從豚草中分離純化兩種倍半萜內(nèi)酯化合物的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種從豚草(Ambrosia artemisiifolia L.)中分離純化兩種倍半萜內(nèi)酯化合物的方法，該方法是先用乙醇浸提，經(jīng)石油醚、乙酸乙酯萃取后，乙酸乙酯萃取層再經(jīng)小孔吸附樹脂除去色素，經(jīng)ODS C-18反相柱層析、葡聚糖凝膠柱層析分離后，最后利用石油醚/丙酮重結(jié)晶，得到高純度的單體化合物psilostachyin和psilostachyin B。本方法操作簡單，所使用的小孔吸附樹脂、ODS C-18、葡聚糖凝膠都可以重復(fù)利用，并且經(jīng)實驗證實，所得的兩單體化合物對入侵生物福壽螺(Pomacea canaliculata Lamarck)具有良好的毒殺效果，可用于防治福壽螺，具有良好的開發(fā)前景。
【專利說明】從豚草中分離純化兩種倍半瞄內(nèi)I旨化合物的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)防治領(lǐng)域，具體地說，是一種從豚草中分離純化兩種倍半祗內(nèi)醋 化合物psilostach}dn和psilostach}dn B的方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[000引 福壽螺（Pomacea canaliculata Lamarck)起源于南美洲，在我國主要分布于長江 W南地區(qū)，主要取食水稻分葉嫩芽和水生植物，是一種對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害十分嚴(yán)重的入侵水 生動物。目前對福壽螺的防治主要W化學(xué)藥劑防治為主，如氯硝柳胺和聚己醒等，但化學(xué) 藥劑除成本高，對其它非祀標(biāo)生物毒性較大外，還對生態(tài)環(huán)境污染嚴(yán)重，影響農(nóng)業(yè)的安全生 產(chǎn)。豚草（Ambrosia artemisiifolia L.)是近年來入侵我國的惡性雜草，能嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)，并破壞生物的多樣性。因此，利用豚草該種惡性入侵植物來滅殺福壽螺，既能有效地 控制福壽螺，又能在一定程度上遏制豚草的蔓延，可謂毒攻毒"、"一箭雙雕"。
[0003] 已有專利CN103004892A報道豚草干粉對福壽螺有毒殺作用，在水體中投加lOg/L 的豚草干粉末3天后能滅殺95%的福壽螺，顯示了豚草具有較好的殺福壽螺應(yīng)用前景。但 是該專利并未設(shè)及豚草中滅殺福壽螺的活性成分，截至目前，國內(nèi)外對豚草中滅殺福壽螺 的活性成分也尚無研究報道?；诖?，本發(fā)明進一步對豚草的活性成分進行分離純化，提供 了一種從該植物中快速提取純化出毒殺福壽螺活性成分的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是；針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡便的 從豚草中分離純化兩種倍半祗內(nèi)醋化合物的方法，同時提供該兩種化合物在防治福壽螺中 的應(yīng)用。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是；一種從豚草中分離純化兩 種倍半祗內(nèi)醋化合物的方法，該方法步驟如下：
[0006] A、取豚草地上部分，洗凈、風(fēng)干、粉碎成粒度《20目的粉末，按Ig豚草粉加3-7ml 95%體積百分濃度的己醇的比例，于豚草粉中加入己醇在室溫下浸提3次，每次浸提48-96 小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮回收己醇后，得到膏狀己醇浸提物；
[0007] B、按Ig己醇浸提物加30-60ml水的比例，將己醇浸提物加水分散，再依次用等體 積的石油離和己酸己醋于常溫分別萃取3次，每次萃取時間為3-5小時，得到石油離萃取層 和己酸己醋萃取層，減壓回收石油離和己酸己醋萃取液，得石油離浸膏和己酸己醋浸膏；其 中，石油離和己酸己醋皆為分析純；
[000引 C、將己酸己醋浸膏用甲醇溶解為飽和溶液后經(jīng)小孔吸附樹脂吸附至飽和，先用水 洗脫至無色后，再用90%體積百分濃度的甲醇洗脫至無色，收集洗脫液，濃縮得濃縮物；
[0009] 上述小孔吸附樹脂只要是能用于去除己酸己醋膏色素的皆可，如MCI GEL CHP 20P 37-75um 或 SMB MCI GEL 50-70um 等。
[0010] D、將濃縮物上ODS C-18反相色譜柱進行層析，用體積比為3:7 - 7:3的甲醇與水 的混合液進行梯度洗脫，收集甲醇與水的體積比為4:6時的洗脫液，經(jīng)薄層色譜檢測，合并 相同主點饋分，得到兩組分，將該兩組分分別上葡聚糖凝膠柱（Sephadex LH-20)柱層析進 行純化，用甲醇進行洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測，合并主點饋分并減壓濃縮，獲得兩個固體狀物， 再將所得固體分別用體積比為1 ;1混合的石油離和丙酬重結(jié)晶，得到單體化合物1和2 ;
[0011] E、采用核磁共振氨譜及核磁共振碳譜技術(shù)對上述單體化合物1和2進行結(jié) 構(gòu)鑒定及理化性質(zhì)的比對，確證所得單體化合物1為psilostac的in,單體化合物2為 psilostachyin B。
[0012] 經(jīng)驗證，上述二單體化合物psilostachyin和psilostachyin B對福壽螺具有毒 殺作用，因此，本發(fā)明同時提供上述二單體化合物在防治福壽螺中的應(yīng)用。
[0013] 如此，本發(fā)明從豚草中得到兩個殺福壽螺的主要活性成分，使得開發(fā)利用豚草中 活性成分比利用豚草干粉防治福壽螺更加高效、可控；本方法操作簡便，且使用的填料小孔 吸附樹脂、0DS C-18、葡聚糖凝膠等都可W重復(fù)使用，成本低，污染小。并且，豚草屬于植物 材料，利用其提取物防治福壽螺是一種W害治害的生態(tài)防控手段，不僅能有效地防治福壽 螺，而且可W控制豚草的蔓延；為有害入侵植物的資源化利用開辟了新的途徑，對于入侵生 態(tài)學(xué)及生物入侵控制技術(shù)的研究都有極大的參考價值。

【具體實施方式】
[0014] W下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[00巧]實施例1
[0016] 1.化合物的提取分離
[0017] 取10kg風(fēng)干粉碎成粉末的豚草地上部分，室溫下用50L 95%體積百分濃度的己 醇浸提3次，每次浸提50小時，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮回收己醇后，得到膏狀己醇浸 提物500g，將該500g己醇浸提物加20L水分散，依次用等體積的石油離、己酸己醋萃取，各 萃取3次，每次萃取4小時，得石油離萃取層和己酸己醋萃取層，減壓回收石油離和己酸己 醋萃取液，得石油離浸膏90g、己酸己醋浸膏90g ;將己酸己醋浸膏用甲醇溶解為飽和溶液， 經(jīng)小孔吸附樹脂（MCI GEL CHP20P 37-75um)吸附至飽和，先用水洗脫至無色后，再用90% 體積百分濃度的甲醇洗脫至無色，收集洗脫液，濃縮；將所得濃縮物過0DS C-18反相色譜 柱層析，用甲醇/水（3:7 - 7:3, v/v)進行梯度洗脫，每個濃度收集10瓶，每瓶10〇111以收 集甲醇：水=4:6(v/v)洗脫部分，經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同主點饋分即合并第1-3瓶和 第5-9瓶，得到兩組分，將該兩組分分別利用Se地adex LH-20柱層析分離純化（用甲醇進 行洗脫），經(jīng)薄層色譜檢測，合并主點饋分并減壓濃縮，獲得兩個固體狀物，將它們分別進一 步利用石油離/丙酬（1 ;1，v/v)重結(jié)晶，得到兩個無色針狀結(jié)晶的單體化合物U60mg)和 2巧Omg)，經(jīng)HPLC檢測純度為95 % W上。
[0018] 2.化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
[0019] 上述化合物1，為無色針狀晶體，核磁共振數(shù)據(jù)如下；電NMR巧00MHz，CDCl3) 5 6. 27 (H-1 la, d, J = 3. 2Hz, 1H)，5. 58 (H-1 lb, d, J = 3. 2Hz, 1H)，4. 99 (H-8, d, J = 9.甜Z ,IH), 3. 43 (C_H, m, IH), 2. 90-1. 49 (m, complex si即al), 1. 23 巧-5, s, 3H), 1. 06 (H_l, d, J =7. 5Hz，3H).nC NMR(126MHz，CDCl3) 5 177. 32 (C4)，169. 68(C12)，139. 00(C11)，121.77 (C13)，93. 64 (C5)，83. 42 (C8)，79. 58 (Cl)，41. 72 (C7)，40. 17 (CIO)，30. 21 (C6)，27. 30 (C3 )，26. 94 (C9)，15. 04 (C。，14. 85 (C14)，14. 64 (C15).對照文獻，其 iHNMR 和"CNIR 數(shù)據(jù)與 psilostachyin-致，并且理化性質(zhì)中晶體烙點213°、旋光值[a]忘i = -98.5(c 0.5， CHCl3)與文獻報道一致（中國中藥雜志，1993，18(3);164-166)，所W進一步鑒定為同一 物，即確定化合物1為psilostach}dn。
[0020] 上述化合物2,為無色針狀晶體，iHNMR譜顯示：存在2個典型的單峰甲 基信號[Sh 1.54(s，H3-14)和1.44(s，H3-15)]，在C-6上存在1個典型的內(nèi)醋 鍵[S H 4. 88化J = 9. IHz，H-6)]，在C-11上存在a，0 '不飽和丫內(nèi)醋形式的 環(huán)外亞基組，有1對相互影響強烈的雙峰質(zhì)子[S H 6. 25化J = 3.甜Z，H-13a) 和 5. 48 (d, J = 3. IHz, H-13b) ]。iH NMR(400MHz, Pyr) 5 6. 25 (1H, d, J = 3.5Hz，H-13a)，5. 48 (lH，d，J = 3.1Hz, H-Ub)，4.88 (lH，d，J = 9.1Hz, H-6), 3 .30 (IH, m, H-7)，2. 68 (IH, ddd, J = 16. 9, 9. 3, 6. 2Hz, H-9a)，2. 50 (IH, ddd, J = 16. 9, 6. 9, 5. 5Hz, H-9b)，2. 42 - 2. 28 (2H, m, H-2)，2. 24 - 2. 16 (2H, m, H-3)，1. 87 (IH, ddd, J =14. 2, 9. 5, 4. 8Hz, H-8a)，1. 67 - 1. 58 (IH, m, H-8b)，1. 54 (3H, s, H-14)，1. 44 (3H, s, H-15). 1化匪R(l〇〇MHz，Pyr) 5 171. 27(C-4), 170. 64(C-12), 139. 83 (C-11), 133. 61( C-1)，126. 71 (C-10)，120. 57 (C-13)，87. 42 (C-5)，84. 19 (C-6)，42. 09 (C-7)，35. 18 (C -3)，30. 51(C-8)，26. 30(C-9)，25. 80(C-2)，23. 87(C-14)，23. 21(C-15).對照文獻， 其iHNMR和"CNMR數(shù)據(jù)與psilostac的in B -致，鑒定為同一物，并且理化性質(zhì)中晶 體烙點 118°、旋光值[a] 〇二-9.9 (C 0.7, CHCg 與文獻報道一致（Phytochemist ry，1986, 25 (6) : 1355-1358)，所W進一步鑒定為同一物，即確定化合物2為psilostach}dn B。
[0021] 上述二化合物 psilostachyin 和 psilostachyin B 的結(jié)構(gòu)式為；
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種從豚草中分離純化兩種倍半萜內(nèi)酯化合物的方法，其特征在于，該方法步驟如 下： A、 取豚草地上部分，洗凈、風(fēng)干、粉碎成粉末，按lg豚草粉加3-7ml 95%體積百分濃度 的乙醇的比例，于豚草粉中加入乙醇在室溫下浸提3次，每次浸提48-96小時，過濾，合并濾 液，減壓濃縮回收乙醇后，得到膏狀乙醇浸提物； B、 按lg乙醇浸提物加30-60ml水的比例，將乙醇浸提物加水分散，再依次用等體積的 石油醚和乙酸乙酯于常溫分別萃取3次，每次萃取時間為3-5小時，得到石油醚萃取層和乙 酸乙酯萃取層，減壓回收石油醚和乙酸乙酯萃取液，得石油醚浸膏和乙酸乙酯浸膏； C、 將乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解為飽和溶液后經(jīng)小孔吸附樹脂吸附至飽和，先用水洗脫 至無色后，再用90%體積百分濃度的甲醇洗脫至無色，收集洗脫液，濃縮得濃縮物； D、 將濃縮物上ODS C-18反相色譜柱進行層析，用甲醇與水按體積比為3:7 - 7:3的混 合液進行梯度洗脫，收集甲醇與水的體積比為4:6時的洗脫液，經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同 主點餾分，得到兩組分，將該兩組分分別上S印hadex LH-20柱層析進行純化，用甲醇進行洗 脫，經(jīng)薄層色譜檢測，合并主點餾分并減壓濃縮，獲得兩個固體狀物，再將所得固體分別用 體積比為1 :1混合的石油醚和丙酮重結(jié)晶，得到單體化合物1和2 ; E、 采用核磁共振氫譜及核磁共振碳譜技術(shù)對上述單體化合物1和2進行結(jié)構(gòu)鑒定及理 化性質(zhì)的比對，確證所得單體化合物1為psilostachyin，單體化合物2為psilostachyin B〇
2. 如權(quán)利要求1所述的從豚草中分離純化兩種倍半萜內(nèi)酯化合物的方法，其特征在 于，所述步驟C中的小孔吸附樹脂為MCI GEL CHP20P 37-75um或SMB MCI GEL 50-70um。
3. 如權(quán)利要求1所述的從豚草中分離純化兩種倍半萜內(nèi)酯化合物的方法，其特征在 于，所述步驟A中的豚草粉粒度< 20目。
4. 如權(quán)利要求1-3所述的單體化合物psilostachyin在防治福壽螺中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1-3所述的單體化合物psilostachyin B在防治福壽螺中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P9/00GK104447787SQ201410853228
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】丁文兵, 黃蕊, 李有志, 劉雙清 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)