本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用葉柄為外植體誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法。

背景技術(shù)：
隨著全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，對(duì)能源的需求日益增長(zhǎng)，而化石燃料的儲(chǔ)存量有限，可再生能源的發(fā)展受到越來(lái)越多的關(guān)注。烏桕(SapiumsebiferiumRoxb)是我國(guó)的四大木本油料之一，屬于大戟科烏桕屬多功能樹(shù)種。其適應(yīng)性強(qiáng)，不僅耐干早、瘠薄和耐短期積水，且是抗鹽性強(qiáng)的喬木樹(shù)種之一；它的籽實(shí)含油率高，最高可達(dá)55％，是具有很好應(yīng)用前景的生物能源樹(shù)種；除了用于制取生物柴油外，烏桕種子還可提制“皮油”和“清油”，前者供制高級(jí)香皂、蠟紙、蠟燭等，后者供油漆、油墨等用，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；此外，烏桕還是集觀果、觀葉、觀型與一身的優(yōu)良的園林景觀樹(shù)種，具有重要的觀賞價(jià)值，在我國(guó)已有1400年的栽培歷史。優(yōu)良品種的培育對(duì)于提高烏桕產(chǎn)量、改善油脂品質(zhì)具有重要意義。采用傳統(tǒng)的育種方式對(duì)烏桕進(jìn)行品種改良，不僅育種過(guò)程繁瑣而且育種周期長(zhǎng)；以基因工程、組織培養(yǎng)等生物技術(shù)對(duì)烏桕進(jìn)行品種改良可大大縮短育種周期，提高育種效率。而利用基因工程手段對(duì)植物進(jìn)行品種改良，需建立在高效、穩(wěn)定的植株組培再生體系的基礎(chǔ)上。目前有關(guān)烏桕組培再生的研究已有報(bào)道，主要集中在利用種子實(shí)生苗和幼胚為外植體對(duì)烏桕植株進(jìn)行快繁，這種再生體系的建立對(duì)于多年生烏桕優(yōu)良種質(zhì)的保存和擴(kuò)繁意義不大。另外，有關(guān)利用帶腋芽的莖段對(duì)烏桕優(yōu)良株系進(jìn)行快繁的研究，普遍存在污染率高、褐化嚴(yán)重、再生效率低等問(wèn)題。專利(烏桕組培不定芽高頻率植株再生的方法，公開(kāi)號(hào)101057556，公開(kāi)日2007-10-24)公開(kāi)了以下技術(shù)方案:取烏桕種子去除種皮,雙氧水表面消毒后接種到種子發(fā)芽培養(yǎng)基中,長(zhǎng)出完整的烏桕種子苗植株；將烏桕種子苗的縱向一分為二的子葉塊、含未展開(kāi)真葉的頂芽以及下胚軸和根切段,分別接種在適合頂芽、下胚軸和根等不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,通過(guò)直接誘導(dǎo)不定芽或經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)獲得嫩綠色不定芽叢；然后移入不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基,獲得伸長(zhǎng)不定芽幼苗；再轉(zhuǎn)入幼苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大繁殖,將經(jīng)擴(kuò)繁的幼苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上,長(zhǎng)成真葉展開(kāi)且根系發(fā)達(dá)的健壯烏桕試管植株,最后移栽到室外在自然條件生長(zhǎng)成活,得到烏桕的健壯苗,此種方法直接誘導(dǎo)叢生芽，以種子實(shí)生苗為材料來(lái)源很難保持母本植株優(yōu)良性狀，誘導(dǎo)率為70-90％。專利(一種通過(guò)幼胚胚狀體發(fā)生途徑誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法，公開(kāi)號(hào)103004594A，公開(kāi)日2013-04-03)公開(kāi)了以下技術(shù)方案：首先取烏桕未成熟種子，剝?nèi)ス麣ず?，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒；然后剪開(kāi)種殼取出未成熟合子胚，用鑷子進(jìn)行部分損傷后，接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)2個(gè)月左右黑暗培養(yǎng)，獲得2種經(jīng)不同發(fā)育途徑產(chǎn)生的胚狀體；將兩種胚狀體接種在相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代和增殖培養(yǎng)；然后轉(zhuǎn)至成苗培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成苗；培養(yǎng)20-30d左右，待幼苗長(zhǎng)成2-4片葉子時(shí)，進(jìn)行煉苗移栽，獲得健壯的烏桕再生苗，此種方法直接形成胚狀體，幼胚為雜合體，作為材料來(lái)源很難保持母本植株優(yōu)良性狀，不利于后期的快繁研究，誘導(dǎo)率為90％。專利(一種烏桕葉盤(pán)高效再生的方法，公開(kāi)號(hào)104012416A，公開(kāi)日2014-09-03)用優(yōu)良烏桕株系離體無(wú)菌苗葉片為外植體，通過(guò)直接誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生來(lái)獲得烏桕再生植株，在此基礎(chǔ)上一方面可以對(duì)烏桕優(yōu)良株系進(jìn)行快繁，另一方面也可利用分子生物學(xué)手段對(duì)相對(duì)優(yōu)良的烏桕株系進(jìn)行遺傳改良；但由于葉片較薄，較嫩，在進(jìn)行基因工程操作(農(nóng)桿菌浸染或基因槍轟擊)過(guò)程中容易受到機(jī)械損傷，影響轉(zhuǎn)化效果。葉柄相對(duì)于葉片而言耐受機(jī)械損傷能力較強(qiáng)，適于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，而目前尚無(wú)有關(guān)以烏桕葉柄為外植體建立烏桕再生體系的研究，上述報(bào)道和建立的烏桕再生體系并不適于葉柄的組培再生。本發(fā)明公開(kāi)一種以野外優(yōu)良單株為材料來(lái)源的葉柄直接和間接再生體系，為烏桕優(yōu)良株系的快繁和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，提供一種利用葉柄為外植體誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法。該方法利用野外烏桕優(yōu)良株系組培苗的葉柄為外植體，通過(guò)直接誘導(dǎo)不定芽和間接誘導(dǎo)愈傷組織兩條途徑建立烏桕高效再生體系，不僅為后期的烏桕優(yōu)良株系的快繁提供了新的技術(shù)途徑，而且為通過(guò)基因工程的方法對(duì)烏桕進(jìn)行遺傳改良提供了支撐。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種利用葉柄為外植體誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法，包括以下步驟：(1)對(duì)野外烏桕優(yōu)良株系的帶腋芽的莖段進(jìn)行消毒、培養(yǎng)，獲得烏桕無(wú)菌苗；(2)切取步驟(1)中所獲得的無(wú)菌苗的葉柄作為外植體，并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽或愈傷組織；其中，無(wú)菌苗的葉柄在接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基前切成0.3～0.6cm大小的切段；愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+0.2～2.0mg/LNAA+0.2～1.0mg/L6-BA+0.01～0.1mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(3)將步驟(2)中產(chǎn)生不定芽或產(chǎn)生愈傷組織的外植體，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中分別進(jìn)行不定芽和愈傷組織的增殖培養(yǎng)；其中，不定芽的增殖培養(yǎng)基為：MS+0.2～2.0mg/L6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；愈傷組織的增殖培養(yǎng)基為：MS+1.0～3.0mg/LNAA+0.2～1.0mg/L6-BA+0.01～0.2mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(4)將步驟(3)中增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織分化；其中，愈傷組織的分化培養(yǎng)基為：MS+0.5～2.0mg/L6-BA+0.01～0.2mg/LIBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(5)將步驟(3)中增殖后的不定芽叢或步驟(4)中分化成不定芽點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)接于不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)；其中，不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：MS+0.2～1.0mg/L6-BA+0.0～0.1mg/LIAA+0.01～0.1mg/LGA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(6)待不定芽伸長(zhǎng)后將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；2～3周后，待苗長(zhǎng)至3～4cm,并伴有2～4個(gè)真葉時(shí)進(jìn)行馴化、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株；其中，所述步驟(2)中的不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2.0～4.0mg/L6-BA+0.01～0.2mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；在烏桕葉柄再生的整個(gè)過(guò)程中除了葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)條件為23±2℃、黑暗培養(yǎng)，其它再生過(guò)程的培養(yǎng)條件均為23±2℃、光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2000～2200lx,光照時(shí)間為12～16h。優(yōu)選地，所述步驟(4)中的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基前切成(0.3～0.5)×(0.3～0.5)cm2大小的切塊。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明存在以下有益效果：本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：其一，葉柄取材于野外烏桕優(yōu)良株系再生的無(wú)菌苗，一方面能保持母本植株的種質(zhì)特性；另一方面可以避免野外直接取材污染率高的問(wèn)題，取材方便、無(wú)污染，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)野外烏桕優(yōu)良單株的快繁；其二，再生過(guò)程簡(jiǎn)單、高效，通過(guò)簡(jiǎn)單的激素配比調(diào)節(jié)，可以同時(shí)建立兩條不同的烏桕再生途徑；其三，本發(fā)明中所用的葉柄外植體較本發(fā)明人前期建立的葉片再生體系中所采用的葉片外植體健壯，有較強(qiáng)的耐受基因工程操作過(guò)程中機(jī)械損傷的能力，適于農(nóng)桿菌或基因槍介導(dǎo)的遺傳改良。因此，本發(fā)明所提供的一種利用葉柄為外植體誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法，不僅為后期的烏桕優(yōu)良株系的快繁提供了新的技術(shù)途徑，而且為以后通過(guò)基因工程的方法對(duì)烏桕進(jìn)行品種改良提供了技術(shù)支持。附圖說(shuō)明附圖1為誘導(dǎo)前的烏桕葉柄切段。附圖2為葉柄叢生芽的誘導(dǎo)。附圖3為葉柄叢生芽的增殖。附圖4為葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)。附圖5為葉柄愈傷組織的增殖。附圖6為葉柄愈傷組織的分化。附圖7為兩種不同再生途徑所獲得的不定芽的伸長(zhǎng)。附圖8為烏桕無(wú)菌苗的生根。附圖9為烏桕再生植株的移栽。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1一種利用葉柄為外植體誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法，具體操作如下：1、對(duì)野外烏桕優(yōu)良株系的帶腋芽的莖段進(jìn)行消毒、培養(yǎng)，獲得烏桕無(wú)菌苗；2、切取第1步驟所獲得的無(wú)菌苗的葉柄作為外植體，將葉柄切成0.5cm左右的切段,接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)(圖1)，其中所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；3、光照培養(yǎng)2～3周后，葉柄兩端誘導(dǎo)出不定芽(圖2)，然后將產(chǎn)生不定芽的葉柄橫切一分為二，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)中進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng)，其中所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：MS+0.75mg/L6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；4、3周后，將步驟3中增殖的不定芽叢(平均每個(gè)不定芽叢上有36.7個(gè)不定芽)(圖3)轉(zhuǎn)接于不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)，其中所述的不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LGA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；5、待叢生芽伸長(zhǎng)到2～3cm(圖7)，進(jìn)行生根培養(yǎng)，待苗長(zhǎng)至3～4cm,并伴有2～4個(gè)真葉(圖8)時(shí)，移至土中進(jìn)行馴化、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株(圖9)。實(shí)施例2：一種利用葉柄為外植體誘導(dǎo)烏桕植株再生的方法，具體操作如下：1、對(duì)野外烏桕優(yōu)良株系的帶腋芽的莖段進(jìn)行消毒、培養(yǎng)，獲得烏桕無(wú)菌苗；2、切取第1步驟所獲得的無(wú)菌苗的葉柄作為外植體，將葉柄切成0.5cm左右的切段,接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度為25℃，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織(圖1)，其中所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/LNAA+0.4mg/L6-BA+0.05mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；3、黑暗培養(yǎng)2～3周后，將產(chǎn)生愈傷組織的外植體(圖4)轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)中，于溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，其中所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.01mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；4、培光照養(yǎng)2周后，將增殖后的愈傷組織(圖5)切成0.3×0.5cm2大小，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，于溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下進(jìn)行愈傷組織分化研究，所述的愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LIBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；5、培養(yǎng)3～4周后將步驟4中的愈傷組織分化所獲得的不定芽叢(圖6)，轉(zhuǎn)接于不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，于溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)，其中所述的不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LGA3+0.01mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；6、待叢生芽伸長(zhǎng)到2～3cm(圖7)，進(jìn)行生根培養(yǎng)，待苗長(zhǎng)至3～4cm,并伴有2～4個(gè)真葉(圖8)時(shí)，移至土中進(jìn)行馴化、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株(圖9)。對(duì)比試驗(yàn)表1中列出了已報(bào)道的以烏桕不同材料為外植體對(duì)烏桕株系進(jìn)行再生的研究與本發(fā)明所述的方法效果對(duì)比?？梢钥闯觯景l(fā)明具有無(wú)污染、無(wú)褐化、再生率高、能保持母本株系優(yōu)良性狀和有利于后期基因工程操作研究等優(yōu)點(diǎn)，具有明顯的有益效果。表1：相關(guān)研究與本發(fā)明效果對(duì)比文獻(xiàn)1：韓珊，石大興等.紅葉烏桕莖段離體培養(yǎng)的研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006年9月第24卷第3期。文獻(xiàn)2：郄亞微，徐有明等.能源林樹(shù)種烏桕莖段離體培養(yǎng)與快速繁殖[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009年12月第37卷第12期。文獻(xiàn)3：陳建勇，李寶銀等.烏桕莖段誘導(dǎo)組培快繁技術(shù)研究[J].福建林業(yè)科技，2009年6月第36卷第2期。文獻(xiàn)4：蔣祥娥，歐陽(yáng)紹湘等。烏桕的組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].湖北林業(yè)科技，2010.1,20-22。文獻(xiàn)5：蔣澤平，倪競(jìng)德等.烏桕優(yōu)選單株的離體快速繁殖技術(shù)研究[J].江蘇林業(yè)科，技2011年10月第38卷第5期。文獻(xiàn)6：陳佳，陳凌艷等.烏桕離體快繁再生技術(shù)研究[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013年第33卷第6期。文獻(xiàn)7：畢君，張往祥等.紅葉烏桕組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013,29(28)：60-65。文獻(xiàn)8：李建科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