一種大鱗副泥鰍良種選育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大鱗副泥鰍良種選育方法。具體而言，該方法包括如下步驟：1）提供12個(gè)與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記；2）選擇親本群體1進(jìn)行電子標(biāo)記并提取DNA；3）采用分子標(biāo)記對親本群體1進(jìn)行基因型篩選并選定親本群體2；4）采用分子標(biāo)記對親本群體2進(jìn)行基因型篩選，分別建立具有不同純合基因型的親本群體3和4；5）以親本群體3和4為繁殖群體，分別進(jìn)行人工繁殖獲得親本群體5和6；6）親本群體5和6之間進(jìn)行雜交并進(jìn)行規(guī)模化繁殖。與傳統(tǒng)育種相比，該方法具有迅速、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，實(shí)用性強(qiáng)、成本低、準(zhǔn)確性高、不受環(huán)境等因素的影響，可擺脫對表型性狀鑒定的依賴，縮短了育種年限，提高了育種效率，極具應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種大鱗副泥鰍良種選育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于魚類育種學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種大鱗副泥鰍良種選育方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大鱗副泥鰍)屬鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，是一種分 布于東南亞地區(qū)的小型淡水底棲魚類，國內(nèi)多分布于四川、浙江、臺灣、遼寧、黑龍江等地。 體近圓筒形，頭較短?？谙挛?，馬蹄形，下唇中央有一小缺口。鼻孔靠近眼，眼下無刺，鰓孔 小。頭部無鱗，體鱗較泥鰍為大。須5對，其中吻須2對，口角須1對，頦須2對，各須均長， 口角須后伸可達(dá)鰓蓋后緣。眼被皮膜覆蓋。尾柄處皮褶棱發(fā)達(dá)，與尾鰭相連。尾柄長與高 約相等。尾鰭圓形。肛門近臀鰭起點(diǎn)。體背部及體側(cè)上半部灰褐色，腹面白色。體側(cè)具有 許多不規(guī)則的黑色褐色斑點(diǎn)。背鰭、尾鰭具黑色小點(diǎn)，其他各鰭灰白色。大鱗副泥鰍肉質(zhì)鮮 美，營養(yǎng)豐富，富含鈣、維生素A、維生素D以及多種蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)，素有"水中人 參"之美譽(yù)，具有較高的食用、藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已發(fā)展成為我國重要的養(yǎng)殖對象，也是我國 出口韓國的主要水產(chǎn)品之一。
[0003] 中國已成為全世界大鱗副泥鰍養(yǎng)殖規(guī)模最大的國家,江蘇省大鱗副泥鰍養(yǎng)殖規(guī)模 又占居了全國的70%以上。然而，目前用于大鱗副泥鰍養(yǎng)殖的魚種主要捕撈自天然水域，野 生苗種的質(zhì)量難以保證，生長性能與養(yǎng)殖效果也極不穩(wěn)定。眾所周知，種質(zhì)是水產(chǎn)養(yǎng)殖的物 質(zhì)基礎(chǔ)，良種在我國水產(chǎn)業(yè)從捕撈為主的產(chǎn)業(yè)向以養(yǎng)殖為主的產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)變過程中起到的作 用不容小覷。傳統(tǒng)良種培育技術(shù)基本上分為兩類：遺傳操作和選擇操作，遺傳操作技術(shù)最為 成功的是雜交育種技術(shù)，選擇操作技術(shù)則主要有家系和群體選育。雜交選育面臨引入不良 性狀尚需多代回交的問題；傳統(tǒng)選育要想建成目標(biāo)品種，至少需要經(jīng)過多代（4-5代）人工 選擇才能育成優(yōu)良品種(遺傳穩(wěn)定、在生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)性狀基本一致的有一定數(shù)量的 群體)。傳統(tǒng)選擇操作的弊端在于對基因型富集的解釋和控制近親繁殖的方法尚處于經(jīng)驗(yàn) 階段，僅間接利用現(xiàn)代遺傳學(xué)理論，概念模糊，操作和理論間缺乏等價(jià)關(guān)系，以致育種過程 出現(xiàn)優(yōu)良品種雜合度低，有害基因通過純合而表現(xiàn)出來，雜合度和多態(tài)性下降，有綜合經(jīng)濟(jì) 性狀下降的隱患。
[0004] 隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)在水產(chǎn)遺傳育種上的應(yīng)用，多種分子標(biāo)記(如SSR/SNP 等)出現(xiàn)及應(yīng)用有效地解決了上述問題。然而，國內(nèi)外目前尚未開始大鱗副泥鰍的系統(tǒng)遺傳 選育工作，特別是分子標(biāo)記輔助選育，優(yōu)質(zhì)苗種的缺乏已嚴(yán)重制約了大鱗副泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的 發(fā)展，因此亟待開發(fā)出一種大鱗副泥鰍的良種選育方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種大鱗副泥鰍良種選育方法，從而可以 快速選育出質(zhì)量可靠、生長性能與養(yǎng)殖效果穩(wěn)定的大鱗副泥鰍優(yōu)良品種，此項(xiàng)技術(shù)適用于 有較大規(guī)模的良種場或國家良種基地進(jìn)行大鱗副泥鰍的良種選育。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 一種大鱗副泥鰍良種選育方法，其包括以下步驟： 1) 提供12個(gè)與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其各自對應(yīng)的引物如下所示： 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda48 的引物：L:5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda66 的引物：L:5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R:5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pdal74 的引物：L:5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda242 的引物：L:5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda247 的引物：L:5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R:5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda260 的引物：L: 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda288 的引物：L:5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R:5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda301 的引物：L:5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R:5' -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda310 的引物：L:5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda315 的引物：L:5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda316 的引物：L:5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda371 的引物：L:5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 選擇體型、體色正常，無病無傷的大鱗副泥鰍個(gè)體作為備選親本群體1，對備選親本 群體1中的所有個(gè)體進(jìn)行電子標(biāo)記，并提取DNA; 3) 采用Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 對備 選親本群體1進(jìn)行基因型篩選，選取基因型為AA(對應(yīng)Pda66)、FF(對應(yīng)Pdal74)、EE(對應(yīng) Pda242)、NN(對應(yīng)Pda247)、CC(對應(yīng)Pda260)、CC或DD(對應(yīng)Pda288)、CC(對應(yīng)Pda310)、 BB或AA(對應(yīng)Pda316)、AA或BB(對應(yīng)Pda371)的個(gè)體作為備選親本群體2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315對備選親本群體2進(jìn)行基因型篩選，獲得基因型分別為 AA或FF(對應(yīng)Pda48)、AA或BB(對應(yīng)Pda301)、BB或CC(對應(yīng)Pda315)的個(gè)體，將同一基 因位點(diǎn)具有相同基因型的個(gè)體進(jìn)行單獨(dú)培育，分別建立備選親本群體3和備選親本群體4 ; 5) 以備選親本群體3為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體5 ;以備選親本 群體4為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體6 ; 6) 按照親本群體5中的雌性個(gè)體X親本群體6中的雄性個(gè)體或親本群體5中的雄性 個(gè)體X親本群體6中的雌性個(gè)體的配對方式進(jìn)行規(guī)模化繁殖，即可獲得大鱗副泥鰍良種， 完成選育過程。
[0007] 在實(shí)際生產(chǎn)操作中，當(dāng)步驟6)完成之后，可以重復(fù)步驟2)至步驟6)的操作，并監(jiān) 控選育系遺傳背景，防止近親交配。
[0008] 優(yōu)選的，在上述方案中，步驟1)中所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記依下法獲得： a) 選取不同年齡及性別的大鱗副泥鰍，采集多種組織并提取RNA，等量移取并混合成 總RNA，分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫，PCR擴(kuò)增富集后回收目的片段，定量后采用第 二代高通量測序平臺（IlluminaHiseq2000平臺）進(jìn)行測序，測序后采用序列組裝軟件 (Trinity軟件）組裝測序片段，得到轉(zhuǎn)錄本序列； b) 采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記捕獲軟件(Msatco_ander軟件）掃描步驟a)中獲得的轉(zhuǎn)錄本 序列，篩選出核心序列長度為10-360bp的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對側(cè)翼序列長度為50bp以上 的微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； c) 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋的結(jié)果，選取分類到生長過程條目的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，加之 隨機(jī)選取的其他微衛(wèi)星分子標(biāo)記，共計(jì)合成微衛(wèi)星引物400對； d) 收集不同地域的大鱗副泥鰍野生群體，觀察并比較其形狀差異，選取差異最大的群 體進(jìn)行雜交，人工催產(chǎn)獲得全同胞家系群體； e) 隨機(jī)采用步驟b)中的微衛(wèi)星分子標(biāo)記對步驟d)中獲得的大鱗副泥鰍全同胞家系群 體中的個(gè)體進(jìn)行掃描，進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記與家系群體的生長性狀之間的相關(guān)分析，篩選 出12個(gè)與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
[0009] 此外，本發(fā)明還請求保護(hù)在上述大鱗副泥鰍良種選育方法中使用的12個(gè)微衛(wèi)星 分子標(biāo)記的引物。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的大鱗副泥鰍良種選育方法具有如下有益效果：分子標(biāo) 記輔助育種（marker-assistantselection,簡稱MAS)利用分子標(biāo)記從DNA水平上對育種 材料進(jìn)行選擇，從而加快進(jìn)程獲得具有目的性狀的后代。與傳統(tǒng)育種相比，MS方法具有迅 速、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，實(shí)用性強(qiáng)、成本低、準(zhǔn)確性高、不受環(huán)境等因素的影響，可擺脫對表型 性狀鑒定的依賴，在早世代進(jìn)行選擇，從而大大縮短育種年限(理論上經(jīng)過3代就可以選擇 出理想的優(yōu)質(zhì)種群)，提高育種效率，極具應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為從不同性別的大鱗副泥鰍體內(nèi)各組織中采集的RNA樣品的電泳圖。
[0012] 圖2為轉(zhuǎn)錄本序列長度分布圖。
[0013] 圖3為轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋(生物過程水平）結(jié)果示意圖。
[0014] 圖4為12個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記在大鱗副泥鰍群體中的部分電泳圖，其中每個(gè)泳道 代表一個(gè)大鱗副泥鰍個(gè)體，M代表DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶由上到下依次為1000bp，700bp， 500bp，400bp，300bp，200bp和100bp，由圖可知12個(gè)分子標(biāo)記在群體中不同個(gè)體的帶型(基 因型）有明顯差異。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 除非有相反陳述，下列用在說明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語具有下述含義。
[0016] "良種"是指與養(yǎng)殖業(yè)中正在使用的同物種的多數(shù)養(yǎng)殖群體相比，具有比較優(yōu)勢的 一個(gè)或多個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀的品種，其中養(yǎng)殖魚類的經(jīng)濟(jì)性狀一般為生長性、出肉率、抗逆性等。
[0017] "良種選育"是指通過直接或間接篩選方法對基礎(chǔ)群體的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性 狀進(jìn)行世代選擇以獲得良種的過程。
[0018] "微衛(wèi)星分子標(biāo)記（MicrosatelliteMolecularMarker，MMM)" 是指一種遺傳標(biāo) 記，又稱短串聯(lián)重復(fù)（ShortTandemRepeats，STR)或簡單重復(fù)序列（SimpleSequence R印eats，SSR)，是以1-6個(gè)堿基的序列串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，長度一般在幾十到幾百個(gè) 喊基。
[0019] "高通量測序平臺"包括三種主流的第二代測序技術(shù)，分別為Roche/454焦磷酸測 序、Illumina/Solexa聚合酶合成測序和ABI/SOLiD連接酶測序技術(shù)，三種測序技術(shù)共有的 突出特征是單次運(yùn)行產(chǎn)出序列數(shù)據(jù)量大，故而又被通稱為"高通量測序技術(shù)"。
[0020] "轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋"是基于基因本體（GeneOntology,G0)對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行的 基因功能注釋和分類方法，其包括生物過程、分子功能和細(xì)胞組件三個(gè)分支，屬生物信息學(xué) 范疇。
[0021] "基因型"是指決定物種特定性狀的遺傳物質(zhì)(基因）表現(xiàn)形式，例如AA基因型代 表紅色花色性狀，BB基因型代表白色花色性狀，AB基因型代表粉色花色性狀。
[0022] "生長性狀"是指與生長相關(guān)的性狀，如體長、體高等，其中"全長"是指魚吻端到尾 鰭末端的長度；"體長"是指魚吻端到尾鰭基部或末端椎骨的長度；"體高"是指魚體的最大 高度；"體重"是指魚體的質(zhì)量；"空殼重"是指去除內(nèi)臟團(tuán)后魚體的質(zhì)量。
[0023] "基因型與生長性狀相關(guān)分析"是指利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析基因型與生長性狀(如體 長）有無相關(guān)性及相關(guān)性顯著程度。
[0024] "家系群體"是指用于遺傳圖譜繪制的試驗(yàn)群體，包括全同胞家系(來源于相同父 母親的群體）和半同胞家系（同父異母或同母異父的群體)。
[0025] "備選親本群體"是指用于選擇人工繁殖用雌、雄親魚的性成熟群體。
[0026] "后備親本群體"是指將來用于選擇人工繁殖用雌、雄親本的群體，群體內(nèi)個(gè)體不 一定性成熟。
[0027] "電子標(biāo)記"又稱為電子標(biāo)簽、射頻標(biāo)簽、應(yīng)答器、數(shù)據(jù)載體，是指利用有別于傳統(tǒng) 物理標(biāo)記的，基于電子芯片的，可以通過注射器注射的標(biāo)簽來標(biāo)記不同受試動物的方法。
[0028] 較佳實(shí)施例：大鱗副泥鰍的良種選育。
[0029] 1、大鱗副泥鰍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建： 選大鱗副泥鰍家系群體的親本為實(shí)驗(yàn)材料，雄鰍、雌鰍分別來自洞庭湖和洪澤湖。用 100mg/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222)進(jìn)行麻醉后，采集雌雄泥鰍的多種組織 (雌、雄魚的肌肉、骨骼、鰭條、腦、脾臟、肝胰臟及雌魚的卵)，按說明書（D311A試劑，寶生物 工程(中國）有限公司）的要求置于RNA保存液中，凍存?zhèn)溆?。具體操作如下： 采用TRIzof試劑（100ml，生命科學(xué)（中國）公司）提取上述各種組織的RNA(其電泳 圖如圖1所示，圖中每個(gè)泳道包含兩到三條帶，說明RNA質(zhì)量較好，滿足測序要求)，質(zhì)量檢 測合格后等量移取各種RNA最終混合成5iig總RNA，用帶有oligo(dT)的磁珠分離出具 有PolyA尾的mRNA，離子法打斷mRNA，然后用6堿基隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄得到一鏈cDNA，加入 dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成二鏈cDNA。得到雙鏈cDNA之后通過T4連接酶末端補(bǔ)平 并且連接"A"堿基，最后連接index接頭。以上構(gòu)建文庫的試劑盒是Truseq?RNAsample prepKit。對得到的文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集，然后用2%的瓊脂糖膠回收目的片段。用TBS380 對文庫進(jìn)行定量，在Hiseq2000測序平臺上測序。測序后經(jīng)過去冗余和低質(zhì)量片段過濾后， 剩余39, 751，380條序列片段，加之大鱗副泥鰍兩個(gè)肌肉轉(zhuǎn)錄組序列樣本共計(jì)105, 308, 078 個(gè)片段（10. 47Gb)，采用Trinity軟件組裝測序片段，組裝后得到71，887個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列，均 長1464. 58bp，總長度105, 284, 263bp，序列均長1464. 58bp，其中大于IOOObp的序列有 34, 603 (48. 1%)條，適于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的批量挖掘(具體數(shù)據(jù)參見圖2)。
[0030] 2、批量開發(fā)大鱗副泥鰍微衛(wèi)星分子標(biāo)記： 采用Msatcommander軟件對所有轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行SSR篩選，參數(shù)設(shè)計(jì)為核心序列大于 12bp的，發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)有15106個(gè)，用Primer3. 0軟件對側(cè)翼序列>50bp的所有微衛(wèi)星分 子標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體引物設(shè)計(jì)參數(shù)詳見表1。

【權(quán)利要求】
1. 一種大鱗副泥鰍良種選育方法，其包括以下步驟： 1) 提供12個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其各自對應(yīng)的引物如下所示： 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda48 的引物：L :5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda66 的引物：L :5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R :5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pdal74 的引物：L :5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda242 的引物：L :5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda247 的引物：L :5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R :5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda260 的引物：L : 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda288 的引物：L :5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R :5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda301 的引物：L :5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R：5, -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda310 的引物：L :5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda315 的引物：L :5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda316 的引物：L :5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda371 的引物：L :5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 選擇體型、體色正常，無病無傷的大鱗副泥鰍個(gè)體作為備選親本群體1，對備選親本 群體1中的所有個(gè)體進(jìn)行電子標(biāo)記，并提取DNA ; 3) 采用 Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 對備 選親本群體1進(jìn)行基因型篩選，選取基因型為Pda66對應(yīng)的AA、Pdal74對應(yīng)的FF、Pda242 對應(yīng)的EE、Pda247對應(yīng)的NN、Pda260對應(yīng)的CC、Pda288對應(yīng)的CC或DD、Pda310對應(yīng)的 CC、Pda316對應(yīng)的BB或AA、Pda371對應(yīng)的AA或BB的個(gè)體作為備選親本群體2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315對備選親本群體2進(jìn)行基因型篩選，獲得基因型分別為 Pda48對應(yīng)的AA或FF、Pda301對應(yīng)的AA或BB、Pda315對應(yīng)的BB或CC的個(gè)體，將同一基 因位點(diǎn)具有相同基因型的個(gè)體進(jìn)行單獨(dú)培育，分別建立備選親本群體3和備選親本群體4 ; 5) 以備選親本群體3為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體5 ;以備選親本 群體4為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體6 ; 6) 按照親本群體5中的雌性個(gè)體X親本群體6中的雄性個(gè)體或親本群體5中的雄性 個(gè)體X親本群體6中的雌性個(gè)體的配對方式進(jìn)行規(guī)?；敝常纯色@得大鱗副泥鰍良種， 完成選育過程。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鱗副泥鰍良種選育方法，其特征在于，在步驟6)完成之后 重復(fù)步驟2)至步驟6)的操作。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鱗副泥鰍良種選育方法，其特征在于，步驟1)中所述微衛(wèi) 星分子標(biāo)記依下法獲得： a) 選取不同年齡及性別的大鱗副泥鰍，采集多種組織并提取RNA，等量移取并混合成 總RNA，分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫，PCR擴(kuò)增富集后回收目的片段，定量后采用 Illumina Hiseq 2000平臺進(jìn)行測序，測序后采用Trinity軟件組裝測序片段，得到轉(zhuǎn)錄本 序列； b) 采用Msatcommander軟件掃描步驟a)中獲得的轉(zhuǎn)錄本序列，篩選出核心序列長度 為10-360 bp的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對側(cè)翼序列長度為50 bp以上的微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行引 物設(shè)計(jì)； c) 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋的結(jié)果，選取分類到生長過程條目的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，加之 隨機(jī)選取的其他微衛(wèi)星分子標(biāo)記，共計(jì)合成微衛(wèi)星引物400對； d) 收集不同地域的大鱗副泥鰍野生群體，觀察并比較其形狀差異，選取差異最大的群 體進(jìn)行雜交，人工催產(chǎn)獲得全同胞家系群體； e) 隨機(jī)采用步驟b)中的微衛(wèi)星分子標(biāo)記對步驟d)中獲得的大鱗副泥鰍全同胞家系群 體中的個(gè)體進(jìn)行掃描，進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記與家系群體的生長性狀之間的相關(guān)分析，篩選 出12個(gè)與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的大鱗副泥鰍良種選育方法中使用的12個(gè)微衛(wèi) 星分子標(biāo)記的引物。
【文檔編號】A01K61/00GK104351096SQ201410606181
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】凌去非, 李彩娟 申請人:蘇州大學(xué)