朝鮮薊試管實生苗莖尖快繁育苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種朝鮮薊試管實生苗莖尖快繁育苗的方法。本發(fā)明利用種子消毒后進行試管內播種，獲得大量無菌實生苗；并采取合適大小的試管實生苗莖尖進行從芽誘導獲得繼代無根苗；將無根苗進行生根培育獲得朝鮮薊優(yōu)質種苗。因朝鮮薊種皮堅硬，對消毒劑有較強的耐受力，因此用本發(fā)明的消毒劑消毒后無污染率可達80％以上；且進行適當?shù)奈锢硖幚砗蟮姆N子消毒后發(fā)芽率可達到85％以上。獲得的無菌實生苗采取其莖尖進行誘導，成活率可達到90％，叢芽誘導成功率可達85％；且進行試管播種成苗后無需再消毒，成功率可達90％以上，無疑達到快繁種苗并降低成本的目的。本發(fā)明的方法具有種苗快繁效率高、成本低、前景好等優(yōu)勢。
【專利說明】朝鮮薊試管實生苗莖尖快繁育苗的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種朝鮮薊試管實生苗莖尖快繁育苗的方 法。

【背景技術】
[0002] 朝鮮薊，別名菊薊、菜薊，學名Cynara scolymus L.，為菊科（Comopsite)菜薊屬多 年生草本植物。并且是一種藥食同源植物，既是一種很好的菜肴，同時有很好的藥用價值， 其花蕾或葉含菜薊素、菜薊苦素、大海米菊素、木犀草甙等成分，在歐洲的德國、法國、英國、 意大利等國家，朝鮮薊用于防治消化不良、便秘、腹瀉、肝臟和膽囊疾病以及高血脂、動脈硬 化、高血糖、黃膽等；在巴西，朝鮮薊用于糖尿病、高血壓的預防。同時，朝鮮薊最突出的特點 是同時具備保護和恢復肝臟細胞的功能，也是其它降脂降糖產(chǎn)品所無法替代的。在我國，朝 鮮薊主要加工成罐頭成品出口，目前世界上朝鮮薊罐頭年需求量約10萬噸以上。近年來， 美國及西歐等發(fā)達國家對朝鮮薊的消費和進口量不斷增加，罐頭制品在國際市場供不應求 (李進進.朝鮮薊繼代增殖快繁方法探討[J].種子，2011(1))。
[0003] 目前朝鮮薊的種植方法多采用種子播種，露天栽種，而朝鮮薊是異化授粉植物， 在我國大多數(shù)地區(qū)只開花不結果，種子繁育率低，雖然種子昂貴但我國幾個主要種植地區(qū) (如湖南常德）每年都需要大量進口種子，這不僅成本高，而且經(jīng)常因茬口接不上而延誤農(nóng) 時；另一種是通過組培快繁技術，但外植體是采用露地健壯植株的分蘗苗莖尖消毒后進行 誘導培育朝鮮薊種苗，其缺點和不足是朝鮮薊表面密布絨毛，消毒效果不理想，而且幼嫩莖 尖常因消毒劑的副作用導致褐化或死忙，影響成苗率（張平喜，朝鮮薊的組織培養(yǎng)與快速 繁殖技術研究[J].中國園藝文摘，2011.6)。為改善傳統(tǒng)的育種方法，適應國際市場的需 要，迫切需要改善朝鮮薊的組培快繁途徑。


【發(fā)明內容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種朝鮮薊試管實生苗 莖尖快繁育苗的方法。利用種子消毒后進行試管內播種，獲得大量無菌實生苗；并采取合適 大小的試管實生苗莖尖進行從芽誘導獲得繼代無根苗；將無根苗進行生根培育獲得朝鮮薊 優(yōu)質種苗，從而達到快速繁殖朝鮮薊種苗的目的。
[0005] 因種子消毒比露地實生苗莖尖消毒容易而且成活率高，進行試管播種成苗后無需 再消毒，成功率可達90%以上，無疑達到快繁種苗并降低成本的目的。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種朝鮮薊試管實生苗莖尖快繁育苗的方 法，包括如下步驟：
[0007] (1)將朝鮮薊（Cynara scolymus L.)種子進行物理處理后，再經(jīng)消毒劑消毒后在 種子培養(yǎng)基中進行試管內播種、培育，將培育發(fā)芽的種子挑出至新鮮的種子培養(yǎng)基中進行 自然光照，獲得無菌實生苗；
[0008] (2)在無菌條件中進行如下操作，將步驟（1)獲得的無菌實生苗切取0. 7?1. 0_ 的實生苗莖尖轉入?yún)惭空T導培養(yǎng)基中進行誘導，再轉入自然光照下進行培養(yǎng)，獲得叢芽，然 后將叢芽轉至繼代培養(yǎng)基中，經(jīng)繼代培養(yǎng)后獲得無根苗；
[0009] (3)將步驟（2)獲得的無根苗轉至試管生根培養(yǎng)基中，進行試管生根培育獲得朝 鮮薊優(yōu)質種苗。
[0010] 步驟⑴中所述的物理處理的條件優(yōu)選為黑暗條件下30?35°C溫水中恒溫浸泡 12?24h ;更優(yōu)選為黑暗條件下30°C溫水中恒溫浸泡24h ;
[0011] 步驟（1)中所述的消毒劑的組成及消毒條件優(yōu)選為75% (v/v)酒精15s+2% (v/ ￥)似(]10(10?15)111；[11+18/1^取012(10?15)111；[11;更優(yōu)選為75 (%(￥八）酒精158+2(%(￥八） NaC10(10?15)min+lg/L HgCl215min ;適當提高lg/LHgCl2的消毒時間，污染率會隨著降 低。
[0012] 步驟（1)中的物理處理后的種子用紗布松散包扎，消毒劑處理后用無菌水浸洗 4?5次；
[0013] 步驟（1)中所述的種子培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+GA3(0?3.0)mg/ L+NAA (0 ?0· 2) mg/L+ 活性炭（0 ?2) g/L+ 卡拉膠（6. 8 ?7) g/L+ 鹿糖 30g/L，ρΗ5· 5 ?5. 7， 其中，ΝΑΑ為零時，GA3和活性炭均不為零；更優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+GA31. 0mg/L+活性炭2g/L+ 卡拉膠7g/L+鹿糖30g/L，pH5. 6 ;所述的GA3，指赤霉素；所述的NAA，指a-萘乙酸；
[0014] 步驟（1)中所述的培育的條件優(yōu)選為黑暗條件下，環(huán)境溫度23?28°C培育15? 25天，培養(yǎng)濕度為70 %?85 % ;
[0015] 步驟⑴中所述的進行自然光照的條件優(yōu)選為23?28°C自然光照30?40天，濕 度為70%?85% ;
[0016] 步驟（2)中所述的叢芽誘導培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+6-BA (2. 0?5. 0) mg/ L+NAA(0. 2 ?0· 5)mg/L+KT(0 ?0· 2)mg/L+ 瓊脂 6. 8g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 6 ;更優(yōu)選為 MS 培養(yǎng)基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0· 2mg/L+KT0. 2mg/L+ 瓊脂 6. 8g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 6 ;所述的 6-ΒΑ，指6-芐基腺嘌呤；所述的ΚΤ，指激動素；
[0017] 步驟（2)中所述的誘導的條件優(yōu)選為黑暗條件下23?28°C誘導培養(yǎng)10?15天；
[0018] 步驟（2)中所述的自然光照下進行培養(yǎng)的條件優(yōu)選為待莖尖膨大1?2倍后轉 入培養(yǎng)室自然光下培養(yǎng)15?20天，待開始轉綠而且有芽點出現(xiàn)時適當增加光照強度至 2500?30001ux，再培養(yǎng)25?35天后獲得叢芽；
[0019] 步驟⑵中所述的繼代培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+ΝΑΑ(0?0. 5)mg/ L+GA3(0 ?0· 5)mg/L+6_BA(0 ?1. 5)mg/L+CM(挪子汁）（0 ?50)g/L+ 卡拉膠 7g/L+ 鹿 糖30g/L，ρΗ5· 5?5. 7,其中，NAA、GA3、6-BA與CM不能同時為零；更優(yōu)選為MS培養(yǎng)基 +GA30. 5mg/L+6-BAl. 5mg/L+CM(椰子汁）50g/L 卡拉膠 7g/L+鹿糖 30g/L，pH5. 6 ;所述的 GA3， 指赤霉素；所述的CM(椰子汁），從椰果中抽取的原液；
[0020] 步驟（2)中所述的繼代培養(yǎng)的條件優(yōu)選為溫度23?28°C培養(yǎng)15?25天，濕度為 70%?85%，光照強度 3000 ?350011?;
[0021] 步驟（3)中所述的試管生根培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為1/2MS培養(yǎng)基+ΙΒΑ(0. 2?1. 0) mg/L+香蕉泥（0 ?50) g/L+ 活性炭（0 ?2) g/L+瓊脂 6. 8g/L+鹿糖 20g/L，ρΗ5· 5 ?5. 8 ;更 優(yōu)選為1/2MS培養(yǎng)基+ΙΒΑ0. 5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+瓊脂6. 80g/L+蔗糖20g/ L，pH5. 7 ;所述的IBA，指吲哚丁酸；所述的香蕉泥，指成熟香蕉果肉勻漿物；所述1/2MS培 養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基的大量元素減半；
[0022] 步驟（3)中所述的生根培育的條件優(yōu)選為溫度23?28°C培育20?30天，濕度為 70%?85%，光照強度 3000 ?450011?;
[0023] 本發(fā)明的機理是：利用植物組織培養(yǎng)的原理和技術進行種苗擴繁。植物組織培養(yǎng) (又稱為離體培養(yǎng)、植物克?。喎Q組培，是將植物的離體材料（器官、組織、細胞、原生質 體等）無菌培養(yǎng)，使其生長、分化、增殖，再生出完整植株或生產(chǎn)次生代謝物質的技術。植物 組織培養(yǎng)的特點有：培養(yǎng)材料經(jīng)濟；培養(yǎng)條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理 方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制等。
[0024] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0025] (1)利用種子進行消毒，因種皮堅硬，對消毒劑有較強的耐受力，因此使用本發(fā)明 的消毒劑消毒后無污染率可達80%以上。
[0026] (2)獲得的無菌實生苗采取其莖尖進行誘導，成活率可達到90%，叢芽誘導成功 率可達85% ;
[0027] (3)因朝鮮薊種皮較堅硬，進行適當?shù)奈锢硖幚砗蟮姆N子消毒后發(fā)芽率可達到 85%以上；
[0028] (4)本發(fā)明的方法具有種苗快繁效率高、成本低、前景好等優(yōu)勢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是經(jīng)消毒處理后進行試管播種的朝鮮薊種子的示意圖。
[0030] 圖2是朝鮮薊種子發(fā)芽后自然形式的示意圖。
[0031] 圖3是朝鮮薊莖尖誘導后的叢芽的示意圖。
[0032] 圖4是朝鮮薊種苗樓頂種植著生的花苞的示意圖。

【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0034] 實施例1 :
[0035] (1)從北京花仙子園藝有限公司購進朝鮮薊（Cynara scolymus L.)優(yōu)質種子；
[0036] (2)先將種子進行物理處理（黑暗條件下，30°C溫水中恒溫浸泡24小時），然 后在超凈工作臺上用特定的消毒劑（75% (v/v)酒精15s+2% (v/v)NaC1010min+lg/L HgCl215min)，進行種子消毒，再用無菌水浸洗4?5次，然后接種至種子培養(yǎng)基（其配方為 MS 培養(yǎng)基 +GA31. 0mg/L+ 活性炭 2g/L+ 卡拉膠（CAS9000-07-1) 7g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 6)中 進行暗培養(yǎng)，要求培養(yǎng)室溫度23?28°C，濕度75%?85% ;(見圖1)
[0037] (3) 15?25天后陸續(xù)有種子發(fā)芽，將發(fā)芽的種子挑出至新鮮的種子培養(yǎng)基（配方 與步驟⑵中的相同）中進行自然光照，溫度23?28 °C，濕度75 %?85%，30?40天后 獲得無菌實生苗（見圖2);總發(fā)芽率可達到80%以上；
[0038] (4)當無菌實生苗高3. 5cm左右時，切取0. 7mm?1. 0mm的實生苗莖尖在叢芽誘 導培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0· 2mg/L+KT0. 2mg/L+ 瓊脂 6. 8g/L+ 蔗糖 30g/L， ρΗ5· 6)中進行叢芽誘導（培養(yǎng)室溫度23?28°C，10?15天，濕度75%?85%，暗培養(yǎng)）， 待莖尖膨大1?2倍后轉入培養(yǎng)室自然光下培養(yǎng)15?20天，待開始轉綠而且有芽點出現(xiàn) 時適當增加光照至2500?30001ux，再培養(yǎng)25?35天后獲得叢芽（見圖3)，叢芽誘導成 功率可達85% ;
[0039] (5)將步驟（4)獲得的叢芽轉至繼代培養(yǎng)基（其配方為MS培養(yǎng)基+GA30· 5mg/ L+6-BA1. 5mg/L+CM (椰子汁）50g/L+卡拉膠7g/L+蔗糖30g/L，ρΗ5· 6)中，進行繼代培養(yǎng)， 培養(yǎng)室溫度23?28°C，15?25天，濕度75 %?85 %，光照強度3000?35001ux，獲得健壯 無根苗；
[0040] (6)將步驟（5)中獲得的健壯無根苗在試管生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基 +ΙΒΑ0. 5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+瓊脂6. 8g/L+鹿糖20g/L，pH5. 7)中進行生根培 育，培養(yǎng)室溫度23?28°C，培養(yǎng)20?30天，濕度75 %?85%，光照強度3500?4000lux， 獲得朝鮮薊優(yōu)質種苗；
[0041] (7)將步驟（6)獲得的種苗露地繁育（見圖4)。
[0042] 實施例2 :
[0043] 本實施例與實施例1的不同之處在于：步驟（2)采用消毒劑配方：75% (v/v)酒 精15s+2% (v/v)NaC1015min+lg/L HgCl215min進行種子消毒，再用無菌水浸洗4?5次， 然后接種至種子培養(yǎng)基上，可達到同樣理想的效果?？梢?，lg/LHgCl 2的消毒溶液對朝鮮薊 種子的消毒起著重要的作用。
[0044] 實施例3 :
[0045] 本實施例中的步驟（1)、（2)、（3)、（4)與實施例1中的步驟（1)、（2)、（3)、（4)相 同。
[0046] (5)將步驟（4)獲得的叢芽轉至繼代培養(yǎng)基（其配方為MS培養(yǎng)基+ΝΑΑ0. 2mg/ L+6-BA1. Omg/L+CM (椰子汁）50g/L+卡拉膠7g/L+蔗糖30g/L，ρΗ5· 7)中進行繼代培養(yǎng)，培 養(yǎng)室溫度23?28°C，15?25天，濕度75 %?85%，光照強度3000?35001ux，同樣可獲得 健壯無根苗；
[0047] (6)將步驟（5)中獲得的健壯無根苗在試管生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基 +ΙΒΑ0. 2mg/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L+瓊脂6. 8g/L+蔗糖20g/L，ρΗ5· 8)中進行生根培 育，培養(yǎng)室溫度23?28°C，培養(yǎng)20?30天，濕度75 %?85%，光照強度3500?4500lux， 亦可獲得朝鮮薊優(yōu)質種苗；
[0048] (7)將步驟（6)獲得的種苗露地繁育（結果與圖4相近）。
[0049] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種朝鮮薊試管實生苗莖尖快繁育苗的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將朝鮮薊（Cynara scolymus L.)種子進行物理處理后，再經(jīng)消毒劑消毒，然后在種 子培養(yǎng)基中進行試管內播種、培育，將培育發(fā)芽的種子挑出至新鮮的種子培養(yǎng)基中進行自 然光照，獲得無菌實生苗； (2) 在無菌條件中進行如下操作，將步驟（1)獲得的無菌實生苗切取0. 7?1. Omm的實 生苗莖尖轉入?yún)惭空T導培養(yǎng)基中進行誘導，再轉入自然光照下進行培養(yǎng)，獲得叢芽，然后將 叢芽轉至繼代培養(yǎng)基中，經(jīng)繼代培養(yǎng)后獲得無根苗； (3) 將步驟（2)獲得的無根苗轉至試管生根培養(yǎng)基中，進行試管生根培育獲得朝鮮薊 優(yōu)質種苗。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的消毒劑的組成及消毒 條件為75%酒精158+2%似(：10(10?15)11^11+18/1取(：1 2(10?15)11^11。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的種子培養(yǎng)基的組成為 MS 培養(yǎng)基 +GA3 (0 ?3. 0) mg/L+NAA (0 ?0· 2) mg/L+ 活性炭（0 ?2) g/L+ 卡拉膠（6. 8 ?7) g/L+蔗糖30g/L，pH5. 5?5. 7,其中，NAA為零時，GA3和活性炭均不為零。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的叢芽誘導培養(yǎng)基的組 成為 MS 培養(yǎng)基 +6-BA (2. 0 ?5. 0) mg/L+NAA (0· 2 ?0· 5) mg/L+KT (0 ?0· 2) mg/L+ 瓊脂 6. 8g/ L+ 鹿糖 30g/L，ρΗ5· 6。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的繼代培養(yǎng)基的組成為 MS 培養(yǎng)基 +ΝΑΑ (0 ?0· 5) mg/L+GA3 (0 ?0· 5) mg/L+6-BA (0 ?1. 5) mg/L+CM (0 ?50) g/L+ 卡 拉膠7g/L+蔗糖30g/L，pH5. 5?5. 7,其中，NAA、GA3、6-BA與CM不能同時為零。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述的試管生根培養(yǎng)基的組 成為1/2MS培養(yǎng)基+IBA (0· 2?1. 0) mg/L+香蕉泥（0?50) g/L+活性炭（0?2) g/L+瓊脂 6. 8g/L+ 鹿糖 20g/L，ρΗ5· 5 ?5. 8。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中所述的物理處理的條件為黑 暗條件下30?35°C恒溫浸泡12?24h ; 步驟（1)中所述的培育的條件為黑暗條件下，環(huán)境溫度23?28°C培育15?25天，培 養(yǎng)濕度為70 %?85% ; 步驟（1)中所述的進行自然光照的條件為23?28 °C自然光照30?40天，濕度為 70%?85%。
8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的誘導的條件為黑暗條 件下23?28°C誘導培養(yǎng)10?15天； 步驟（2)中所述的自然光照下進行培養(yǎng)的條件為待莖尖膨大1?2倍后轉入培養(yǎng) 室自然光下培養(yǎng)15?20天，待開始轉綠而且有芽點出現(xiàn)時適當增加光照強度至2500? 30001ux，再培養(yǎng)25?35天。
9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的繼代培養(yǎng)的條件為溫 度23?281：培養(yǎng)15?25天，濕度為70%?85%，光照強度3000?350011?。
10. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述的生根培育的條件為溫 度23?28°C培育20?30天，濕度為70%?85%，光照強度3000?45001ux。
【文檔編號】A01H4/00GK104145825SQ201410449833
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權日:2014年9月4日
【發(fā)明者】李進進, 廖俊杰, 張建軍, 曾佑煒, 高陽林 申請人:東莞市睿紳生物技術有限公司, 廣東輕工職業(yè)技術學院