一種改善植物鉀素吸收效率,對(duì)抗缺鉀脅迫的方法及其中使用的重組表達(dá)載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改善植物鉀素吸收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫的方法及其使用中的重組表達(dá)載體在水稻上的應(yīng)用。用特異地響應(yīng)缺鉀信號(hào)的啟動(dòng)子調(diào)控植物根發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中獲得轉(zhuǎn)基因植物，在鉀素供應(yīng)充足時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物即具有旺盛生長(zhǎng)的根系；在鉀素養(yǎng)分缺乏時(shí)，啟動(dòng)子特異的在根部驅(qū)動(dòng)根發(fā)育基因的過量表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的根系生長(zhǎng)，根系生物量和根系活力均顯著提高，從而增加對(duì)鉀素等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用，提高對(duì)缺鉀脅迫的適應(yīng)繼而顯著增加產(chǎn)量，達(dá)到直接通過根系構(gòu)型的改變來提高植物鉀素養(yǎng)分吸收的目的。本發(fā)明方法可特異且直接的改善植物的根系生長(zhǎng)，在田間鉀素養(yǎng)分供應(yīng)缺乏的環(huán)境下，高效的提高鉀素吸收，緩解低鉀對(duì)植物生長(zhǎng)的不利影響，從而減少鉀肥的施用以提高經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種改善植物鉀素吸收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫的方法及其中 使用的重組表達(dá)載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種改善植物鉀素吸收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫 的方法及其中使用的重組表達(dá)載體。

【背景技術(shù)】
[0002] 鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中非常重要的大量礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，占到了植物干重的 10% [1-3]。鉀對(duì)維持離子穩(wěn)態(tài)、滲透調(diào)節(jié)、蛋白代謝、酶活、膜極化和繁多的代謝過程有關(guān) 鍵的作用[4-6]。此外，植物體中重要的生理過程：光合、光呼吸以及生長(zhǎng)，都受到可利用 鉀的影響[7, 8]。土壤中鉀濃度范圍在0. 1 -ImM，由于局部耗竭，在植物根際土壤中的鉀濃 度會(huì)顯著低于上述水平[9]。鉀可用性受到植物生長(zhǎng)環(huán)境的限制，鉀缺乏會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)總 鉀量降低，尤其在根部快速發(fā)生[10 - 14]。長(zhǎng)期缺鉀，植物會(huì)呈現(xiàn)生長(zhǎng)抑制和黃化病，尤其 在老葉中首先出現(xiàn)[15]。在農(nóng)藝生產(chǎn)上，發(fā)展中國(guó)家經(jīng)常采取施用化肥來提高作物的產(chǎn)量 和質(zhì)量，然而大量使用化肥，不僅不會(huì)提高產(chǎn)量，反而會(huì)導(dǎo)致土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的流失并造成 環(huán)境污染。與此相反，在很多資源有限的國(guó)家，不充分的施肥限制了作物的最優(yōu)產(chǎn)量[16]。 因此通過有效的生物技術(shù)手段，提高植物自身對(duì)土壤中有效鉀的利用，減少與完善鉀肥的 使用與管理，對(duì)于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和資源的可持續(xù)利用有重要意義。
[0003] 隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，植物體中參與鉀吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制以及對(duì)有效鉀 不同程度上的分子響應(yīng)機(jī)制越來越多的被研究發(fā)現(xiàn)?；谀壳暗难芯窟M(jìn)展，植物采取4大 策略來提高對(duì)鉀的利用效率：（1)增加根系體積；(2)提高土壤中鉀的吸收效率和在植物體 內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)；（3)增加土壤中鉀的可移動(dòng)性；(4)通過對(duì)與鉀利用有關(guān)的數(shù)量性狀的研究，用 分子標(biāo)記輔助的分子遺傳育種手段創(chuàng)建鉀高效利用的新品種[17]。缺鉀不僅影響植物側(cè)根 的發(fā)生和發(fā)育[18]，也抑制了主根的生長(zhǎng)[19 - 21]。在擬南芥中，低鉀脅迫對(duì)側(cè)根和主根 的生長(zhǎng)有拮抗作用[22]。在水稻中，鉀饑餓降低了植株的根冠比[23]。因此，改善根系生 長(zhǎng)是植物提高對(duì)缺鉀脅迫的適應(yīng)最直接和有效途徑。
[0004]KT/HAK/KUP基因家族在眾多植物中先后被發(fā)現(xiàn)，該家族中的很多基因，例如AtHA K5,CaHAKl,HvHAKl,LeHAK5,ThHAK5在缺鉀脅迫時(shí)顯著誘導(dǎo)表達(dá)[24 -27]。在水稻的27個(gè) HAK基因中，OsHAKl, 0sHAK5, 0sHAK7和0sHAK16在鉀饑餓脅迫下，根系中的表達(dá)量顯著上調(diào) [28-31]
[0005]WUSCHEL相關(guān)的同源異形盒基因W0X是發(fā)育的調(diào)控的因子[32]。W0X基因家族在 擬南芥和水稻中至少分別有15和13個(gè)成員組成，它們中的一些參與了調(diào)控植物根系發(fā)育 過程中細(xì)胞的分裂和分化過程[33 -35]。例如，在擬南芥中，W0X2和W0X8調(diào)控了胚根形成 過程中細(xì)胞的分化[36]。W0X5對(duì)莖頂端分生細(xì)胞的維持有重要作用[37]。W0X9參與了根 尖早期的胚性生長(zhǎng)[38]。在水稻中，W0X3A對(duì)側(cè)根和根毛的發(fā)育都起作用[33, 34]。W0X11 通過直接抑制不定根原基中A型細(xì)胞分裂素相應(yīng)因子RR2的表達(dá)，對(duì)不定根的發(fā)生和生長(zhǎng) 起關(guān)鍵作用[39]。將根發(fā)育相關(guān)基因在植物根系中特異受缺鉀脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，使植物在鉀

【權(quán)利要求】
1. 一種改善植物鉀素吸收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫的方法，其特征在于用特異的在根系中 響應(yīng)缺鉀信號(hào)的啟動(dòng)子調(diào)控植物根發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中獲得 轉(zhuǎn)基因植物，在鉀素養(yǎng)分缺乏時(shí)，響應(yīng)缺鉀信號(hào)的啟動(dòng)子特異的驅(qū)動(dòng)所述的根發(fā)育相關(guān)基 因的過量表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物根系生長(zhǎng)，從而達(dá)到改善植物鉀素吸收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫 的目的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 OsHAK16啟動(dòng)子特異調(diào)控根發(fā)育基因 W0X11的植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中獲得轉(zhuǎn)基因 植物，在鉀素缺乏時(shí)水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因0sHAK16啟動(dòng)子特異地驅(qū)動(dòng)根發(fā)育基 因 W0X11在植物根系中過量表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植物根系大量生長(zhǎng)，從而達(dá)到改善植物鉀素吸 收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫的目的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的植物為糧食作物，優(yōu)選水稻。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 OsHAK16啟動(dòng)子特異調(diào)控根發(fā)育基因 W0X11的植物重組表達(dá)載體為重組表達(dá)載體 PTCK303 -0sHAK16 -W0X11，是將OsHAK16啟動(dòng)子和W0X11基因分別插入到pTCK303表達(dá)載 體的Hind III /BamHI和BamHI/SacI酶切位點(diǎn)所得。
5. -種用于特異誘導(dǎo)根系生長(zhǎng)發(fā)育的重組表達(dá)載體，其特征在于含有水稻高親和鉀離 子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因0sHAK16啟動(dòng)子及根發(fā)育基因 W0X11，且所述的根發(fā)育基因 W0X11位于水 稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因0sHAK16啟動(dòng)子的下游，受水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 OsHAK16啟動(dòng)子特異調(diào)控。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體以pTCK303 質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒，在Hind III，BamHI酶切位點(diǎn)插入所述的水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 OsHAK16 啟動(dòng)子得重組載體PTCK303 - OsHAK16,在重組載體pTCK303 - OsHAK16的BamHI, SacI酶切 位點(diǎn)插入所述的根發(fā)育基因 W0X11得所述的重組表達(dá)載體。
7. 權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體在改善植物鉀素吸收效率，對(duì)抗缺鉀脅迫中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104450777SQ201410540077
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】徐國(guó)華, 陳 光 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)