一種凍存液及其用途和保藏臍帶間充質干細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種本發(fā)明提供了一種用于保藏干細胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和生長培養(yǎng)基混合得到，所述生長培養(yǎng)基含有基礎培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。本發(fā)明還提供了所述的生長培養(yǎng)基在保藏臍帶間充質干細胞中的用途。本發(fā)明還提供了一種保藏臍帶間充質干細胞的方法，該方法包括：將臍帶間充質干細胞懸浮于如上所述的凍存液中，然后在零下200℃至零下70℃的溫度中保藏。通過上述技術方案，本發(fā)明能夠大幅度地提升保藏后的臍帶間充質干細胞在體外的擴增能力。
【專利說明】一種凍存液及其用途和保藏臍帶間充質干細胞的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞生物【技術領域】，具體地，涉及一種用于保藏干細胞的凍存液、該凍 存液的用途和保藏臍帶間充質干細胞的方法。

【背景技術】
[0002] 干細胞是一類具有自我復制能力及多向分化潛能的未分化或低分化的細胞。在一 定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細胞、多 能干細胞和單能干細胞。
[0003] 間充質干細胞以一種多能干細胞，是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的 中胚層和外胚層。間充質干細胞因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫 調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導 條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連 續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引 起的組織器官損傷修復。間充質干細胞由于其來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強的分 化潛能和可自體移植等優(yōu)點，具有較高的臨床應用價值。
[0004] 臍帶間充質干細胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多能干細胞。從人臍帶中 分離出的臍帶間充質干細胞，其細胞含量和增殖能力均優(yōu)于骨髓間充質干細胞，并且免疫 原性比骨髓間充質干細胞低，此外還具有取材方便，無倫理學爭議等優(yōu)點，因此在間充質干 細胞中具有更高的臨床應用價值。
[0005] 在實際臨床應用中，臍帶間充質干細胞的足夠數(shù)量是保證干細胞治療的必要因 素。在體外對臍帶間充質干細胞進行擴增是增加臍帶間充質干細胞的數(shù)量的必要途徑。但 是，目前臍帶間充質干細胞只能在體外傳代15-20代，并且傳代后3天以上才能達到80%以 上的融合度，此外在傳代15代以后還會出現(xiàn)丟失分化潛能的現(xiàn)象。因此，現(xiàn)有的培養(yǎng)臍帶 間充質干細胞的方法存在擴增能力差的缺陷。此外，臍帶間充質干細胞在凍存以后，擴增能 力會出現(xiàn)下降。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服臍帶間充質干細胞在凍存以后，擴增能力會出現(xiàn)下降的缺 陷，提供一種用于保藏干細胞的凍存液、該凍存液的用途和保藏臍帶間充質干細胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在基礎培養(yǎng)基中添加特定的抗體和ATP，能夠大幅度地 提高臍帶間充質干細胞的擴增能力，并且，在凍存液中也添加特定的抗體和ATP，能夠大幅 度地提高凍存后的臍帶間充質干細胞的擴增能力，由此得到了本發(fā)明。
[0008] 一方面，本發(fā)明提供了一種用于保藏干細胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和 生長培養(yǎng)基混合得到，二甲基亞砜和所述生長培養(yǎng)基的體積比為（0.05-0.4) : 1;所述生 長培養(yǎng)基含有基礎培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人 類表皮生長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉 鹽。
[0009] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種保藏臍帶間充質干細胞的方法，該方法包括：將 臍帶間充質干細胞懸浮于如上所述的凍存液中，然后在零下200°C至零下70°C的溫度中保 藏。
[0010] 再一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的凍存液在保藏臍帶間充質干細胞中的用 途。
[0011] 通過上述技術方案，本發(fā)明能夠大幅度地提升凍存后的臍帶間充質干細胞在體外 的擴增能力。例如，本發(fā)明能夠將凍存后的臍帶間充質干細胞的體外傳代數(shù)提高到25-40 代，并且傳代后40-60小時內能達到80%以上的融合度，此外在傳代20代以后也不會出現(xiàn) 丟失分化潛能的現(xiàn)象。
[0012] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是測試實施例1中不同的生長培養(yǎng)基中生長的臍帶間充質干細胞的生長曲線 圖。圖1中，1和2表示制備實施例1和2,3-6分別表示制備對比例1-4,橫坐標表示生長 時間，縱坐標表示550nm處測定各孔吸光光度值（D值）。

【具體實施方式】
[0015] 以下結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0016] 在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，使用的液體的體積數(shù)值為20°C下的數(shù)值； 使用的氣體的體積數(shù)值為20°C和1個標準大氣壓下的數(shù)值。
[0017] 本發(fā)明提供了一種用于保藏干細胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和生長培養(yǎng) 基混合得到，二甲基亞砜和所述生長培養(yǎng)基的體積比為（0.05-0.4) : 1;所述生長培養(yǎng)基 含有基礎培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生 長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，人血管內皮生長因子（human vascular endothelial growth factor，hVEGF)是指 NCBI 中基因登記號（NCBI Gene ID)為 7422 的基因的翻譯產(chǎn)物，其官方全稱（Official Full Name)為血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)，其常見的別稱還包括 VPF、VEGF 或 MVCD1。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，人類表皮生長因子受體I (human epidermal growth factor receptorl，HERl)是指 NCBI 中基因登記號（NCBI Gene ID)為 1956 的基 因的翻譯產(chǎn)物，其官方全稱（Official Full Name)為表皮生長因子受體（epidermal growth factor rec印tor，EGFR)，其常見的別稱還包括 EGFR、ERBB、mENA、ERBBl 或 PIG61。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor rec印tor2, HER2)是指 NCBI 中基因登記號（NCBI Gene ID)為 2064 的基 因的翻譯產(chǎn)物，其官方全稱（Official Full Name)為v-erb-b2鳥成紅細胞白血病病毒癌基 因同源體 2 (v-erb_b2avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2)，其常 見的別稱還包括 NEU、NGL、TKR1、CD340、HER-2、MLN19 或 HER-2/neu。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明提供的凍存液，其中，鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽 (guanosine-5 ^ -triphosphate trisodium salt)是指式（1)所不的化合物，其 CAS 號為 36051-31-7。

【權利要求】
1. 一種用于保藏干細胞的凍存液，該凍存液由二甲基亞砜和生長培養(yǎng)基混合得到，二 甲基亞砜和所述生長培養(yǎng)基的體積比為（0.05-0. 4) : 1;所述生長培養(yǎng)基含有基礎培養(yǎng)基 和添加劑，其特征在于：所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因 子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
2. 根據(jù)權利要求1所述的凍存液，其特征在于：抗人血管內皮生長因子的抗體的含 量為0. 01-0. 2ng/mL，抗人類表皮生長因子受體1的抗體的含量為0. 01-0. Ing/mL，抗人 類表皮生長因子受體2的抗體的含量為0. 05-0. 4ng/mL ;鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽的含量為 0?2_4ng/mL〇
3. 根據(jù)權利要求2所述的凍存液，其特征在于：抗人血管內皮生長因子的抗體的含 量為0. 05-0. Ing/mL，抗人類表皮生長因子受體1的抗體的含量為0. 03-0. 08ng/mL，抗人 類表皮生長因子受體2的抗體的含量為0. 1-0. 2ng/mL ;鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽的含量為 0?5_2ng/mL〇
4. 根據(jù)權利要求1-3中任意一所述的凍存液，其特征在于：所述抗人血管內皮生長因 子的抗體為貝伐單抗；所述抗人類表皮生長因子受體1的抗體為西妥昔單抗，所述抗人類 表皮生長因子受體2的抗體為曲妥珠單抗。
5. 據(jù)權利要求1所述的凍存液，其特征在于：所述基礎培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基、MEM培 養(yǎng)基、IMHM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基中的至少一種。
6. 根據(jù)權利要求1所述的凍存液，其特征在于：所述生長培養(yǎng)基還含有5-20體積％的 血清。
7. 權利要求1-6中任意一項所述的凍存液在保藏臍帶間充質干細胞中的用途。
8. -種保藏臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于：該方法包括：將臍帶間充質干細 胞懸浮于權利要求1-6中任意一項所述的凍存液中，然后在零下200°C至零下70°C的溫度 中保減。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于：相對于每mL的凍存液，臍帶間充質干細 胞的用量為（1-5) X IO7個。
10. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于：凍存所用的降溫速率為0. 5-2°C /min。
【文檔編號】A01N1/02GK104304233SQ201410459778
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權日:2014年9月11日
【發(fā)明者】安沂華, 董健伸 申請人:安沂華