一株莫哈韋芽孢桿菌菌株、微生物菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一株莫哈韋芽孢桿菌BacillusmojavensisQLY002菌株，保藏編號為CGMCCNo.8905。本發(fā)明還提供該菌株的微生物菌劑、其制備方法及在馬鈴薯病原菌抑菌和對馬鈴薯促生作用中的應(yīng)用。本發(fā)明的菌株和菌劑能夠作為微生物農(nóng)藥和肥料使用，能夠抑制馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯早疫病原菌、馬鈴薯干腐病菌和馬鈴薯炭疽病菌，其抑菌率在61%以上；對馬鈴薯有促進作用，可以作為馬鈴薯專用微生物農(nóng)藥和微生物肥料使用，從而可以克服現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差的缺陷，以實現(xiàn)環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的優(yōu)點。
【專利說明】一株莫哈韋芽孢桿菌菌株、微生物菌劑及其制備方法和應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥和微生物肥料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株莫哈韋芽孢桿菌 Bacillus mojavensis QLY002菌株及其微生物菌劑和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量、頻繁使用，環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和增加抗性等問題也越來越 嚴(yán)重，植物病害的生物防治成為了研究熱點，其中尤以植物內(nèi)生菌作為拮抗菌的研究得到 眾多學(xué)者的觀注。植物內(nèi)生細(xì)菌是指生活在植物的根、莖、葉、花、果實和種子中，但對植物 沒有任何實質(zhì)性傷害的細(xì)菌，其具有多種生物學(xué)功能，特別是抑菌功能成為生防菌資源的 有力支撐。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌對植物有促進生長的作用，這些促生作用主要體現(xiàn)在內(nèi)生 細(xì)菌通過產(chǎn)IAA、固氮作用和通過解磷或溶磷作用使植物能夠盡可能的得到養(yǎng)分的補充，從 而使植物對生物量進行了積累；植物內(nèi)生細(xì)菌也可以通過分泌抑菌物質(zhì)、與病原菌競爭營 養(yǎng)空間及誘導(dǎo)植物獲得抗病性阻止或降低病原菌對植物的侵染或造成的危害。以內(nèi)生細(xì)菌 為菌種資源研制的微生物農(nóng)藥不易產(chǎn)生抗藥性，不傷害天敵，且能利用農(nóng)副產(chǎn)品甚至工業(yè) 廢水廣泛生產(chǎn)，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)后為生產(chǎn)綠色或無公害農(nóng)產(chǎn)品提供了一個新的途徑。
[0003] 大量使用化學(xué)氮肥、磷肥和鉀肥會導(dǎo)致重金屬在土體中累積、資源與能源大量消 耗、環(huán)境污染，且其利用率低，未被吸收利用的氮肥在農(nóng)田中流失或揮發(fā)，對地下水資源、土 壤和空氣造成了嚴(yán)重污染，使農(nóng)畜產(chǎn)品的有毒物質(zhì)超標(biāo)，給人類健康帶來了極大的危害，同 時化肥的長期大量施用破壞土壤團粒結(jié)構(gòu)，造成土壤板結(jié)，肥力下降。
[0004] 微生物肥料作為一種新型肥料，施入土壤后，通過其特定菌株的快速繁殖，能固定 大氣中的氮素、釋放土壤中固定態(tài)的磷、鉀元素，使得環(huán)境的養(yǎng)分潛力得以充分發(fā)揮，并為 作物生長營造一個良好的土壤微生物環(huán)境，在減少化肥用量、降低環(huán)境污染、提高農(nóng)作物品 質(zhì)等方面具有重要意義。尤其是集抑菌、固氮、解磷、解鉀和作物生長素于一身的復(fù)合微生 物肥料的研發(fā)，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中有舉足輕重的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥和化肥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全 性差的缺陷，提供一株莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002菌株，利用所述內(nèi)生 細(xì)菌莫哈韋芽孢桿菌的廣譜殺菌活性和促生能力，來制備環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安 全性好的內(nèi)生細(xì)菌莫哈韋芽孢桿菌微生物菌劑。
[0006] 本發(fā)明從高寒草地珠芽寥（Polygonum viviparum)、紫花針茅（Stipa purpurea Griseb),線葉嵩（Kobreasia Capillifolia),秦究（Gentiana macrophy pall)和乳白香 青（Anaphalis Lactea Maxin)等的內(nèi)生細(xì)菌中篩選獲得一株對馬鈴薯病原菌具有抑菌和 對馬鈴薯具促生作用的內(nèi)生細(xì)菌：莫哈韋芽孢桿菌菌株，該菌株的拉丁文名稱為Bacillus mojavensis QLY002,并對其生物學(xué)功能進行了研究，優(yōu)化了其培養(yǎng)條件及發(fā)酵條件，并進 行了防治試驗，提供了一株生物防治和生物菌肥的菌種資源和其菌劑的制備方法。本申請 人將莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 8905,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，保藏單位簡稱：CGMCC，保藏日期為2014年03月10日。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養(yǎng)基， 所述菌體為莫哈韋芽孢桿菌菌株CGMCC No. 8905。
[0008] 優(yōu)選地，在每毫升所述微生物菌劑中，莫哈韋芽孢桿菌菌株CGMCC No. 8905的活菌 數(shù)為 4. 12 X 101CI-1. 59 X 10nCFU。
[0009] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的組分和含量包括：氯化銨10-18. 5g/L，玉米粉14-24g/L，馬 鈴薯180-280g/L ;pH值為7. 2-8. 2,溶劑為蒸餾水或無離子水。
[0010] 最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的組分和含量包括：氯化銨14. 25g/L，玉米粉19g/L，馬鈴 薯230g/L ;pH值為7. 7,溶劑為蒸餾水或無離子水。
[0011] 優(yōu)選地，在微生物菌劑中，所述菌體的質(zhì)量百分比含量為5-11 %，其余為培養(yǎng)基。
[0012] 本發(fā)明通過以下試驗來確定莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)的最適培養(yǎng)基。
[0013] 將莫哈韋芽孢桿菌 Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)分別接種于 標(biāo)號依次為A、B、C、D、E、F和G的培養(yǎng)基中，觀測莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)在這7種培養(yǎng)基中的生長能力。
[0014] 經(jīng)觀測，發(fā)現(xiàn)莫哈韋芽孢桿菌 Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)在 這7種培養(yǎng)基中均能生長，但活菌數(shù)有差異。其中，對莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)在這7種培養(yǎng)基中活菌數(shù)的測定結(jié)果參見圖1。
[0015] 在圖1中，"A"表示營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar，簡稱NA)培養(yǎng)基，在NA培養(yǎng)基中， 包括牛肉胨5. 0g、蛋白胨10. 0g、蔗糖20. 0g和蒸餾水/去離子水1000mL ;"B"表示PDA培 養(yǎng)基，在PDA培養(yǎng)基中，包括馬鈴薯200. 0g、蛋白胨10. 0g、蔗糖20. 0g和蒸餾水/去離子水 1000mL;"C"表示營養(yǎng)肉湯（Nutrient Broth，簡稱NB)培養(yǎng)基，在NB培養(yǎng)基中，包括牛肉 胨3. 0g、蛋白胨5. 0g、葡萄糖2. 5g和蒸餾水/去離子水1000mL ;"D"表示酵母葡萄糖固體 (即NYDA)培養(yǎng)基，在NYDA培養(yǎng)基中，包括牛肉胨8. 0g、酵母浸膏5. 0g、葡萄糖10. 0g和蒸 餾水/去離子水l〇〇〇mL ;"E"表示第一玉米淀粉培養(yǎng)基，在第一玉米淀粉培養(yǎng)基中，包括玉 米淀粉2. 5g、(NH4)2S04 10. 0g、鹿糖10. 0g和蒸饋水/去離子水1000mL ;"F"表示第二玉米 淀粉培養(yǎng)基，在第二玉米淀粉培養(yǎng)基中，包括玉米淀粉3. 0g、(NH4)2S0410. 0g、KH2P04 15. 0g、 蔗糖l〇g和蒸餾水/去離子水l〇〇〇mL ;"G"表示蛋白胨培養(yǎng)基，在蛋白胨培養(yǎng)基中，包括蛋 白胨10. 〇g、酵母浸膏5. 0g、NaCl 10. 0g和蒸餾水/去離子水1000mL。
[0016] 由圖1可知，在相同的條件下，選擇7種不同的培養(yǎng)液培養(yǎng)莫哈韋芽孢桿菌CGMCC No. 8905,其活菌量有明顯差異。B培養(yǎng)液中活菌數(shù)1. 045 X 109CFU/mL，培養(yǎng)液E和F中活菌 數(shù)均低于3 X 103CFU/mL，培養(yǎng)液A，C，D和G活菌數(shù)顯著低于B培養(yǎng)液?？梢?，培養(yǎng)液B較為 理想，因此，馬鈴薯200. 0g、蛋白胨10. 0g、蔗糖20. 0g、水1000mL為莫哈韋芽孢桿菌CGMCC No. 8905的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0017] 在確定PDA培養(yǎng)基為最適合莫哈韋芽抱桿菌Bacillus mojavensis QLY002 (CGMCC No. 8905)生長的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進一步利用正交法對PDA培養(yǎng)基中碳氮源含量和pH值進 行優(yōu)化。
[0018] 1、碳源的優(yōu)化：
[0019] 將莫哈韋芽孢桿菌 Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)以 5% 的接種 量，以玉米粉、馬鈴薯、玉米淀粉、白砂糖和不加碳源為處理，以150r/min的轉(zhuǎn)速，在28°C的 溫度條件下發(fā)酵24h后，測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。
[0020] 經(jīng)綜合測定，用4種不同的碳源培養(yǎng)，莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)活菌量有明顯差異，而以玉米粉處理中的活菌量為5. 5X109 CFU/ mL顯著高于其他碳源。因此，玉米粉為篩選出的較優(yōu)碳源。
[0021] 2、氮源的優(yōu)化：
[0022] 將莫哈韋芽孢桿菌 Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)以 5% 的接種 量，以硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、黃豆粉和不加氮源為處理，以150r/min的轉(zhuǎn)速，在28°C的溫 度條件下發(fā)酵24h后，測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。
[0023] 經(jīng)綜合測定，用4種不同的氮源培養(yǎng)，莫哈韋芽孢桿菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No. 8905)活菌量有明顯差異，當(dāng)?shù)礊槁然@時活菌數(shù)為1.41X101(I CFU/ mL，顯著高于其他氮源所對應(yīng)的活菌數(shù)，因此，選取氯化銨作為最優(yōu)培養(yǎng)基的氮源。
[0024] 3、pH值的優(yōu)化：
[0025] 通過培養(yǎng)基及碳氮源篩選，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)液的主要成分為氯化銨、玉米粉和 馬鈴薯，培養(yǎng)液的pH為7,對各因子取不同水平的值（參見表1)。根據(jù)響應(yīng)曲面法 (Box-Behnken)設(shè)計，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2,利用Design-Expert 7. 0軟件進行二次多項 回歸擬合，得出菌株QLY002(CGMCC No. 8905)的活菌數(shù)對氯化銨、玉米粉、馬鈴薯及pH的動 態(tài)響應(yīng)模型：
[0026] Y =
[0027] 2. 503X 1010+5. 939X 10%+5, 569X 109X2+6. 165X 10%+3, 905X 10%-1, 151 X 1 0^^2+2. 918 X 10^^3+6. 576 X 10^^-7. 193 X 109X2X4+2. 507 X 109X3X4-7. 751 X 10%2-4, 6-69X 109X22-1. 689X 109X32-2. 059 X 109X42-6. 144 X 10%%+3, 103 X 10%%+2, 774 X ΙΟ^Χ/ +1. 541 X 109X22X4
[0028] R2 = 0. 9714,矯正決定系數(shù)Adj-R2 = 0. 9273,式中Y為莫哈韋芽孢桿菌CGMCC No. 8905活菌數(shù)的預(yù)測值。由矯正決定系數(shù)可以認(rèn)為回歸模型擬合程度較好；氯化銨、玉米 粉、馬鈴薯及pH對活菌數(shù)的影響顯著，該模型（P>F)P〈0. 0001，表明回歸方程的擬合度極顯 著，矢擬項（P>F)P = 0. 196,表明該模型在實際擬合中所占的非正常誤差較??；因此，可通 過回歸模型預(yù)測菌株莫哈韋芽孢桿菌CGMCC No. 8905的最佳培養(yǎng)條件。該模型預(yù)測當(dāng)氯化 銨、玉米粉和馬鈴薯的添加量分別為14. 25g/L、19g/L、230g/L ;培養(yǎng)液pH為7. 7時，莫哈韋 芽孢桿菌CGMCC No. 8905菌株的活菌數(shù)有最大值3. 27X 101(lCFU/mL ;經(jīng)在該培養(yǎng)條件下驗 證，莫哈韋芽孢桿菌CGMCC No. 8905菌株的活菌數(shù)可達(dá)3. 48 X 101(lCFU/mL，與預(yù)測值差異不 顯著。說明莫哈韋芽孢桿菌CGMCC No. 8905菌株的最佳培養(yǎng)液配方為氯化銨14. 25g/L、玉 米粉 19g/L、馬鈴薯 230g/L，ρΗ7· 7。
[0029] 表1 :響應(yīng)曲面設(shè)計試驗各因子取值范圍
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一株莫哈韋芽孢桿菌菌株，其特征在于：所述莫哈韋芽孢桿菌菌株 QLY002 的保藏編號為：CGMCC No.8905。
2. -種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養(yǎng)基，其特征在于：所述菌體為莫哈 韋芽孢桿菌菌株CGMCC No. 8905。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于：在每毫升所述微生物菌劑中，莫哈 韋芽孢桿菌菌株CGMCC No. 8905的活菌數(shù)為4. 12X 101° -1. 59X 10nCFU。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于：所述培養(yǎng)基的組分和含量包 括：氯化銨10-18. 5g/L，玉米粉14-24g/L，馬鈴薯180-280g/L ;pH值為7. 2-8. 2,溶劑為蒸 餾水或無離子水；作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基的組分和含量包括：氯化銨14. 25g/L，玉米粉19g/ L，馬鈴薯230g/L ;pH值為7. 7,溶劑為蒸餾水或無離子水。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的微生物菌劑，其特征在于：在微生物菌劑中，所述菌體 的質(zhì)量百分比含量為5-11%，其余為培養(yǎng)基。
6. 權(quán)利要求2-5任一所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于：步驟如下：將莫哈韋 芽孢桿菌菌株CGMCC No. 8905接種至培養(yǎng)基中，在溫度為26-30°C、轉(zhuǎn)速為150-210r/min和 溶氧量為50%-70%的條件下，進行液體發(fā)酵32-40h，制得發(fā)酵液，即得到微生物菌劑；優(yōu)選 地，是在接種量為8%、溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為180r/min和溶氧量為60%的條件下，進行液體發(fā) 酵36h，制得發(fā)酵液，得到微生物菌劑。
7. 權(quán)利要求1所述的莫哈韋芽孢桿菌菌株和權(quán)利要求2-5任一所述的微生物菌劑在制 備馬鈴薯專用微生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的莫哈韋芽孢桿菌菌株和權(quán)利要求2-5任一所述的微生物菌劑在制 備馬鈴薯專用微生物肥料中的應(yīng)用。
9. 一種微生物農(nóng)藥，其含有權(quán)利要求1所述的莫哈韋芽孢桿菌菌株或權(quán)利要求2-5任 一所述的微生物菌劑。
10. -種微生物肥料，其含有權(quán)利要求1所述的莫哈韋芽孢桿菌菌株或權(quán)利要求2-5任 一所述的微生物菌劑。
【文檔編號】A01P3/00GK104152385SQ201410390702
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】楊成德, 陳秀蓉, 薛莉, 暢濤, 李振東 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)