專利名稱：益生元低聚半乳糖在治療腸炎中的應(yīng)用的制作方法
益生元低聚半乳糖在治療腸炎中的應(yīng)用本發(fā)明涉及 低聚糖、特別是不能消化的低聚糖組合物在預(yù)防或治療炎癥、特別是 預(yù)防或治療腸炎中的應(yīng)用。所述組合物包含低聚半乳糖混合物。低聚半乳糖是不能消化的 碳水化合物，其對(duì)哺乳動(dòng)物胃腸道消化酶具有抗性，但被特異性結(jié)腸菌發(fā)酵。人腸菌群包含致病性的、良性的和有益的微生物屬。前者占優(yōu)勢(shì)可以導(dǎo)致急性的 (例如胃腸炎)和慢性的(例如炎性腸病和一些腸癌)的腸紊亂。已經(jīng)嘗試了通過(guò)向適合 的食品媒介物中添加一種或多種這種微生物菌株來(lái)影響腸菌群平衡，從而有利于有益微生 物例如雙歧桿菌。這種活的微生物食品添加劑稱作益生菌(probiotic)。然而，難以確?；?細(xì)菌在食品中存活并且在消化后也存活。腸微生物菌群的膳食操作的一個(gè)替代性手段是應(yīng)用益生元(prebiotic)，其定義 為不能消化的食物成分，它通過(guò)選擇性刺激結(jié)腸中的一種或有限數(shù)量的細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或 活性而有益地影響宿主，由此導(dǎo)致宿主健康改善。已經(jīng)證實(shí)益生元在多種炎性病況例如炎性腸病(IBD)中具有間接保護(hù)效應(yīng)。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些IBD患者中，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對(duì)共生腸菌群具有高應(yīng)答性(參見(jiàn)Guarner F, Malagelada JR, Best Pract. Res. Clin. GatroenteroL. (2003) ；17 ；793-804)。因此， 益生元已經(jīng)被用于促進(jìn)有助于預(yù)防疾病復(fù)發(fā)的有益的腸微生物菌群(參見(jiàn)Sartor RD.， Gastroenterology. (2004)，126，1620—1633)。分類為益生元的一組化合物是低聚半乳糖。它們是包含半乳糖的形式為 Glc β 1-4[Gal β 1-6]η的低聚糖，其中η = 2-5,通過(guò)使用β -半乳糖苷酶的半乳糖基轉(zhuǎn) 移酶活性由乳糖糖漿生產(chǎn)而來(lái)(Crittenden，(1999)Probiotics :A Critical Review, Tannock, G. (ed)HorizonScientific Press, ffymondham,pp 141-156)。EP 1 644 482公開(kāi)了產(chǎn)生將乳糖轉(zhuǎn)化成新的低聚半乳糖混合物的半乳糖苷酶活 性的雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bidifum)新菌株。已經(jīng)證實(shí)這種低聚半乳糖混合物 具有益生元特性并且增加有益細(xì)菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的菌群。目前已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)EP 1 644 482中公開(kāi)的包含低聚半乳糖混合物的組合 物可以直接調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物腸粘膜的炎癥應(yīng)答。特別地，它減弱了存在炎性因子時(shí)的促炎趨 化因子應(yīng)答。本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療炎癥、優(yōu)選預(yù)防或治療炎癥性腸病的益生元組合 物。該益生元組合物是低聚半乳糖混合物。該混合物包含二糖Gal-Gal、三糖 Gal-Gal-Glc、四糖Gal-Gal-Gal-Glc 和五糖Gal-Gal-Gla-Gal-Glc，其中 Gal 表示半乳糖殘 基，Glc表示葡萄糖殘基。優(yōu)選地，低聚半乳糖混合物包含二糖Gal (β 1-3) Glc ；Gal ( β 1-3)-Gal ； Gal ( β 1-6)-Gal ； Gal(α 1-6)-Gal ；三 H Gal(β 1-6) -Gal(β 1-4)-Glc ； Gal ( β 1-3) -Gal ( β 1-4) -Glc ；四糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc 和五糖 Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-4)-Glc。這種低聚半乳糖混合物以名稱 Bimuno (注冊(cè)商標(biāo))進(jìn)行商業(yè)銷售并且可從Clasado Ltd (Milton Keynes, UK)購(gòu)得。
腸細(xì)胞形成單極化上皮層，將腔環(huán)境與宿主隔離開(kāi)。它們是宿主防御的主動(dòng)貢獻(xiàn) 者。其對(duì)任意炎癥刺激的先天免疫應(yīng)答主要負(fù)責(zé)快速再生上皮的屏障功能。如果必要，上皮 可以被誘導(dǎo)表達(dá)促炎細(xì)胞因子和趨化因子，這些促炎細(xì)胞因子和趨化因子開(kāi)始募集針對(duì)受 損粘膜的先天免疫細(xì)胞例如中性粒細(xì)胞的過(guò)程。例如，促炎趨化因子例如IL-8可以在免疫 應(yīng)答過(guò)程中被上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞刺激以募集針對(duì)發(fā)炎粘膜的中性粒細(xì)胞和PMN' s(多 形核白細(xì)胞)。巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)_3α (ΜΙΡ-3 α )或CCL20是另一種趨化因子，其通過(guò) 激活趨化因子受體CCR6而活化淋巴細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，由此觸發(fā)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。IL-8和 ΜΙΡ-3 α (CCL20)誘導(dǎo)指示針對(duì)炎癥攻擊的應(yīng)答程度。已經(jīng)研究了稱作Bimimo的低聚半乳糖混合物對(duì)不同成人結(jié)腸細(xì)胞培養(yǎng)物模型的 炎癥應(yīng)答的效應(yīng)。令人意外地發(fā)現(xiàn)，Bimimo在生理濃度時(shí)可減弱腸上皮細(xì)胞即人腸細(xì)胞中 TNF-α炎癥刺激誘導(dǎo)的促炎趨化因子應(yīng)答。還發(fā)現(xiàn)Bimuno減少NF-κ B ρ65蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位，由此可以用于治療例如哮喘、神經(jīng) 變性、局部缺血/再灌注損傷、肝炎、腎小球性腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏反應(yīng)、II型糖尿 病、肥胖、膿毒癥、自身免疫癥、多發(fā)性硬化和動(dòng)脈粥樣硬化這樣的疾病。稱作Bimimo的低聚半乳糖組合物是低聚半乳糖混合物的凍干粉末。Bimuno包含 49% w/w的低聚半乳糖。組合物的其余部分可能包含非活性成分例如葡萄糖、乳糖、阿拉伯 樹(shù)膠和檸檬酸?？梢詫?duì)患有炎性病癥例如腸炎病癥的患者每日給予在2. 75-20g粉末中的 1. 35g-9. 6g低聚半乳糖有效劑量，優(yōu)選在4-10g粉末中的1. 96-4. 9g低聚半乳糖，最優(yōu)選在 5. 5g粉末中的2. 7g低聚半乳糖。這可以通過(guò)采用一次單劑量或間隔幾小時(shí)的兩次分開(kāi)劑 量的形式來(lái)施用?？梢詫imimo產(chǎn)品添加到熱飲中或噴灑在食物上。為了預(yù)防炎癥，可以對(duì)個(gè)體給予2_15g、優(yōu)選2.5-10g、最優(yōu)選5.5g的有效日劑量。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了治療和/或預(yù)防炎癥例如腸炎的方法，包含對(duì)哺乳 動(dòng)物口服給予有效量的低聚糖組合物。通過(guò)參照如下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。

圖1顯示B-GOS對(duì)T84細(xì)胞中TNF- α誘導(dǎo)的IL_8分泌的效果；圖 2 (A)和(B)顯示 B-GOS 對(duì) NCM-460 細(xì)胞中 TNF- α 誘導(dǎo)的 IL-8 和 ΜΙΡ-3 α 分 泌的效果；圖 3 (A)和(B)顯示 B-GOS 對(duì) TNF- α 處理的 NCM-460 細(xì)胞中 IL-8 和 ΜΙΡ-3 α mRNA 表達(dá)的效果；圖 4 (A)、(B)和(C)顯示 B-GOS 對(duì) TNF- α 處理的 NCM-460 細(xì)胞中 NF- κ B ρ65 蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入核的效果；圖5和6顯示B-GOS對(duì)NCM-460細(xì)胞中TNF- α誘導(dǎo)的IL-8分泌的效果；且圖7 (A)禾Π⑶顯示B-GOS對(duì)DSS處理的小鼠中IL_6和MIP-2分泌的效果。實(shí)施例1低聚半乳糖對(duì)細(xì)胞因子分泌的效果使腸上皮細(xì)胞在孔培養(yǎng)板上從切105個(gè)細(xì)胞/mL的起始濃度生長(zhǎng)至匯合。當(dāng)細(xì) 胞達(dá)到70%匯合率時(shí)，如下一式四份處理它們(i)陰性對(duì)照；(ii) TNF-α (10ng/mL)陽(yáng)性 對(duì)照；(iii)B-GOS(5g/L)和(iv)TNF-α (10ng/mL)與 B-GOS(5g/L)。使用 5g/L 的低聚糖濃 度，因?yàn)檫@是在人乳中發(fā)現(xiàn)的低聚糖生理濃度。16小時(shí)后，采集上清液并且貯存在-20°C，以便隨后通過(guò)ELISA測(cè)定IL-8和ΜΙΡ-3 α的分泌。在下列實(shí)驗(yàn)中，TNF- α被ILl β或鞭 毛蛋白替代。IL-8 的定量。按照以前的描述(Claud EC, Savidge Τ, Walker WA2003Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8secretion byhuman milk factors. Pediatr Res 53 :419-425),通過(guò)ELISA測(cè)定IL-8的濃度。簡(jiǎn)言之，用IOOyL 3yg/mL小鼠抗人 IL-8 單克隆抗體將 96-孔高結(jié)合培養(yǎng)板(Nunc Immulon, Fisher Scientific,Middletown, VA, USA)的各孔包被過(guò)夜，用200 μ L的1 % BSA的PBS溶液洗滌三次，與100 μ L樣品一起 在37°C孵育1小時(shí)。然后將各孔洗滌三次，與IOOyL 0. 1 μ g/mL生物素-標(biāo)記的小鼠抗 人IL-8抗體一起孵育1小時(shí)。再次洗滌后，將各孔與100 μ L辣根過(guò)氧化物酶一起孵育，再 次洗滌，然后與100 μ L鄰苯二胺二鹽酸鹽和過(guò)氧化氫一起孵育。用100 μ L 2NH2S04終止反 應(yīng)，在490nm讀取吸收度。根據(jù)IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的IL-8濃度。ΜΙΡ-3 α的定量。按照與IL-8類似的方式通過(guò)ELISA測(cè)定ΜΙΡ-3 α分泌的量，不 同之處在于用100 μ L 2.0 μ g/mL小鼠抗人ΜΙΡ-3 α單克隆抗體將培養(yǎng)板包被過(guò)夜。將檢 測(cè)抗體即生物素-標(biāo)記的小鼠抗人ΜΙΡ-3 α抗體以50ng/mL的濃度、100 μ L的體積用作檢 測(cè)抗體。根據(jù)MIP-3ci標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的MIP-3ci濃度。細(xì)胞存活測(cè)定。使用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)研究B-GOS的細(xì)胞毒性。使NCM-460細(xì)胞在 蓋玻片上從hio5個(gè)細(xì)胞/mL的起始濃度開(kāi)始生長(zhǎng)。用B-G0S(5g/L)或?qū)φ张囵B(yǎng)基一式三 份處理細(xì)胞。16小時(shí)后，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)測(cè)定NCM-460細(xì)胞的細(xì)胞活力(Raimon di F， CrivaroV,Capasso L,Maiuri L,Santoro P,Tucci M,Barone MV,PappacodaS,Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinalepithelial barrier function in a human-derived in vitro model. PediatrRes 60 :30-33) 。B—G0S的活力沒(méi)有顯著性效果。B-GOS對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的效果。使NCM-460細(xì)胞在6_孔培養(yǎng)板上從切105個(gè) 細(xì)胞/mL的起始濃度生長(zhǎng)至匯合。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%匯合率時(shí)，如下一式四份處理它們(i) 陰性對(duì)照；(ii) TNF-α或ILl β或鞭毛蛋白(lOng/mL)陽(yáng)性對(duì)照；和(iii)TNF-a或ILl β 或鞭毛蛋白(lOng/mL)與B_G0S(5g/L)。18小時(shí)后，通過(guò)"Trizol-氯仿萃取分離總細(xì)胞RNA。 使用 Superscript III 鉬 SYBR Green One-Step qRT-PCR 試劑盒，在 MJ Opticon 2 上測(cè)定 IL-8、ΜΙΡ-3 α和MCP-I的mRNA表達(dá)，并且以GAPDH的mRNA表達(dá)進(jìn)行校準(zhǔn)。B-GOS對(duì)NF- κ B轉(zhuǎn)位的效果。使NCM-460細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)至70%匯合率，如 下一式兩份將它們處理10或30分鐘⑴陰性對(duì)照；(ii) TNF-a (10ng/mL)陽(yáng)性對(duì)照；和 (iii)TNF-a (10ng/mL)與B-G0S (5g/L)。除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中。用甲 醇透化并且用0. 25% BSA的TBS溶液中的10%山羊血清封閉后，用家兔抗人NF- κ B ρ65 多克隆抗體探查細(xì)胞。洗滌后，將細(xì)胞與CyTM 3-綴合的山羊抗家兔抗體一起孵育。然后 洗滌蓋玻片并且固定在載玻片上以便在顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-S)下觀察。材料TNF-α細(xì)胞因子、ILl β、鞭毛蛋白、鏈霉抗生物素-HRP和人CCL20_MIP_3 a ELISA 顯色試劑盒(Quantikine)獲自 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 抗人 IL-8 和小鼠抗 人 IL-8 抗體獲自 PierceEndogen (ffoburn,MA, USA)。鄰苯二胺片獲自 Pierce (Rockford, IL, USA)。Trizol,SuperScript III 鉬 SYBR Green One-Step qRT-PCR 試劑盒和其他 qRT-PCR所必需的試劑獲自Invitrogen(Carlskid，CA, USA)。DMEM/F12培養(yǎng)基、CMRL培養(yǎng)基、青 霉素、鏈霉素和H印es緩沖劑獲自GibcoHnvitrogen (Carlskid，CA, USA)。胎牛血清獲自 Atlanta Biologicals (Lawren ceville, GA, USA)。M3D 獲自 Incell Corp. (San Antonio, TX, USA) ο 家兔抗人 NF-κ B (p65)多克隆抗體獲自 Calbiochem (Gibbstown，NJ，USA)。CyTM 3-綴合的F(ab ' )2 片段山羊抗家兔 IgG獲自 Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA, USA)。所有其他用于免疫熒光法的試劑獲自Vector Lab (Bur Iingame，CA，USA)。所有其他 試劑具有分析或分子生物學(xué)等級(jí)，獲自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。B-低聚半乳糖 B-GOS。BimunO 由 Clasado Ltd.，Milton Keynes, UK 提供。腸上皮細(xì)胞系。兩種成年人腸上皮培養(yǎng)物模型用于這些研究T84和NCM-460細(xì) 胞分別是轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的結(jié)腸上皮細(xì)胞。在37°C與水蒸汽飽和的95% O2和5% CO2氣體 環(huán)境中在i^alcon細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞。T84培養(yǎng)基由補(bǔ)充了 FBS (5% )、!fepes緩沖液、 谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素和鏈霉素的DMEM/F12組成(1 。NCM-460培養(yǎng)基由補(bǔ)充 了 FBS(10% )、青霉素和鏈霉素的M3D培養(yǎng)基組成，如以前所述(13)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將細(xì)胞因子的誘導(dǎo)針對(duì)陽(yáng)性對(duì)照校準(zhǔn)，其中誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SE)。使用雙尾Mudent t檢驗(yàn)在組之間進(jìn)行比較。將通過(guò)qRT-PCR得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù) 表示為平均值與SE。在進(jìn)行對(duì)數(shù)變換后使用雙尾Mudent t檢驗(yàn)在組之間進(jìn)行比較。ρ值<0. 05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性并且以星號(hào)(女)表示，ρ值< 0. 01以兩個(gè)星號(hào)(* * ) 表示，P值< 0. 001以三個(gè)星號(hào)(* * * )表示。結(jié)果低聚半乳糖B-GOS對(duì)Τ84細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的效果(圖1)將Τ84細(xì)胞中TNF- α -誘導(dǎo)的IL-8分泌校準(zhǔn)為100%，以便能夠在4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn) 之間進(jìn)行比較。未處理的Τ84細(xì)胞具有20. 5%的基礎(chǔ)IL-8分泌。在TNF-α刺激后，IL-8 分泌顯著增加4. 9倍(ρ < 0. 001)。為了測(cè)定B-GOS的效果，在低聚半乳糖B-GOS (5g/L)存在的情況下，用或不用 TNF- α刺激Τ84細(xì)胞。B-G0S處理的Τ84細(xì)胞分泌IL-8的水平為16. 4%。這一結(jié)果與未 處理的Τ84細(xì)胞的基礎(chǔ)水平?jīng)]有顯著差異。當(dāng)用TNF-α刺激后，B-GOS將IL-8分泌顯著 減弱了 38. 5% (ρ < 0. 001)。低聚半乳糖B-GOS對(duì)NCM-460細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的效果(圖2、圖5、圖6)將NCM-460細(xì)胞中TNF- α -誘導(dǎo)的IL-8和ΜΙΡ-3 α分泌校準(zhǔn)為100 %，以便能 夠在4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行比較。未處理的NCM-460細(xì)胞分別具有1. 7%和4. 0%的基礎(chǔ) IL-8和ΜΙΡ-3 α分泌。在TNF- α刺激后，IL_8和ΜΙΡ-3 α分泌分別顯著增加58. 8倍(ρ<0. 001)(圖 2Α)和 25. 0 倍(ρ < 0. 001)(圖 2Β)。為了測(cè)定B-GOS的效果，在低聚半乳糖B-GOS (5g/L)存在的情況下，用或不用 TNF- α刺激NCM-460細(xì)胞。經(jīng)B-GOS處理的NCM-460細(xì)胞分別分泌1. 1 %禾口 3. 9%的IL-8 和ΜΙΡ_3α ；這一結(jié)果與未處理的NCM-460細(xì)胞的基礎(chǔ)水平?jīng)]有顯著差異。當(dāng)用TNF-α刺 激后，B-GOS將IL-8和ΜΙΡ-3 α分泌分別顯著減弱了 43. 5% (ρ < 0. 001)(圖2Α)和52. 1% (P < 0. 05)(圖2Β)。按照相同方式，當(dāng)在TNF- α刺激前用B-GOS預(yù)洗滌NCM-460細(xì)胞時(shí)， 甚至在不存在B-GOS的情況下，IL8分泌也顯著減少了 32% (ρ < 0. 001)(圖6)。這啟示 B-GOS混合物的成分與上皮受體例如toll-樣受體(TLR)發(fā)生相互作用以防止細(xì)胞的炎癥刺激。類似地，在用鞭毛蛋白刺激后，B-GOS將IL-8分泌顯著減弱了 21. 5% (ρ < 0. 05) (圖5)。在用ILl β刺激后未觀察到效果。為了測(cè)定B-GOS是否具有細(xì)胞毒性，將NCM-460細(xì)胞與或不與B-GOS —起孵育16 小時(shí)。如通過(guò)方法中所述臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)測(cè)定的，B-GOS不影響細(xì)胞活力。低聚半乳糖B-GOS對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的效果(圖3)分離經(jīng)TNF- α處理的NCM-460細(xì)胞的總RNA，并且通過(guò)qRT_PCR測(cè)定IL_8、 ΜΙΡ-3 α和MCP-ImRNA表達(dá)。在用TNF- α刺激后，IL-8和ΜΙΡ-3 α mRNA表達(dá)分別顯著增加 了 12. 2倍(ρ < 0. 001)(圖3A)和99. 4倍(ρ < 0. 001)(圖3Β)。在任意處理之間未觀察到 MCP-ImRNA表達(dá)的改變(p = 0. 19)(數(shù)據(jù)未顯示)。為了測(cè)定B-GOS的效果，在B-GOS (5g/ L)存在的情況下，用TNF- α刺激NCM-460細(xì)胞。低聚半乳糖B-GOS顯著減弱了 TNF- α -誘 導(dǎo)的 IL-8 和 ΜΙΡ-3 α mRNA 表達(dá)，分別為 5. 7 倍(ρ < 0. 05)(圖 3Α)和 58. 9 倍(ρ < 0. 05) (圖:3B)。B-GOS減少了 MCP-ImRNA表達(dá)，但未達(dá)到顯著性(p = 0. 06)(數(shù)據(jù)未顯示)。低聚半乳糖B-GOS對(duì)NF- κ B轉(zhuǎn)位的效果(圖4)用TNF- α (10ng/mL)處理成年結(jié)腸NCM-460細(xì)胞并且測(cè)定NF- κ B ρ65蛋白的核 轉(zhuǎn)位。在媒介物處理的對(duì)照組細(xì)胞(圖4Α)中，對(duì)NF-K B ρ65的染色在細(xì)胞質(zhì)中占優(yōu)，而 核不含Ρ65蛋白。在用TNF- α刺激30分鐘后，NF- κ B ρ65清楚地轉(zhuǎn)位入核(圖4Β)。然而，在B-GOS存在的情況下，TNF- α -誘導(dǎo)的NF- κ B轉(zhuǎn)位在30分鐘時(shí)受到部分 抑制(圖4C)。實(shí)施例2B-GOS在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中的效果的體內(nèi)研究材料方法兩組(各 η = 24)成年 C57BL/6 小鼠(Jackson Laboratories, BarHarbour, ME, USA)、即常規(guī)飼養(yǎng)的(CR)和缺乏細(xì)菌的(BD)小鼠用于誘導(dǎo)結(jié)腸炎。使全部動(dòng)物居住在12 小時(shí)光照/黑暗循環(huán)中并且可以隨意取到小鼠食物和水。在6周齡時(shí)，使常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠居住在具有未處理水的常規(guī)條件下(CR組)，而 給BD組中的小鼠飼喂在其飲用水中的抗生素混合物2周?？敲顾?8mg/ml)、慶大霉素 (0. 7mg/ml)、多粘菌素(34，000U/ml)、甲硝唑(4. 3mg/ml)和萬(wàn)古霉素(0. 9mg/ml)構(gòu)成抗生 素混合物中?；谀挲g組消耗的平均水量計(jì)算抗生素在水中的濃度。在8周齡時(shí)，通過(guò)在兩組(CR和BD)的全部小鼠中飼喂在飲用水中的3. 5% DSS(葡 聚糖硫酸鈉)(MP Biomedicals, Aurora, OH, USA) 5天誘導(dǎo)腸的結(jié)腸炎。在10周齡時(shí)，每組 半數(shù)的小鼠開(kāi)始接受Bimimo (5g/L) 7天。在第10周結(jié)束時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死并且采集其 結(jié)腸用于分析。細(xì)胞因子測(cè)定根據(jù)制造商的說(shuō)明(Quantikine，R&D Systems, MN, USA)通過(guò)ELISA分析結(jié)腸組 織勻漿物中的鼠IL-6和MIP-2細(xì)胞因子。簡(jiǎn)言之，采集各組的近側(cè)結(jié)腸并且用包含補(bǔ)充 了蛋白酶抑制劑混合物的Triton X-100的PBS勻漿緩沖液進(jìn)行勻漿。將勻漿溶液以 12，OOOrpm離心lOmin，并且將上清液分成等分部分且貯存在_70°C。結(jié)果
測(cè)定兩組小鼠(CR和BD)與對(duì)照組小鼠(無(wú)Bimuno給藥)相比Bimuno減輕DSS 結(jié)腸炎的損傷和炎癥的能力。
在常規(guī)的DSS-處理的小鼠中，IL-6和MIP-2分泌分別被顯著誘導(dǎo)了 2. 2 (ρ<0. 0001)和 8. 3 倍(P < 0. 0001)。Bimuno 顯著減弱了 IL-6 和 ΜΙΡ-2 分泌達(dá) 6. 6 (ρ<0. 0001)和 5. 5 倍(ρ < 0. 0001)。在經(jīng)DSS-處理的BD小鼠中，IL-6和ΙΡ-2分泌分別被顯著誘導(dǎo)了 6. 2 (ρ<0. 0001)和 27. 2 倍(P = 0. 0005)。Bimuno 顯著減弱 了 IL-6 分泌達(dá) 3. 6 倍(ρ < 0. 0001)。 ΜΙΡ-2分泌被減少了 1. 3倍，但發(fā)現(xiàn)該結(jié)果無(wú)顯著性(ρ = 0. 126)。總之，常規(guī)的經(jīng)DSS-處理的小鼠與未處理組相比發(fā)生結(jié)腸炎。經(jīng)DSS-處理且補(bǔ) 充了 Bimuno的常規(guī)小鼠中炎癥標(biāo)志物(IL-6和ΜΙΡ-2)顯著減少且結(jié)腸炎癥狀緩解。在缺 乏細(xì)菌的經(jīng)DSS-處理的小鼠中觀察到相同效果。這意味著所觀察到的因Bimuno導(dǎo)致的炎 癥減輕并非通過(guò)微生物菌群介導(dǎo)。Bimimo對(duì)DSS結(jié)腸炎中腸上皮具有直接的免疫調(diào)節(jié)效果。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防或治療炎癥的低聚糖組合物。
2.權(quán)利要求1的低聚糖組合物，其中包含益生元低聚糖混合物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中包含低聚半乳糖混合物。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述低聚半乳糖混合物包含二糖Gal-Gal、三糖 Gal-Gal-Glc、四糖 Gal-Gal-Gal-Glc 和五糖 Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述低聚半乳糖混合物包含二糖Gal(i3l-3)-Glc、 Gal (β 1-3)-Gal，Gal ( β 1—6)—Gal、Gal ( α 1-6) -Gal ；三糖 Gal (β 1-6)-Gal (β 1—4)—Glc、 Gal-( β 1-3) -Gal ( β 1-4) -Glc ；四糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc 和五糖 Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1—4)-Glc。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其用于預(yù)防或治療腸炎性病癥。
7.權(quán)利要求6的組合物，其用于預(yù)防或治療腸上皮炎癥。
8.權(quán)利要求6的組合物，其用于預(yù)防或減輕TNF-α(組織壞死因子)誘導(dǎo)的腸上皮細(xì) 胞中的炎癥。
9.權(quán)利要求6的組合物，其用于預(yù)防或減輕TNF-α誘導(dǎo)的人腸細(xì)胞中的炎癥應(yīng)答。
10.治療和/或預(yù)防炎癥的方法，其中包括口服給予哺乳動(dòng)物有效量的低聚糖組合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述組合物是低聚半乳糖混合物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述組合物是低聚半乳糖混合物，該混合物包含二糖 Gal-Gal、三糖 Gal-Gal-Glc、四糖 Gal-Gal-Gal-Glc 和五糖 Gal-Gal-Gal-Gal-Glc。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述組合物是低聚半乳糖混合物，該混合物包含 二 糖 Gal (β 1-3)-Glc、Gal (β 1-3)-Gal、Gal (β 1-6)-Gal、Gal (α 1-6)-Gal ；三糖 Gal (β 1-6)-Gal (β 1—4)—Glc、Gal-(β 1-3)-Gal (β 1—4)-Glc ；四糖 Gal (β 1-6)-Gal (β 1_ 6)-Gal (β 1-4)-Glc 和五糖 Gal ( β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-4)-Glc。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述炎癥是腸上皮的炎癥。
15.權(quán)利要求10的方法，用于預(yù)防或減輕TNF-α(組織壞死因子)誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞 中的炎癥。
16.權(quán)利要求10的方法，用于預(yù)防或減輕TNF-α誘導(dǎo)的人腸細(xì)胞中的炎癥應(yīng)答。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
18.權(quán)利要求10的方法，其中所述組合物包含1.35-9. 6g的低聚糖、優(yōu)選1. 96-4. 9g、 最優(yōu)選2. 7g。
全文摘要
本發(fā)明涉及低聚糖、特別是不能消化的低聚糖組合物在預(yù)防或治療炎癥、特別是腸炎中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/7016GK102046181SQ200980120223
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者F·阿塔納斯奧, G·楚特齊斯, J·伍勒韋克 申請(qǐng)人:科拉薩多公司