短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的生物制劑中的應(yīng)用，所述的粉狀制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢桿菌為保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成的粉狀菌劑，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為109-1011cfu/g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：能夠顯著提高魚體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強(qiáng)養(yǎng)殖魚類的機(jī)體免疫力，顯著抑制魚類腸道致病菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)魚體快速生長(zhǎng)，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。CCTCC NO: M201324020130602
【專利說(shuō)明】短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制劑的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制劑 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌性疾病一直是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要原因之一。近年來(lái)，高密度集約化 的生產(chǎn)模式在促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)提高產(chǎn)量的同時(shí)，也使得細(xì)菌疾病發(fā)生的機(jī)會(huì)增大、頻率增加、危 害加大；此外，抗生素使用導(dǎo)致的耐藥性、藥物殘留W及對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞也成為社會(huì)關(guān)注 的焦點(diǎn)。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式已經(jīng)成為水產(chǎn)病害防治研究重要 方向之一。
[0003] 群體感應(yīng)（Quorum sensing,簡(jiǎn)稱Q巧是指細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生并釋放一些特定的信 號(hào)分子，感知自身濃度的變化，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。目前，調(diào)節(jié)細(xì)菌群體感應(yīng)的信號(hào) 分子主要有H種，（a)N-醜基高絲氨酸內(nèi)醋（AHLs)，是廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中的群 體感應(yīng)的信號(hào)分子；化）自體誘導(dǎo)膚（Autoin化cing P巧tides, AI巧，AIP是一類短膚分子， 是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中常見的信號(hào)分子；（C)自體誘導(dǎo)物II類分子（Auto imlucingII，AI2)， 是W費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri)為代表的由luxS酶催化的AI 2系統(tǒng)的信號(hào)分子。研究 表明，在革蘭氏陰性細(xì)菌中，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hy化ophila)等，其生物被膜形成、有害毒素產(chǎn)生、致病因子釋放等行為均受到 AHLs類信號(hào)分子的調(diào)節(jié)。Dong(2000)等人在蠟樣芽抱桿菌炬acillus cereus)中發(fā)現(xiàn)了 aiiA基因，能夠合成AHLs信號(hào)分子降解酶，阻斷QS信號(hào)分子在細(xì)菌間的傳遞；尹守亮等 (2009)從膠州灣海域篩選出一株能夠降解AHLs信號(hào)分子的真菌，表明海洋微生物也可W 作為QS抑制劑的潛在研究對(duì)象；化avanath等（2013)發(fā)現(xiàn)紫杉狀?？诙ˋsparagopsis taxi化rmis)的粗提物能夠降解AHLs信號(hào)分子，并且對(duì)銅綠假單胞菌生物膜有一定的抑制 作用。De化ir化等（2011)首次從南美白對(duì)郵和海水妒魚等水產(chǎn)動(dòng)物的腸道中分離出了能 夠抑制哈氏弧菌（Vibrio harv巧i)QS信號(hào)分子傳遞的芽抱桿菌，化化址等（2011)分離出 一株能夠抑制AHLs信號(hào)分子的微藻，該微藻能夠阻斷哈氏弧菌QS系統(tǒng)，降低其致病力。該 些研究為探討從群體感應(yīng)角度防控水產(chǎn)細(xì)菌性疾病提供了理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)的支撐。芽 抱桿菌炬caillus SP)具有易生產(chǎn)、便運(yùn)輸、耐儲(chǔ)藏等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可W起到凈化水 質(zhì)、防治疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)等作用，是常用的益生微生物菌株。
[0004] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN103525723A公開了一種具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽抱 桿菌，具有抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的作用，可用于制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的微生物制劑。但是 關(guān)于一種具有顯著防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害、提高存活率的短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制 劑的應(yīng)用目前還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉 狀制劑的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是；短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制 劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的生物制劑中的應(yīng)用，所述的粉狀制劑的有效成分由短小芽 抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽抱桿菌為保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240的短小芽 抱桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成的粉狀菌劑，其中短小芽抱桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇iic化/ g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素C、黃茂、杜仲、覺參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石惱皮和五味 子，所述的粉狀制劑中短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為；短小芽抱桿菌14-16 份、維生素C 10-12份、黃茂7-8份、杜仲4-5份、覺參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、 柴胡9-10份、烏梅3-5份、石惱皮4-6份、五味子9-10份。
[0007] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑中短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為；短小芽 抱桿菌16份、維生素C 12份、黃茂8份、杜仲5份、覺參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡 10份、烏梅5份、石惱皮6份、五味子10份。
[0008] 優(yōu)選的，所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%計(jì)， 包括米慷10%，款皮25%，豆稍32%，玉米粉30%，酵母提取物2%，化C1 1%，料水比為 1:1。
[0009] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑的制備方法為將所述的短小芽抱桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體 發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽抱桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇iicfu/g，將所述的粉 狀菌劑、維生素C、黃茂、杜仲、覺參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石惱皮和五味子分別粉碎過 100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0010] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑作為水產(chǎn)飼料添加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
[0011] 優(yōu)選的，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
[0012] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑在飼料中的添加量為1% -3%。
[001引本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0014] 本發(fā)明的粉狀制劑用于防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害，對(duì)魚類的免疫保護(hù)率高達(dá)73-90%， 能夠顯著提高魚體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強(qiáng)養(yǎng)殖魚類的機(jī)體免疫力，顯著抑制 魚類腸道致病菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)魚體快速生長(zhǎng)，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0016] 本發(fā)明提供短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的 生物制劑中的應(yīng)用，所述的粉狀制劑的有效成分由短小芽抱桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述 的短小芽抱桿菌為保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240的短小芽抱桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制 成的粉狀菌劑，其中短小芽抱桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇iic化/g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素C、 黃茂、杜仲、覺參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石惱皮和五味子，所述的粉狀制劑中短小芽抱 桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽抱桿菌14-16份、維生素C 10-12份、黃茂7-8 份、杜仲4-5份、覺參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石惱皮 4-6份、五味子9-10份。
[0017] 所述的短小芽抱桿菌炬aillus pumilus)，保藏單位；中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也 (CCTCC)，地址；武漢大學(xué)生命科學(xué)院保藏中也，保藏日期2013年6月2日，保藏編號(hào)為 CCTCC NO ;M 2013240。已證實(shí)其具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用。
[0018] 所述的粉狀制劑的制備方法為將所述的短小芽抱桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制 成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽抱桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇llc化/g，將所述的粉狀菌劑、 維生素C、黃茂、杜仲、覺參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石惱皮和五味子分別粉碎過100目篩 后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0019] 實(shí)施例1短小芽抱桿菌液體發(fā)酵
[0020] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常規(guī) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W/ V);葡萄糖 2 %，豆餅粉 8 %，玉米漿 1 %，M拆〇4 ? 7&00. 02 %，化C1 0. 4 %，皿2?〇4 0. 1 %， MnCl2 0.04%，發(fā)酵溫度3(TC，通風(fēng)培養(yǎng)24-4她。得到高濃度的發(fā)酵菌液，其中活菌數(shù) 109-l〇iic化/g。將發(fā)酵菌液離也去除發(fā)酵液，得到濕菌泥，添加抗熱保護(hù)劑后，噴霧干燥，得 到固體粉狀菌劑，活菌數(shù)l〇 9-l〇iicfu/g。
[0021] 實(shí)施例2短小芽抱桿菌固態(tài)發(fā)酵
[0022] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、固態(tài)發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常規(guī) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。將種子培養(yǎng)液W 5-10%的 接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24-4她，發(fā)酵溫度3(TC，發(fā)酵 產(chǎn)物烘干粉碎后，即得短小芽抱桿菌粉狀菌劑。其中活菌數(shù)l〇 9-l〇iic化/g。
[0023] 其中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%計(jì)，包括米慷 10%，款皮25%，豆稍32%，玉米粉30%，酵母提取物2%，化C1 1%，料水比為1:1。
[0024] 實(shí)施例3粉狀制劑的制備
[0025] 將所述的短小芽抱桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽抱桿 菌活菌數(shù)為l〇9-l〇iic化/g，將所述的粉狀菌劑16份、維生素C 12份、黃茂8份、杜仲5份、 覺參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石惱皮6份、五味子10份。分別粉 碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0026] 實(shí)施例4粉狀制劑的制備
[0027] 將所述的短小芽抱桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽抱桿 菌活菌數(shù)為l〇9-l〇iic化/g，將所述的粉狀菌劑14份、維生素C 10份、黃茂7份、杜仲4份、 覺參2份、當(dāng)歸3份、金銀花6份、柴胡9份、烏梅3份、石惱皮4份、五味子9份。分別粉碎 過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0028] 實(shí)施例5粉狀制劑的制備
[0029] 將所述的短小芽抱桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽抱桿 菌活菌數(shù)為l〇 9-l〇iic化/g，將所述的粉狀菌劑15份、維生素C 11份、黃茂7份、杜仲4份、 覺參3份、當(dāng)歸4份、金銀花7份、柴胡10份、烏梅4份、石惱皮5份、五味子10份。分別粉 碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0030] 實(shí)施例6粉狀制劑的水體潑灑效果實(shí)驗(yàn)
[0031] 側(cè)魚，購(gòu)買自江蘇徐州淡水魚養(yǎng)殖中也，體重100 + 0. 5g，提前飼喂10天，無(wú)任何 嗜水氣單胞菌癥狀。飼料購(gòu)買自寧波天邦股份有限公司，按照體重的3%飼喂。
[0032] 在試驗(yàn)前先馴養(yǎng)一周確定無(wú)任合嗜水氣單胞菌癥狀，然后取體重（100 + 2. 3)g的 魚即魚90條，隨機(jī)分為H組每組H個(gè)重復(fù)，每組10條，養(yǎng)殖在700 X 500 X 50mm，體積90L水族 箱中，保持水溫16?2(TC。
[0033] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)H個(gè)組，共90條，每組10條，H個(gè)重復(fù)，對(duì)照組：在水體中加入培養(yǎng)的嗜 水氣單胞菌菌液lOOmU經(jīng)稀釋后最終菌液濃度達(dá)到10 8c化/mU在先實(shí)驗(yàn)確定嗜水氣單胞 菌的絕對(duì)致死濃度為1 X l〇8c化/mL)，試驗(yàn)組加入嗜水氣單胞菌菌液lOOmL和實(shí)施例3制備 得到的本發(fā)明的粉狀制劑lOg，空白組為空白對(duì)照水體中不加入任何東西。每隔兩天換水， 加入曝過氣的自來(lái)水，和重新培養(yǎng)的菌液，記錄側(cè)魚的生長(zhǎng)狀況W及死亡數(shù)。
[0034] 在兩周的飼養(yǎng)周期內(nèi)，空白組沒有任何的死亡現(xiàn)象；對(duì)照組所有樣本在9天內(nèi)全 部死亡，而水體中加入嗜水氣單胞菌和本發(fā)明的粉狀制劑的試驗(yàn)組，在走天后達(dá)到穩(wěn)定，最 終的存活率為90%。
[00巧]實(shí)施例7粉狀制劑促生長(zhǎng)和攻毒實(shí)驗(yàn)
[0036] 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)；試驗(yàn)選擇健康、規(guī)格、重量基本一致的側(cè)魚，個(gè)體初均重約50g。隨機(jī)分 組，設(shè)有對(duì)照組、試驗(yàn)一組、試驗(yàn)二組、試驗(yàn)H組和試驗(yàn)四組，每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，每平行 組50尾試驗(yàn)魚，共6個(gè)網(wǎng)箱（規(guī)格為250cmX 150cmX 100cm)。側(cè)魚馴化30d后，對(duì)照組投 喂普通飼料，試驗(yàn)一組投喂添加3. 0 %重量百分比本發(fā)明粉狀制劑（實(shí)施例3)的飼料，試驗(yàn) 二組投喂添加1. 0%重量百分比本發(fā)明粉狀制劑的飼料，試驗(yàn)H組投喂添加3. 0%重量百 分比本發(fā)明所述短小芽抱桿菌（不包括免疫增強(qiáng)劑的粉狀制劑）的飼料，試驗(yàn)四組投喂添 加3.0%重量百分比免疫增強(qiáng)劑（不包括短小芽抱桿菌的免疫增強(qiáng)劑）的飼料，飼養(yǎng)56山 測(cè)定其生長(zhǎng)的影響。
[0037] 攻毒實(shí)驗(yàn)；對(duì)照組、試驗(yàn)一組、試驗(yàn)二組、試驗(yàn)H組和試驗(yàn)四組每組隨機(jī)抽取15尾 側(cè)魚。IX 108c化/血嗜水氣單胞菌，按每lOOg魚重腹腔注射菌液1. 0ml，后放養(yǎng)于同樣規(guī) 格容積的水泥池網(wǎng)箱中（規(guī)格為lOOcmXlOOcmXlOOcm)，并保證充足的氧氣，每天觀察魚 體死亡情況，觀察lOd，統(tǒng)計(jì)存活率。
[0038] 具體試驗(yàn)結(jié)果見下表1。
[0039] 表1 H組增重率和死亡率的對(duì)照
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑粉狀制劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的生物制劑中的 應(yīng)用，所述的粉狀制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢桿 菌為保藏編號(hào)為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成的粉狀菌 齊U，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素C、黃芪、杜仲、 黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子，所述的粉狀制劑中短小芽孢桿菌和免疫 增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、維生素C 10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5 份、黨參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石榴皮4-6份、五味 子9-10份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的粉狀制劑中短小芽孢桿菌和免疫 增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌16份、維生素C 12份、黃芪8份、杜仲5份、黨參4 份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石槽皮6份、五味子10份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所 述的料按總質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%計(jì)，包括米糠10%，麩皮25%，豆柏32%，玉米粉30%，酵母提取 物2%，NaCl 1%，料水比為1:1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的粉狀制劑的制備方法為將所述的 短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽孢桿菌活菌 數(shù)為109-10ncfU/g，將所述的粉狀菌劑、維生素C、黃苗、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏 梅、石榴皮和五味子分別粉碎過1〇〇目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的粉狀制劑作為水產(chǎn)飼料添 加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的粉狀制劑在飼料中的添加量為 1% -3%。
【文檔編號(hào)】A23K1/18GK104397358SQ201410752560
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】宋增福, 許維素 申請(qǐng)人:蘇州埃瑞特生物技術(shù)有限公司