富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法。包括材料獲取，加載處理，植物玻璃化溶液處理，超低溫保存，解凍和卸載處理，恢復(fù)培養(yǎng)步驟。本發(fā)明方法簡便易行、穩(wěn)定性高、高效可靠；超低溫保存莖尖解凍后再生率達(dá)到90％以上；超低溫保存莖尖再生的植株生根狀況良好，移栽后生長狀態(tài)穩(wěn)定。
【專利說明】富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程學(xué)領(lǐng)域。具體涉及富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]富民枳為蕓香科枳屬植物。蕓香科枳屬包括兩種，即枳和富民枳。富民枳于1984年由丁素琴等在云南富民縣進(jìn)行柑桔資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)和描述。富民枳的野生種群基本滅絕。少數(shù)富民枳的植株在昆明植物園，富民縣農(nóng)業(yè)局茶桑果站種植園得到遷地保護(hù)。另外，在美國 Nat1nal Plant Germplasm System 中收集和保存了兩份(http: // www.ars-grin.Rov/cR1-bin/npRs/html/taxon.pi ? 411341)。富民積是柑橘育種的重要種質(zhì)資源。一項(xiàng)對富民枳生物學(xué)特性的研究表明富民枳在做砧木嫁接柑橘時(shí)結(jié)果早，株型矮化，是柑橘優(yōu)良的矮化砧。富民枳在其原生地以果實(shí)入藥，被當(dāng)?shù)厝朔Q為“止咳樹”。在一項(xiàng)專利中提到，富民積的抽提物具有抗氧化和抗炎的作用(http://ip.com/patfam/en/39396292)。富民積除現(xiàn)有的活體植株保存以外，可以通過種子保存而在種質(zhì)資源庫長期保存。此類植物由于種子表現(xiàn)為頑拗性或者中間性，一般以活體植株的形式在資源圃或植物園保存。富民枳的種子儲藏類型沒有見研究報(bào)到。參考其它c(diǎn)itrus屬和Poncirus屬植物的情況，富民枳的種子可能也表現(xiàn)為中間性的(intermediate)儲藏類型。因而無法進(jìn)行脫水和在常規(guī)種子庫(15%含水量，-200C )中保存。
[0003]超低溫保存一般是指使用液氮(_196°C )或液氮蒸汽保存生物材料的技術(shù)和方法。在液氮溫度下，細(xì)胞中所有的生化反應(yīng)都被暫時(shí)停止，從而可以使細(xì)胞在理論上進(jìn)行無限期保存。超低溫保存技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物、動(dòng)物和植物種質(zhì)資源的長期保存。超低溫保存是生產(chǎn)非正常性種子的植物和需要以營養(yǎng)體繁殖的農(nóng)作物長期安全保存的唯一途徑，是珍稀瀕危植物長期保存的重要手段。由于柑橘產(chǎn)業(yè)的重要性，對于Citrus屬和Poncirus屬的超低溫保存研究很多。超低溫保存的外植體主要包括胚軸和莖尖。由于富民枳現(xiàn)有植株數(shù)量很少，果實(shí)和種子數(shù)量非常有限。離體莖尖是目前進(jìn)行富民枳超低溫保存的唯一可行的外植體類型。
[0004]迄今，未見有富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法。包括富民枳試管苗的節(jié)段培養(yǎng)、離體莖尖的超低溫保存和再生試管苗的生根和移栽技術(shù)。本發(fā)明為富民枳種質(zhì)資源的長期安全保存提供了一種簡單、高效和穩(wěn)定的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0007]富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，包括下述步驟:
[0008](I)材料獲取，取富民枳莖尖，通過莖尖培養(yǎng)獲得試管苗，然后通過節(jié)段培養(yǎng)獲得擴(kuò)繁富民枳試管苗，在解剖鏡下進(jìn)行莖尖切割；在解剖鏡下切割莖尖；
[0009](2)加載處理，將莖尖在加載溶液中，25°C下處理20分鐘；
[0010](3)植物微滴玻璃化處理，將莖尖轉(zhuǎn)入預(yù)冷的PVS2溶液，在冰上處理20-40分鐘；
[0011](4)超低溫保存，將經(jīng)過PVS2處理的莖尖轉(zhuǎn)移到無菌鋁箔條上并插入液氮，待降溫過程完成后轉(zhuǎn)入凍存管并進(jìn)入液氮罐保存；
[0012](5)解凍和卸載處理，將鋁箔條從液氮中移出并直接轉(zhuǎn)入卸載溶液，在25°C下處理20分鐘；
[0013](6)恢復(fù)培養(yǎng),將解凍后的莖尖轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
[0014]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述節(jié)段培養(yǎng)是將試管苗節(jié)段接種在添加0.Smgr1BA^0.Zmgr1IBA和3(^171蔗糖的WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，在以上培養(yǎng)基中富民枳節(jié)段在4周內(nèi)形成試管苗。
[0015]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述莖尖切割是選高度5cm的富民枳試管苗，在體視顯微鏡下切割長度為2mm的莖尖，轉(zhuǎn)入添加30gL-l蔗糖的WPM培養(yǎng)基上待用。
[0016]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述加載處理和微滴玻璃化是將莖尖轉(zhuǎn)入凍存管中加入加載溶液，在25°C下處理20分鐘，所述加載溶液的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖，在加載溶液處理結(jié)束以后，用冰上預(yù)冷的PVS2溶液替換加載溶液，并在冰上處理20-40分鐘，PVS2溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加30% (w/V)甘油、15% (w/v)乙二醇、15% (w/v)DMS0 和 0.4M 鹿糖。
[0017]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述超低溫保存是在PVS2處理結(jié)束前I分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液轉(zhuǎn)到無菌鋁箔條上，在PVS2處理結(jié)束后，將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮中30分鐘。
[0018]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述解凍和卸載處理是將鋁箔條從液氮中取出，快速插入卸載溶液里，在25°C下處理20分鐘，卸載溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖。
[0019]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述恢復(fù)培養(yǎng)是將在卸載溶液處理結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)基的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加30gL-l蔗糖、1.0mgIZ1BA和SgIZ1Phytagel,恢復(fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)。
[0020]與傳統(tǒng)的Citrus屬和Poncirus屬植物玻璃化超低溫保存方法相比,本發(fā)明的技術(shù)方案中超低溫保存莖尖的存活率和再生率更高，解凍后的莖尖在恢復(fù)培養(yǎng)階段生長更為迅速。在保持高再生率的情況下，去掉了傳統(tǒng)方法中必須的預(yù)培養(yǎng)階段。本發(fā)明方法簡便易行、穩(wěn)定性高、高效可靠；超低溫保存莖尖解凍后再生率達(dá)到90%以上；超低溫保存莖尖再生的植株生根狀況良好，移栽后生長狀態(tài)穩(wěn)定。

【專利附圖】

【附圖說明】
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[0021]圖1PVS2處理時(shí)間對超低溫保存富民枳莖尖再生率的影響。
[0022]圖2玻璃化途徑中PVS2處理時(shí)間對存活率和再生率的影響。
[0023]圖3富民枳超低溫保存莖尖的再生情況。(al)微滴玻璃化超低溫保存莖尖存活但不再生長(標(biāo)尺為0.5mm)。(a2-3)微滴玻璃化超低溫保存莖尖再生為試管苗(標(biāo)尺為0.5mm)。(bl)玻璃化超低溫保存莖尖存活但不再生長(標(biāo)尺為0.5mm)。(b2_3)
[0024]玻璃化超低溫保存莖尖再生為試管苗(標(biāo)尺為0.5mm)。
[0025]圖4IBA濃度對富民枳試管苗生根的影響。將長度約3厘米的富民枳試管苗轉(zhuǎn)入添加添加SOgr1蔗糖、SgL—1活性炭、3g r 1Phytagel和不同濃度IBA的WPM培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)6周時(shí)統(tǒng)計(jì)生根率。
[0026]圖5超低溫保存富民枳莖尖再生和移栽情況。a由超低溫保存莖尖重新建立起來的試管苗(標(biāo)尺為Icm)。b試管苗生根情況(標(biāo)尺為Icm)。C生根植株移栽后I年(標(biāo)尺為 2cm)。

【具體實(shí)施方式】
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[0027]下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
[0028]實(shí)施例1:
[0029]1、試管苗的節(jié)段培養(yǎng)。
[0030]取富民枳(Poncirus polyandra)莖尖，通過莖尖培養(yǎng)獲得試管苗，然后將試管苗節(jié)段接種在添加0.Smgr1BA^0.2mgr1IBA和3(^171蔗糖的WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁。在以上培養(yǎng)基中富民枳節(jié)段可在4周內(nèi)形成試管苗。
[0031]2、莖尖切割。
[0032]選取高度約5cm的富民枳試管苗，在體視顯微鏡下切割長度約為2_的莖尖，轉(zhuǎn)入添加SOgL-1蔗糖的WPM培養(yǎng)基上待用。
[0033]3、微滴玻璃化超低溫保存。
[0034]將10個(gè)莖尖轉(zhuǎn)入凍存管中加入ImL loading solut1n溶液，在25°C下處理20分鐘。Loading solut1n溶液的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M鹿糖。在loadingsolut1n溶液處理結(jié)束以后，用ImL冰上預(yù)冷的PVS2溶液替換loading solut1n溶液，并在冰上處理一定的時(shí)間。PVS2溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加30% (w/v)甘油、15% (w/V)乙二醇、15% (w/v)DMS0和0.4M蔗糖。在PVS2處理結(jié)束前I分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液(15 μ L)轉(zhuǎn)到一個(gè)8 X 25mm的無菌鋁箔條上。在PVS2處理結(jié)束后，用一把細(xì)鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮中至少30分鐘。解凍時(shí)，將鋁箔條從液氮中取出，并快速插入6厘米直徑培養(yǎng)皿中的10mT, unloading solut1n 溶液里，并在 25°C下處理 20 分鐘。Unloading solut1n 溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖。在unloading solut1n溶液處理結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基?；謴?fù)培養(yǎng)基的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加SOgr1蔗糖、1.0mg^1BA和3gL^ 1Phytagelο恢復(fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)。
[0035]本發(fā)明中，測試了微滴玻璃化途徑中PVS2在(TC分別處理20、30和40分鐘對超低溫保存莖尖的存活率和再生率的影響。結(jié)果表明20、30和40分鐘PVS2對應(yīng)的存活率分別為 88.3%,90.0%和 83.3% (圖1);再生率分別為 75.0%,78.3%和 73.3% (圖1)?？梢姵蜏乇４媲o尖在20-40分鐘PVS2處理下都保持了非常高的存活率。
[0036]圖1顯示了 PVS2處理時(shí)間對超低溫保存富民枳莖尖再生率的影響。莖尖切割后在WPM半固體培養(yǎng)基上過夜。將裝載處理后的莖尖轉(zhuǎn)入PVS2在冰上處理一定的時(shí)間，PVS2處理結(jié)束后將莖尖轉(zhuǎn)入鋁箔條進(jìn)行液氮處理，解凍時(shí)直接將鋁箔天轉(zhuǎn)入卸載溶液進(jìn)行處理。
[0037]4、微滴玻璃化法和玻璃化法的比較。
[0038]玻璃化法的處理程序如下所述。將10個(gè)莖尖轉(zhuǎn)入凍存管中加入ImL loadingsolut1n溶液，在25°C下處理20分鐘。Loading solut1n溶液的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖。在loading solut1n溶液處理結(jié)束以后，用ImL冰上預(yù)冷的PVS2溶液替換loading solut1n溶液，并在冰上處理30分鐘。PVS2溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、15% (w/v)DMSO和(λ 4M蔗糖。在PVS2處理結(jié)束后，將凍存管直接插入液氮保存。解凍時(shí)，將凍存管從液氮中取出，在40°C水浴中解凍2分鐘。解凍完成后，用移液槍移掉凍存管中的PVS2并加入ImL unloading solut1n溶液，并在25°C下處理20分鐘。Unloading solut1n溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖。在unloading solut1n溶液處理結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基?；謴?fù)培養(yǎng)基的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加SOgL-1蔗糖、1.0mgL-1BA和3gL_ 1Phytagel?；謴?fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)。
[0039]本發(fā)明測試了玻璃化途徑(vitrificaitonusing Cryotubes)中 PVS2 在 0°C分別處理20、30和40分鐘對超低溫保存莖尖的存活率和再生率的影響。結(jié)果表明20、30和40分鐘？￥52對應(yīng)的存活率分別為91.7%、96%和91.7% (圖2);再生率分別為50.0%、54.0%和50.0% (圖2)。在玻璃化超低溫保存中，PVS2處理時(shí)間在20-40分鐘之間時(shí)莖尖的存活率都高于90%，且相互之間沒有顯著差異。莖尖的再生率在20-40分鐘之間也沒有顯著差異，但都顯著性的低于存活率?？梢娫诓ＡЩ蜏乇４嬷校薪咏?0%的莖尖能夠存活下來，但不能再生為試管苗。這一結(jié)果與微滴玻璃化的結(jié)果差異較大。
[0040]圖2顯示了玻璃化途徑中PVS2處理時(shí)間對存活率和再生率的影響的。莖尖切割后在WPM半固體培養(yǎng)基上過夜。對滲透保護(hù)后的莖尖轉(zhuǎn)入PVS2在O °C下處理30分鐘。PVS2
[0041]處理結(jié)束后，莖尖分別按照玻璃化程序進(jìn)行液氮處理和解凍。
[0042]5、富民枳超低溫保存莖尖存活和再生情況
[0043]液氮處理以后，存活的莖尖表現(xiàn)為頂端分生組織存活和生長；莖尖其他部分細(xì)胞死亡并變?yōu)榘咨?圖3)。莖尖存活以恢復(fù)培養(yǎng)6周時(shí)莖尖表現(xiàn)綠色為標(biāo)志。莖尖再生以恢復(fù)培養(yǎng)6周時(shí)莖尖表現(xiàn)明顯伸長為標(biāo)志。微滴玻璃化和玻璃化超低溫保存的莖尖都有存活但不再生長的情況(圖3al，bl)。超低溫保存莖尖再生的植株經(jīng)過繼代培養(yǎng)可以重新建立試管苗培養(yǎng)體系(圖5a)。
[0044]6、富民枳試管苗生根情況。
[0045]從繼代4周的試管苗中選取生長良好,長度約3厘米的試管苗(in vitro shoots)用于生根實(shí)驗(yàn)。將其基部用手術(shù)刀切割，保持切面整齊；轉(zhuǎn)入不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根實(shí)驗(yàn)。每個(gè)組培瓶中添加50mL生根培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入2株試管苗。生根培養(yǎng)基:1.添加3(^171蔗糖、SgL—1活性炭和3gL^ 1Phytagel的WPM培養(yǎng)基。2.添加3(^171蔗糖、SgL—1活性炭、
0.SmgL4 IBA 和 SgIZ1Phytagel 的 WPM 培養(yǎng)基。3.添加 3(^171 鹿糖、3gL-1 活性炭、5.0mgL4IBA和 3gL 1Phytagel 的 WPM 培養(yǎng)基。
[0046]不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基對試管苗生根的影響。所有的生根培養(yǎng)基都添加了活性炭。在不添加IBA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，大約7.5%的試管苗生根(圖4)。當(dāng)在生根培養(yǎng)基中添加了 2.46 μ M IBA時(shí)，生根率上升到了 15%。而當(dāng)IBA濃度進(jìn)一步提高到24.6 μ M時(shí)，生根率進(jìn)一步提高到了 37.5% (圖4)。試管苗在通常情況下產(chǎn)生1-2條根(圖5b)，隨在生根培養(yǎng)基的時(shí)間推移，生根率逐漸增高。生根植株在高度約為1cm可以移栽入溫室環(huán)境，移栽成功率接近100%。移栽入溫室的植株生長正常，旺盛(圖5c)。
【權(quán)利要求】
1.富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，包括下述步驟: (1)材料獲取:取富民枳莖尖，通過莖尖培養(yǎng)獲得試管苗，然后通過節(jié)段培養(yǎng)獲得擴(kuò)繁的富民枳試管苗，在解剖鏡下進(jìn)行莖尖切割； (2)加載處理:將莖尖在加載溶液中，25°C下處理20分鐘； (3)微滴玻璃化處理:將步驟(2)處理后的莖尖轉(zhuǎn)入預(yù)冷的PVS2溶液，在冰上處理20-40分鐘； (4)超低溫保存:將經(jīng)過PVS2處理的莖尖轉(zhuǎn)移到無菌鋁箔條上并插入液氮，待降溫過程完成后轉(zhuǎn)入凍存管并進(jìn)入液氮罐保存； (5)解凍和卸載處理:將鋁箔條從液氮中移出并直接轉(zhuǎn)入卸載溶液，在25°C下處理20分鐘； (6)恢復(fù)培養(yǎng):將解凍后的莖尖轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述步驟(1)中的節(jié)段培養(yǎng)是將試管苗節(jié)段接種在添加0.SmgL^BA.0.2mgr1IBA和3(^171蔗糖的WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁。
3.如權(quán)利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述步驟(1)中的莖尖切割是選高度5cm的富民枳試管苗，在體視顯微鏡下切割長度為2mm的莖尖，轉(zhuǎn)入到添加3(^171蔗糖的WPM培養(yǎng)基上待用。
4.如權(quán)利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述步驟(2)和(3)中的加載處理和微滴玻璃化是將莖尖轉(zhuǎn)入凍存管中加入加載溶液，在25°C下處理20分鐘，所述加載溶液的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2M甘油和0.4M蔗糖，在加載溶液處理結(jié)束以后，用冰上預(yù)冷的PVS2溶液替換加載溶液，并在冰上處理20-40分鐘，PVS2溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、15% (w/v)DMS0和0.4M蔗糖。
5.如權(quán)利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述步驟(4)的超低溫保存是在步驟(3)的PVS2處理結(jié)束前1分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液轉(zhuǎn)到無菌鋁箔條上，在PVS2處理結(jié)束后，將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)，將鋁箔條轉(zhuǎn)入放置在液氮中的凍存管，并保持在液氮中30分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述步驟(5)的解凍和卸載處理是將鋁箔條從液氮中取出，快速插入卸載溶液里，在25°C下處理20分鐘，卸載溶液的組成是WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1.2M蔗糖。
7.如權(quán)利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特征在于所述步驟(6)的恢復(fù)培養(yǎng)是將卸載處理結(jié)束后，將莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)基的組成為WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加SOgI/1鹿糖、1.0mgL_1BA和SgL—Phytagel,恢復(fù)培養(yǎng)的前7天為暗培養(yǎng)。
【文檔編號】A01N3/00GK104336009SQ201410628073
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】李唯奇, 林亮, 馬俊超 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所