCA1蛋白的UWB1.289卵巢癌細(xì)胞系(33)比表達(dá)野生型BRCA1的OV90人卵巢癌細(xì)胞系(IC₅₀：31.57±3.35μΜ)對(duì)COH29更敏感(IC₅₀：12.30±1.15μΜ)。

評(píng)估COH29在具有相同遺傳背景，僅在BRCA1表達(dá)方面不同的乳腺癌細(xì)胞中的作用以確定突變BRCA1使細(xì)胞毒性增加的程度。首先，考查使BRCA1表達(dá)沉默的影響。HCC1937是導(dǎo)致內(nèi)源性表達(dá)截短BRCA1蛋白的插入突變純合性人乳腺癌細(xì)胞(34)，并且HCC1937+BRCA1是表達(dá)人野生型BRCA1蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子克隆。在這些細(xì)胞中，通過(guò)RNA干涉來(lái)抑制BRCA1表達(dá)。在用10μΜ COH29處理72小時(shí)之后，72％的用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的HCC1937+BRCA1細(xì)胞存活。相比之下，僅53％的用BRCA1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存活。通過(guò)比較HCC1937細(xì)胞和HCC1937+BRCA1細(xì)胞來(lái)探究恢復(fù)野生型BRCA1表達(dá)對(duì)COH29細(xì)胞毒性的影響。當(dāng)用不同劑量的COH29處理72小時(shí)時(shí)，表達(dá)野生型BRCA1的細(xì)胞比BRCA1突變HCC1937細(xì)胞(IC₅₀：7.25±0.64μΜ)對(duì)COH29的敏感性小得多(IC₅₀：35.01±3.63μΜ)。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)顯示HCC1937+BRCA1細(xì)胞表達(dá)BRCA1的水平比HCC1937高約2.5倍。

在原位腫瘤外植體模型中進(jìn)一步確認(rèn)BRCA1缺乏性細(xì)胞對(duì)COH29的敏感性。相較于媒介物，通過(guò)用400mg/kg COH29每日口服給藥，植入小鼠乳腺脂肪墊中的HCC1937腫瘤的生長(zhǎng)得以顯著(p＝0.0007)抑制(圖1B)。相比之下，COH29治療小鼠中的用等基因HCC1937+BRCA1細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤不顯著小于媒介物對(duì)照中(p＝0.1577；圖1C)。

也考查卵巢癌細(xì)胞中BRCA1突變對(duì)COH29處理響應(yīng)的影響。UWB1.289+BRCA1是表達(dá)人野生型BRCA1基因的卵巢癌細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子克隆，并且UWB1.289是用表達(dá)新霉素抗性基因的對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞。用不同劑量的COH29處理這些細(xì)胞72小時(shí)。表達(dá)wt BRCA1的細(xì)胞對(duì)COH29的敏感性較小(IC50：對(duì)于UWB1.289+BRCA1和UWB1.289分別是23.52±2.38μΜ和12.30±1.15μΜ)。RT-PCR測(cè)定顯示UWB1.289+BRCA1細(xì)胞表達(dá)的BRCA1的水平比UWB1.289高約3.08倍。這些結(jié)果表明在BRCA1缺陷性人癌細(xì)胞中，COH29可誘導(dǎo)更大致死性。COH29的額外藥理學(xué)數(shù)據(jù)如表1和2所提供。特別重要的是發(fā)現(xiàn)COH29抑制對(duì)吉西他濱或順鉑具有抗性的各種人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(表1)。

專利

代理人案號(hào)48440-541001WO

專利

代理人案號(hào)48440-541001WO

為鑒定COH29通過(guò)其來(lái)優(yōu)先溶解BRCA1突變?nèi)税┘?xì)胞的機(jī)理，我們使用微陣列平臺(tái)進(jìn)行全基因組微陣列分析以鑒定受COH29處理影響的基因表達(dá)譜和路徑。將COH29處理的缺乏BRCA1的HCC1937乳腺癌細(xì)胞的RNA表達(dá)譜與COH29處理的HCC1937+BRCA1細(xì)胞的RNA表達(dá)譜進(jìn)行比較。HCC1937-COH29細(xì)胞與HCC1937+BRCA1-COH29細(xì)胞兩者均顯示DNA修復(fù)基因的基因本體論(GO)富集(表1a；p值在0.0046-0.0069的范圍內(nèi))，從而表明COH29干擾DNA修復(fù)路徑。舉例來(lái)說(shuō)，在HCC1937細(xì)胞中，DNA修復(fù)中涉及的DNA連接得以更強(qiáng)烈富集，此可與表型效應(yīng)相關(guān)。在BRCA1野生型細(xì)胞中，COH29誘導(dǎo)DNA損害信號(hào)傳導(dǎo)，并且抑制BRCA1和Rad51表達(dá)，從而表明COH29可抑制同源性重組(HR)路徑以維持由COH29活化的DDR(DNA損害響應(yīng))誘導(dǎo)的雙鏈斷裂(DSB)。

表1a.由于COH29處理而下調(diào)的基因的基因本體論富集

我們另外考查了公開(kāi)可用的在乳腺癌和卵巢癌患者群組中進(jìn)行的基因表達(dá)研究以驗(yàn)證RRM2與PARP1之間的基因表達(dá)關(guān)聯(lián)。我們發(fā)現(xiàn)在Ivshina等人(30)的乳腺癌群組研究中(n＝289，P＝0，r＝0.56；圖2A)，以及在來(lái)自Anglesio等人(35)的卵巢癌群組研究中的RRM2和PARP1基因表達(dá)關(guān)聯(lián)分析中(n＝90，p＝0，r＝0.62；圖2B)，在RRM2與PARP1之間存在強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)。未來(lái)在所選患者群組中的基因型-表型關(guān)聯(lián)可有助于確定用COH29與傳統(tǒng)乳腺和卵巢化學(xué)療法組合進(jìn)行靶向治療的風(fēng)險(xiǎn)概況。

為探究COH29通過(guò)其來(lái)優(yōu)先溶解BRCA1突變?nèi)税┘?xì)胞的機(jī)理，我們?cè)O(shè)法鑒定靶標(biāo)蛋白質(zhì)。在不受任何特定理論束縛下，我們推理靶標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)譜可通過(guò)與COH29相互作用而受影響。舉例來(lái)說(shuō)，COH-29與靶標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合可通過(guò)蛋白酶體募集來(lái)誘導(dǎo)它的降解。蛋白質(zhì)水平變化轉(zhuǎn)而可改變相應(yīng)基因的表達(dá)樣式。進(jìn)行微陣列分析以鑒定由于COH29處理而差異性表達(dá)的基因。將COH29處理的缺乏BRCA1的HCC1937乳腺癌細(xì)胞的RNA表達(dá)譜與COH29處理的HCC1937+BRCA1細(xì)胞的RNA表達(dá)譜進(jìn)行比較。差異性表達(dá)的基因的群集顯示于圖2A-2B中。

為確定COH29是否抑制hPARP1，考查用或不用COH29處理4小時(shí)、8小時(shí)或24小時(shí)的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中的PARP1活性。在缺乏BRCA1的人乳腺癌HCC1937細(xì)胞中，24小時(shí)COH29孵育使PARP1活性降低41.08％(726177cps(針對(duì)未處理)對(duì)427851cps(針對(duì)COH29處理))，而在類似處理的含有BRCA1的HCC1937+BRCA1細(xì)胞中，它降低了12.66％(2336878cps(針對(duì)未處理)對(duì)2041097cps(針對(duì)COH-29處理))(圖3A)。

在UWB1.289人卵巢癌株系中，PARP1受COH29抑制更顯著(圖3A)。在8小時(shí)COH29處理之后，在缺乏BRCA1的UWB1.289細(xì)胞中，PARP1活性降低了31.79％(113559cps(針對(duì)未處理)對(duì)774611(針對(duì)COH29處理))，而在類似處理的表達(dá)wt BRCA1的UWB1.289+BRCA1細(xì)胞中，它升高了46.31％(145769cps(針對(duì)未處理)對(duì)2129944cps(針對(duì)COH29處理))?？傊@指示在BRCA1缺陷性人癌細(xì)胞中，COH29以更大功效抑制PARP1。

也考查COH29對(duì)PARP1蛋白水平的影響。用COH29處理24小時(shí)使HCC1937BRCA1缺陷性乳腺癌細(xì)胞中的PARP1蛋白減弱，以及在較小程度上使HCC1937BRCA1wt細(xì)胞中的PARP1蛋白減弱(圖3B)。對(duì)于4小時(shí)COH29處理，觀察到少許降低。相比之下，ABT-888處理4小時(shí)導(dǎo)致HCC1937細(xì)胞中的PARP1顯著降低，而與它們的BRCA1狀態(tài)無(wú)關(guān)(圖3B)。

在BRCA1突變細(xì)胞背景下通過(guò)抑制PARP1實(shí)現(xiàn)的合成致死性可加強(qiáng)DNA損害性藥物的細(xì)胞毒性。(18)在此處，我們探究在BRCA1缺陷性人癌細(xì)胞中，由COH29抑制PARP1是否增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性。順鉑是一種廣泛使用的化學(xué)治療劑，其抗癌活性主要?dú)w因于靶標(biāo)細(xì)胞中的DNA交聯(lián)。表達(dá)wt BRCA1的人乳腺癌株系HCC1937的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(HCC1937+)或?qū)φ辙D(zhuǎn)染子(HCC1937)細(xì)胞用COH29和順鉑同時(shí)處理24小時(shí)。在用兩種藥物處理之后，當(dāng)相較于HCC1937+BRCA1細(xì)胞時(shí)，在HCC1937細(xì)胞中存在可存活性顯著降低(圖4A)。并行進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示用單獨(dú)COH29或單獨(dú)順鉑進(jìn)行單次處理對(duì)兩種細(xì)胞系產(chǎn)生較小但類似的水平的影響(圖4B；也參見(jiàn)表3)。在COH29與吉西他濱或γ輻照之間觀察到額外協(xié)同(表2)。

表2：COH29與各種抗贅生治療劑的協(xié)同

ND；未進(jìn)行

已知RR抑制性藥物羥基脲具有基因毒性(36,37)。預(yù)期COH29具有類似結(jié)果，因?yàn)樗惨种芌R。在人細(xì)胞中，所述損害使DNA損害檢查點(diǎn)活化以停止細(xì)胞周期進(jìn)展來(lái)允許有時(shí)間進(jìn)行修復(fù)。在不受任何特定理論束縛下，由DNA損害引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)最初由‘共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變物’(ATM)和‘ATM和Rad 3相關(guān)物’(ATR)介導(dǎo)。Chk1和Chk2代表信號(hào)傳導(dǎo)事件的下游激酶，其使Cdc25磷酸酶磷酸化。抑制Cdc25轉(zhuǎn)而會(huì)抑制Cdk/周期素復(fù)合物，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯(39)。為評(píng)估COH29處理對(duì)DNA損害檢查點(diǎn)的作用，我們采用兩種在p53狀態(tài)方面不同的細(xì)胞系。COH29處理含有野生型p53的MCF7細(xì)胞使DNA損害檢查點(diǎn)活化(圖6左側(cè)圖版)，如由ATM的磷酸化所證實(shí)。下游激酶CHK1和CHK2也被磷酸化。在缺乏p53的MCF7細(xì)胞(MCF-7p53-/-)中，在COH29處理之后，這些蛋白質(zhì)也被類似地修飾(圖6中心圖版)。在DNA損害之后，ATM或ATR使γ-Η2ΑΧ磷酸化以將修復(fù)蛋白質(zhì)募集至受損害的DNA的位點(diǎn)(39)。在兩種細(xì)胞系中，在COH29處理之后，均存在γ-Η2ΑΧ水平增加。因此，COH29處理以p53非依賴性方式使DNA損害檢查點(diǎn)活化。最后，考查COH29在表達(dá)降低水平的孕酮受體、雌激素受體和Her2受體的‘三重陰性’人乳腺癌細(xì)胞中的影響(33)。當(dāng)用COH29處理MDA-MB-468細(xì)胞時(shí)，觀察到以上激酶的類似活化概況(圖6，右側(cè)圖版)。

進(jìn)一步評(píng)估COH29在BRCA1野生型細(xì)胞中的作用。如圖7A中所示，COH29也誘導(dǎo)γ-Η2ΑΧ、磷酸p53和磷酸ATM在核中積累。此外，觀察到在COH29處理的細(xì)胞中，在核中對(duì)foxo3和它的靶標(biāo)蛋白質(zhì)p27的誘導(dǎo)(圖7A)。此外，我們通過(guò)共焦免疫熒光顯微術(shù)發(fā)現(xiàn)γ-Η2ΑΧ、磷酸p53和磷酸ATM與foxo3共定位在核中(圖7B、7C和7D)。這些結(jié)果指示在BRCA1野生型NSCLC A549細(xì)胞中，COH29也誘導(dǎo)DNA損害。DNA雙鏈斷裂(DSB)可通過(guò)同源性重組(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)路徑來(lái)修復(fù)。為進(jìn)一步闡明COH29在DSB DNA修復(fù)中的作用，我們通過(guò)基于GFP的染色體報(bào)道體EJ5-GFP確定在細(xì)胞中，COH29對(duì)NHEJ修復(fù)效率具有少許影響(圖8A-8B)。然而，根據(jù)蛋白質(zhì)印跡分析，在BRCA1野生型NSCLC A549細(xì)胞的核中，COH29對(duì)負(fù)責(zé)HR修復(fù)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)Rad51的表達(dá)的作用被下調(diào)(圖7A)。此外，COH29抑制BRCA1和Rad51灶形成的蛋白質(zhì)水平，伴有DSB標(biāo)志物γ-Η2ΑΧ在細(xì)胞中積累(圖9A和9B)，從而表明COH29可能夠通過(guò)下調(diào)BRCA1野生型A549細(xì)胞中的HR路徑來(lái)延長(zhǎng)DNA損害響應(yīng)(DDR)誘導(dǎo)的DSB。

為評(píng)估COH29的基因毒性，用一定劑量范圍的COH29(0-100μΜ)從1至7dpf(受精后天數(shù))處理野生型斑馬魚(yú)胚胎，并且與用已知會(huì)導(dǎo)致發(fā)育缺陷的HU(0-50mM)類似處理的胚胎進(jìn)行比較。如所預(yù)期，截至4dpf，HU導(dǎo)致眼和心臟中的缺陷(圖5A)，并且導(dǎo)致突變胚胎的數(shù)目劑量依賴性增加(圖5B)。相比之下，在COH29存在下未觀察到發(fā)育缺陷(圖5C)或活力降低(圖5D)。

在本文中，在體外研究與體內(nèi)研究?jī)烧咧芯^察到COH29在BRCA1缺乏性細(xì)胞系中比在BRCA1野生型細(xì)胞系中更具活性。BRCA1是細(xì)胞對(duì)DNA損害的應(yīng)答的一種介體。因此，在本文中進(jìn)行的對(duì)COH29處理的BRCA1缺乏性細(xì)胞和BRCA1野生型細(xì)胞的差異性基因表達(dá)分析將PARP1鑒定為另一受抑制蛋白質(zhì)。此外，我們尤其發(fā)現(xiàn)COH29加強(qiáng)DNA損害劑順鉑的活性。此外，我們尤其發(fā)現(xiàn)COH29以p53非依賴性方式使DNA損害檢查點(diǎn)活化，并且核Rad51被下調(diào)。

在試圖整合以上觀察結(jié)果時(shí)，我們提出下方案。在不受任何特定理論束縛下，我們提出在人細(xì)胞中，對(duì)DNA的損害(諸如由順鉑形成的交聯(lián))通常通過(guò)BER路徑來(lái)修復(fù)。因?yàn)镽R提供為修復(fù)所必需的dNTP，所以所述酶密切涉及于在S期期間發(fā)生的BER中。在G1期中，p53誘導(dǎo)性亞單位p53R2提供dNTP來(lái)達(dá)成BER。我們先前報(bào)道由COH29抑制RR會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)dNTP消減(6)。

COH29可影響雙鏈DNA斷裂修復(fù)，如由我們的顯示HR復(fù)合蛋白R(shí)ad51受抑制的數(shù)據(jù)所表明。這由COH29導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Rad51蛋白水平減弱的觀察結(jié)果指示(圖7A)。響應(yīng)于DNA損害，RAD51從胞質(zhì)液易位至核以在ssDNA上形成核絲，此是為促進(jìn)HR路徑所必需的步驟(45,46)。在未處理細(xì)胞中，大多數(shù)Rad51在胞質(zhì)液中表達(dá)(圖7B，上部圖版)。響應(yīng)于暴露于COH29，與Rad51顯著降低并行的核中γ-H2AX表達(dá)顯著增加表明Rad51可在COH29誘導(dǎo)的DSB中起作用。COH29對(duì)Rad51的這個(gè)作用類似于文獻(xiàn)對(duì)已知會(huì)使復(fù)制叉停滯的HU記載的作用(47)，其中重要差別在于COH29比HU更有效力20倍(6)，并且不具有可觀基因毒性(圖5A-5D)。

此外，COH29也抑制BRCA1，其是另一重要HR組分。已報(bào)道抑制PARP會(huì)下調(diào)由E2F4和p130介導(dǎo)的BRCA1和RAD51表達(dá)(48)。開(kāi)發(fā)用以打斷HR DNA修復(fù)機(jī)構(gòu)的抑制劑(51)已變得具有吸引力，因?yàn)镽ad51表達(dá)升高已在眾多類型的癌癥中被觀察到，并且與不良預(yù)后和藥物抗性相關(guān)聯(lián)(52,53)。已報(bào)道通過(guò)上調(diào)Rad51表達(dá)水平來(lái)增加HR能力可導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑的抗性(54)。甚至在BRCA1缺陷性細(xì)胞中，使53BP1損失也可允許達(dá)成部分HR修復(fù)，并且介導(dǎo)對(duì)PARP抑制劑的獲得性抗性(55)。由COH29誘導(dǎo)的通過(guò)下調(diào)Rad51的表達(dá)水平來(lái)使它的功能失活可充當(dāng)針對(duì)癌癥的潛在療法。我們的數(shù)據(jù)顯示COH29可干擾細(xì)胞中的BER、NER和HR修復(fù)路徑，從而表明COH29可靶向由遺傳背景或?qū)ARP抑制劑的抗性所致的備用DNA修復(fù)。

通過(guò)合成致死性或其它手段來(lái)增加DNA損害性藥物的效價(jià)攜有由于抑制體內(nèi)DNA修復(fù)能力而使這些藥物的誘變潛力增加的風(fēng)險(xiǎn)。在dsB修復(fù)路徑的情況下，顯示POLD1的失活(參見(jiàn)上文)導(dǎo)致結(jié)腸直腸腺瘤和癌瘤(49)。RAD51的多態(tài)性與某些人癌癥類型的發(fā)作相關(guān)聯(lián)(50)。然而，本文數(shù)據(jù)已顯示不同于HU，COH29處理似乎不在斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育期間致使可見(jiàn)形態(tài)學(xué)異常。此處所述的進(jìn)步可導(dǎo)致進(jìn)一步改進(jìn)當(dāng)前用于治療人癌癥的策略。COH-29對(duì)各種人乳腺癌細(xì)胞的作用顯示于表3中。

表3.COH29、順鉑和太平洋紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的作用。

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實(shí)施方案

本文公開(kāi)的主題的實(shí)施方案包括以下。

實(shí)施方案1.一種治療有需要的受試者的癌癥的方法，所述方法包括施用有效量的COH29(N-(4-(3，4-二羥基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3，4-二羥基苯甲酰胺)，其中所述受試者是BRCA1缺陷性受試者、PARP1抑制劑抗性受試者或DNA損害性抗癌劑抗性受試者。

實(shí)施方案2.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

實(shí)施方案3.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述施用抑制所述受試者中的DNA修復(fù)。

實(shí)施方案4.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述施用抑制所述受試者中的堿基切除修復(fù)(BER)、核苷酸切除修復(fù)(NER)或雙鏈DNA斷裂修復(fù)。

實(shí)施方案5.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述施用增加所述受試者中的γ-H2AX蛋白活性或表達(dá)。

實(shí)施方案6.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受試者中的Rad51蛋白活性或表達(dá)。

實(shí)施方案7.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受試者中的BRCA1蛋白活性或表達(dá)。

實(shí)施方案8.如實(shí)施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受試者中的PARP1蛋白活性或表達(dá)。

實(shí)施方案9.一種治療有需要的受試者的癌癥的方法，所述方法包括以組合協(xié)同量施用COH29(N-(4-(3,4-二羥基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羥基苯甲酰胺)和DNA損害性抗癌劑。

實(shí)施方案10.如實(shí)施方案9所述的方法，其中所述受試者是BRCA1缺陷性受試者或PARP1抑制劑抗性受試者。

實(shí)施方案11.如實(shí)施方案10所述的方法，其中所述受試者是乳腺癌受試者或卵巢癌受試者。

實(shí)施方案12.如實(shí)施方案9所述的方法，其中所述DNA損害性抗癌劑是化學(xué)治療性DNA損害劑。

實(shí)施方案13.如實(shí)施方案12所述的方法，其中所述化學(xué)治療性DNA損害劑是烷基化劑。

實(shí)施方案14.如實(shí)施方案13所述的方法，其中所述烷基化劑是氮丙啶、甲基蜜胺、亞硝基脲、氮芥、白消安、環(huán)磷酰胺或甲基芐肼。

實(shí)施方案15.如實(shí)施方案9所述的方法，其中所述化學(xué)治療性DNA損害劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶I藥劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II藥劑、喜樹(shù)堿、伊立替康、拓?fù)涮婵怠㈨樸K、卡鉑、奧沙利鉑、亞德里亞霉素、阿霉素、依托泊苷、單鏈斷裂劑、BCNU卡莫司汀、CCNU、DTIC、癌得星、異環(huán)磷酰胺、博萊霉素或絲裂霉素C。

實(shí)施方案16.如實(shí)施方案9所述的方法，其中所述DNA損害性抗癌劑是順鉑、吉西他濱或γ輻照。