一株拮抗植物病原菌的菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的應(yīng)用。本發(fā)明拮抗菌為枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?ZSH-1，微生物保藏號(hào)為CGMCC?NO.9025。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?ZSH-1是從楊樹根部土壤中分離獲得，能防治楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌和棗縮果病菌引起的植物病害，并且本發(fā)明的拮抗菌產(chǎn)生的抑菌揮發(fā)物也能防治楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌和棗縮果病菌引起的植物病害?？莶菅挎邨U菌Bacillus?subtilis?ZSH-1是一種防效高，防治范圍廣，環(huán)境安全性好的生物防治潛力菌株，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說明】一株括抗植物病原菌的菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株細(xì)菌菌株，特別涉及一株產(chǎn)抑菌揮發(fā)物的植物病原真菌的拮抗細(xì)菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域，可用于植物保護(hù)，防治植物病害。

【背景技術(shù)】
[0002]植物病害的生物防治是指通過人以外的一種或多種生物來降低病原菌數(shù)量或減弱病原菌的致病活力，從而減少病害的發(fā)生，并且有利于有益生物如作物、樹木、動(dòng)物、益蟲及微生物。植物病害生物防治上可供利用的微生物種類包括真菌、放線菌、細(xì)菌、病毒甚至高等植物等。其中，枯草芽孢桿菌是最常用到的拮抗微生物之一。
[0003]枯草芽胞桿菌是一種廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽性細(xì)菌，在土壤和植物的表面普遍存在，同時(shí)還是植物體內(nèi)常見的一種內(nèi)生菌，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境。它生長速度快、營養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，在植物的表面易于存活、定殖和與繁殖，而且生產(chǎn)枯草芽胞桿菌制劑的工藝簡(jiǎn)單，制劑穩(wěn)定，施用方面，存儲(chǔ)期長，是一種理想的生防微生物。近幾年來，國內(nèi)外專家進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌有很多的抑菌機(jī)制。包括營養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)；分泌抗菌物質(zhì)，如抗菌肽和蛋白類物質(zhì)等；溶菌作用，使病原菌菌體破裂、解體等以及促進(jìn)植物生長的作用。
[0004]植物病害是世界上一種非常普遍的自然災(zāi)害。植物病害在世界范圍分布廣泛，其種類繁多，侵染的寄主植物廣，造成生態(tài)、經(jīng)濟(jì)以及社會(huì)的損失巨大。例如，板栗疫病幾乎毀滅了全部美國的美國栗林。榆樹荷蘭病的發(fā)生使歐洲許多國家的城市庭園、行道榆樹大量死亡。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織((FAO)統(tǒng)計(jì)，每年因遭受植物病害引起的減產(chǎn)平均損失為總產(chǎn)量的10%~15%。植物病害在我國也有廣泛的發(fā)生，其中楊樹炭疽病就是一種重要的病害。楊樹是我國造林綠化、生態(tài)環(huán)境建設(shè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要樹種，具有適應(yīng)性廣、生長速度快等特點(diǎn)。目前，我國楊樹林面積已經(jīng)超過800萬ha，蓄積量達(dá)到4.29億m3，居世界首位，超過其他國家的楊樹人工林面積的總和。近年來，楊樹炭疽病等病害的發(fā)生給我們國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失。楊樹炭疽病的主要病原為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeospor1ides)。其主要侵染楊樹的葉片和枝條,引起早期的落葉和枯梢，導(dǎo)致樹勢(shì)降低而誘發(fā)其它次期性生物災(zāi)害或枯死。我國南北楊樹栽培區(qū)中楊樹炭疽病均有不同的危害。陜西省毛白楊(Populus tomentosa)當(dāng)年扦插苗發(fā)病株率可達(dá)78%,4~5年幼樹發(fā)病株率可達(dá)100%，葉片受害率達(dá)100%。京津冀地區(qū)作為防護(hù)林、行道樹廣泛栽植的北京楊(PopulusXbeijingens)的炭疽病發(fā)病尤為嚴(yán)重，2005年延慶、昌平防護(hù)林的病株率高達(dá) 100%。
[0005]目前，植物病害的防治主要是使用化學(xué)農(nóng)藥(殺菌劑)，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用不僅使植物病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會(huì)污染環(huán)境，影響人類健康，破壞生態(tài)環(huán)境。隨著可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到了使用化學(xué)農(nóng)藥的弊端。自20世紀(jì)80年代中期，在生物防治蓬勃發(fā)展的帶動(dòng)下，植物病害的生物防治作為了一種安全、有效的控制植物病害的新途徑，漸漸被人們所重視，并成為熱點(diǎn)研究方向。應(yīng)用枯草芽孢桿菌來防治植物病害已經(jīng)有很多的報(bào)道。從楊樹根部土壤中分離篩選獲得的一株能廣譜的高效抑制植物病原真菌并能產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物的拮抗菌，使生物防治應(yīng)用范圍更加廣泛、使用更加靈活，拮抗菌產(chǎn)生的抑菌揮發(fā)物為防治植物真菌病害提供了一個(gè)新的思路和方法，這些對(duì)于植物真菌病害的防治具有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是針對(duì)植物病害防治中存在的植物病原菌產(chǎn)生抗藥性的技術(shù)問題提供一株抑菌譜廣、植物病原真菌抑制效率高、而且還能產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物的枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis ZSH-1。
[0007]本發(fā)明從楊樹根部土壤中分離篩選獲得的拮抗菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1對(duì)多種植物病原真菌具有高效拮抗作用并且還能產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，是一種廣譜生防細(xì)菌菌株，應(yīng)用本發(fā)明的拮抗菌Bacillus subtilis ZSH-1的菌株解決了目前植物病害化學(xué)農(nóng)藥防治難，環(huán)境污染嚴(yán)重的問題。
[0008]本發(fā)明的目的之二是提供上述拮抗菌株Bacillus subtilis ZSH-1在防治植物病原真菌方面的用途，拮抗菌株Bacillus subtilis ZSH-1在防治楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌和棗縮果病菌上的多種應(yīng)用，特別是在防治由膠孢炭疽菌引起的楊樹炭疽病方面的用途。
[0009]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0010]本發(fā)明的拮抗菌為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1,其微生物保藏號(hào)是:CGMCC N0.9025 ;分類命名是:Bacillus subtilis ;保藏時(shí)間:2014年4月9日；保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
[0011]本發(fā)明的拮抗菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1能高效防治楊樹炭疽病,抑制楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌和棗縮果病菌；而且還能產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物，產(chǎn)生的抑菌揮發(fā)物也能很好的抑制楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌和棗縮果病菌的生長。
[0012]本發(fā)明所述拮抗楊樹炭疽病菌的細(xì)菌菌株的形態(tài)特征:
[0013]枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1為革蘭氏陽性桿菌，菌體大小約0.5-0.8umXl.2-2.5um，有芽孢，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。
[0014]菌體在LB培養(yǎng)基平板上呈白色，不透明，菌落光滑，圓形，中央隆起，邊緣完整。
[0015]其中，每100ml所述LB培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉 15g，水 1000ml, ρΗ7.0-7.2。
[0016]本發(fā)明拮抗楊樹炭疽病菌的細(xì)菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1的分離篩選方法:
[0017]I)取楊樹根部土壤5g,裝入裝有45mL無菌水的滅菌三角瓶中，于28°C下180rpm振蕩30min，靜置，得到的菌懸液(即為KT1的土壤稀釋液，也就是稀釋10倍的土壤溶液)；然后用10倍梯度稀釋法依次稀釋得到10_3、10_4、10_5濃度梯度的稀釋液，從各個(gè)濃度梯度懸浮液中分別取0.lmL，用無菌涂布棒涂于LB培養(yǎng)基平板上，以無菌水為對(duì)照，涂抹均勻后放到恒溫箱中28°C恒溫倒置培養(yǎng)。
[0018]2)連續(xù)觀察8天后，挑取菌落形態(tài)不同的菌株，再次在LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，獲得多株楊樹根部土壤細(xì)菌菌株，并在4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0019]3)將楊樹炭痕病囷(購自中國林業(yè)微生物囷種保減管理中心，保減編號(hào)CFCC80308)接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基PDA (每100mL含有馬鈴薯200g，葡萄糖20g，，瓊脂粉17g，水1000ml，pH7.0-7.2)平板上，在28°C條件下，恒溫培養(yǎng)7d后用6mm打孔器打取菌餅，并將新鮮的、直徑為6mm的楊樹炭疽病菌菌餅置于另一 PDA平板中央，接著用接種環(huán)分別挑取少許步驟2)分離純化后的土壤細(xì)菌，并在距離楊樹炭疽菌菌餅2cm處輕輕劃線，放置于培養(yǎng)箱中，28°C恒溫倒置對(duì)峙培養(yǎng)，每個(gè)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。
[0020]4)培養(yǎng)7天后觀察并記錄抑菌帶的有無以及大小，選出對(duì)楊樹炭疽病菌具有最強(qiáng)抑制效果，抑菌帶最寬的土壤細(xì)菌菌株。
[0021]觀察結(jié)果表明ZSH-1菌株的抑菌效果最好，抑菌帶寬度最寬，抑菌帶寬度> 10mm。
[0022]本發(fā)明枯草芽孢桿菌菌株Bacillus subtilis ZSH-1的篩選及防治楊樹炭疽病菌特性測(cè)定采用的培養(yǎng)基如下:
[0023]篩選培養(yǎng)基(LB平板培養(yǎng)基)成分:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉 15g，水 1000ml, ρΗ7.0-7.2。
[0024]NB液體培養(yǎng)基成分:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，水1000ml, ρΗ7.0-7.2。
[0025]馬鈴薯瓊脂(PDA)平板培養(yǎng)基成分:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉17g，水1000ml, ρΗ7.0-7.2。
[0026]發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)成分:葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g, KH2PO4L Og,MgSO4.7H20 0.5g, NH4Cl 3.0g, Na2HPO4 1.0g，酵母浸粉 0.5g，水 1000ml, ρΗ7.0-7.2。
[0027]TYB固體培養(yǎng)基成分:胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉膏3g，葡萄糖20g，KH2PO40.5g, MgSO4 0.3g，MnSO4 0.07g, FeSO4 0.3g，檸檬酸 0.3g，瓊脂 15g，水 1000ml，ρΗ7.0_7.2。
[0028]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的培養(yǎng)特性:
[0029]本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1生長溫度范圍為10°C~50°C，最適生長溫度范圍為28°C~30°C;生長pH范圍為5~10，最適生長pH范圍為6~7.5 ;能在0.2%~10%的NaCl濃度的NB培養(yǎng)基中生長。能氧化L-阿拉伯糖、甘露醇、D-木糖，產(chǎn)酸；能氧化葡萄糖，但不產(chǎn)氣，接觸酶、氧化酶、V-P實(shí)驗(yàn)呈陽性，具有水解淀粉、酪蛋白、卵磷脂的能力，不能水解酪氨酸、苯丙氨酸，能利用丙二酸鹽，不能利用檸檬酸鹽，具有糖酵解能力、硝酸鹽還原能力，能產(chǎn)硫化氫，能液化明膠，石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)變紅。
[0030]根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)照菌株ZSH-1的形態(tài)特征、生理生化特性以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定菌株ZSH-1為Bacillus屬菌株，并確認(rèn)本發(fā)明菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1。
[0031]本發(fā)明還包括以上述菌株的能高效防治楊樹炭疽病的菌株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1，微生物保藏號(hào)為CGMCC N。.9025的各種代謝產(chǎn)物。
[0032]以上述枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1，微生物保藏號(hào)為CGMCC N0.9025為活性成分的生物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在需要的時(shí)候，該菌劑中還可包含菌劑制備中常用的載體和輔料。
[0033]本發(fā)明的拮抗楊樹炭疽病菌的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1在防治楊樹炭疽病中的應(yīng)用；所述應(yīng)用還包括枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、無菌濾液、培養(yǎng)物、生長過程中產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物(抑菌揮發(fā)物)在防治楊樹炭疽病中的應(yīng)用；所述應(yīng)用又包括枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹炭疽病病菌的離體防治。
[0034]其中，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的菌液、無菌濾液及抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹炭疽病菌的平板抑制作用明顯。菌株ZSH-1的菌液在6d內(nèi)對(duì)楊樹炭疽病菌的平板抑制率達(dá)到100%，ZSH-1的無菌濾液在6d內(nèi)對(duì)楊樹炭疽病菌的平板抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減小，在第Id時(shí)抑制率達(dá)到100%，在第6d時(shí)抑制率達(dá)到48.49%。ZSH-1生長過程中產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物(抑菌揮發(fā)物)在60h內(nèi)對(duì)楊樹炭疽病的平板抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大，在60h時(shí)，其抑制率達(dá)到30.06%。
[0035]另外，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的菌液和生長過程中產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物(抑菌揮發(fā)物)對(duì)楊樹炭疽病菌的離體葉片防治效果明顯。ZSH-1的菌液在不同的處理下對(duì)楊樹炭疽病菌的離體葉片防治效果明顯。其中，先在離體葉片上接種ZSH-1菌液，培養(yǎng)2d后再接種楊樹炭疽病菌孢子的處理的離體葉片防治效果最好，抑制率達(dá)到100%。ZSH-1的抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹炭疽病菌也有很好的離體葉片防治效果，其抑制率達(dá)到35.83%。
[0036]另一方面，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1用于拮抗楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌；還包括枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、無菌濾液、培養(yǎng)物、生長過程中產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物(抑菌揮發(fā)物)用于拮抗楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌。
[0037]ZSH-1無菌濾液對(duì)楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、海棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌的抑制效果強(qiáng)烈，對(duì)蘋果腐爛病菌也有很好的抑制作用，其中對(duì)楊樹腐爛病菌的抑制率達(dá)到100%。另外，ZSH-1抑菌揮發(fā)物也對(duì)這些植物病原真菌的平板抑制效果明顯，其對(duì)楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、海棠腐爛病菌的抑制活性很強(qiáng)，對(duì)蘋果腐爛病菌和棗縮果病菌的抑制活性也比較好，對(duì)尖孢鐮刀菌也有一定的抑制活性，其中，ZSH-1抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹腐爛病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)到63.22%。
[0038] 本發(fā)明的拮抗楊樹炭疽病菌的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1在防治楊樹炭疽病方面的作用極為顯著，對(duì)楊樹炭疽病菌有很強(qiáng)的抑制作用，能明顯抑制楊樹炭疽病菌菌絲的生長，并且枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1能產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物，抑制楊樹炭疽病菌菌絲的生長。另外，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的無菌濾液和抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌也有很好的平板抑制活性?？莶菅挎邨U菌Bacillus subtilis ZSH-1作為生物防治菌株，具有很好的防治楊樹炭疽病菌引起的植物病害的潛力，同時(shí)它也有生物防治菌株來防治楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌引起的植物病害的潛力，為防治由楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌引起的植物病害提供了一條環(huán)保、簡(jiǎn)單、有效的途徑，利于環(huán)境保護(hù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1在LB平板培養(yǎng)基的菌落形態(tài)圖。
[0040]圖2為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的顯微形態(tài)圖(10X 500)。
[0041]圖3為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；；圖中拉丁名后為相應(yīng)囷株在Genbank的編號(hào)。
[0042]圖4為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1菌液、無菌濾液對(duì)楊樹炭疽病菌的平板抑制效果圖，其中A為空白對(duì)照組平板培養(yǎng)圖；B為ZSH-1菌液對(duì)楊樹炭疽病菌抑制效果圖；C為ZSH-1無菌濾液對(duì)楊樹炭疽病菌的平板抑制效果圖。
[0043]圖5為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1培養(yǎng)過程中產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹炭疽病菌的平板抑制效果圖，其中A為空白對(duì)照組平板培養(yǎng)圖；B為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹炭疽病菌抑制效果圖。
[0044]圖6為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1對(duì)楊樹炭疽病的離體葉片防治效果圖，其中A為空白對(duì)照組的離體葉片防治效果圖；B為處理I組的離體葉片防治效果圖；C為處理II組的離體葉片防治效果圖；D為處理III組的離體葉片防治效果圖。
[0045]圖7為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1培養(yǎng)過程中產(chǎn)生抑菌揮發(fā)物對(duì)楊樹炭疽病菌的離體葉片防治效果圖，其中A為對(duì)照組的離體葉片防治效果圖；B為拮抗處理組離體葉片防治效果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0047]下述實(shí)施例中的方法，無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0048]實(shí)施例1枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的分離、篩選及其鑒定
[0049]1、枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis ZSH-1的分離與篩選
[0050]本發(fā)明的菌株采集自北京市海淀區(qū)北京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)站楊樹實(shí)驗(yàn)田土壤中。
[0051]1A)取楊樹根部土壤5g,裝入裝有45mL無菌水的滅菌三角瓶中，置于搖床上,在28°C條件下ISOrpm振蕩30min，靜置，得到的菌懸液(即為KT1濃度的土壤稀釋液)；然后采用10倍梯度稀釋法依次稀釋得到10_3、10_4、10_5濃度梯度的稀釋液，從各個(gè)濃度梯度懸浮液中分別取0.lmL，用無菌涂布棒涂于LB培養(yǎng)基平板上，以無菌水為對(duì)照，涂抹均勻后放到恒溫箱中28°C恒溫倒置培養(yǎng)；每個(gè)處理設(shè)置水平重復(fù)3組，其中LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，酵母提取物 5g, NaCl 10g，瓊脂粉 15g，水 1000ml, ρΗ7.0-7.2。
[0052]IB)連續(xù)觀察8天后，挑取菌落形態(tài)不同的菌株，再次在LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，獲得多株土壤細(xì)菌菌株，并在4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0053]1C)將楊樹炭疽病菌(購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CFCC80308)接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基PDA平板上，在28°C條件下，恒溫培養(yǎng)7d后用6mm打孔器打取菌餅，并將新鮮的、直徑為6_的楊樹炭疽病菌菌餅置于另一 PDA平板中央，接著用接種環(huán)分別挑取少許步驟1B)分離純化后的土壤細(xì)菌，并在距離楊樹炭疽菌菌餅2cm處輕輕劃線，放置于培養(yǎng)箱中，28°C恒溫倒置對(duì)峙培養(yǎng)，每個(gè)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，其中，PDA平板培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17g，水1000ml，pH7.0-7.2。
[0054]ID)培養(yǎng)7天后觀察并記錄抑菌帶的有無以及大小，選出對(duì)楊樹炭疽病菌具有最強(qiáng)抑制效果的I株楊樹土壤細(xì)菌菌株。
[0055]結(jié)果表明ZSH-1菌株的抑菌效果最好，抑菌帶寬度最寬，抑菌帶寬度> 10mm。
[0056]2、菌株ZSH-1的鑒定
[0057]參照東秀珠等人編著的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(北京:科學(xué)出版社，2001:349-398)以及蔡妙英等人編著的《芽孢桿菌屬》(北京:農(nóng)業(yè)出版社，1983:19-108)中介紹的方法以及16S rDNA對(duì)ZSH-1菌株進(jìn)行鑒定，鑒定出該菌株屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。
[0058]2A)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZSH-1在LB培養(yǎng)基(每100mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂粉15g，水1000ml, ρΗ7.0-7.2)平板上呈白色，不透明，菌落光滑，圓形，中央隆起，邊緣完整，如圖1所示。
[0059]2Β)通過顯微鏡觀察表明Bacillus subtilis ZSH-1菌體大小約
0.5-0.8umXl.2-2.5um之間，有芽孢，周生鞭毛，革蘭氏染色呈陽性，如圖2所示。
[0060]2C)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bacillus subtilis ZSH-1，好氧，接觸酶、氧化酶、V-P實(shí)驗(yàn)呈陽性，具有水解淀粉、酪蛋白、卵磷脂的能力，不能水解酪氨酸、苯丙氨酸，能利用丙二酸鹽，不能利用檸檬酸鹽，具有糖酵解能力、硝酸鹽還原能力，能產(chǎn)硫化氫，能液化明膠，石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)變紅。
[0061]依據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，進(jìn)一步對(duì)Bacillus subtilis ZSH-1菌株的形狀、大小、其它生理生化反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，明確形態(tài)和基本生理生化特性。本發(fā)明的Bacillussubtilis ZSH-1菌株的形態(tài)和基本生理生化特征如表1所示。
[0062]表1 Bacillus subtilis ZSH-1菌株的形態(tài)和基本生理生化特性
[0063]

【權(quán)利要求】
1.一株拮抗植物病原真菌的細(xì)菌菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ZSH-1)，其微生物保藏號(hào)為CGMCC N0.9025。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株，其特征是所述植物病原菌為楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株的菌株培養(yǎng)物、發(fā)酵培養(yǎng)液、發(fā)酵培養(yǎng)液的過濾液或培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物。
4.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)菌菌株為活性成分的生物菌劑。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株在拮抗楊樹炭疽病中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌菌株在拮抗植物病原菌中的應(yīng)用，其中，所述的病原菌為楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌。
7.如權(quán)利要求3所述的菌株培養(yǎng)物、發(fā)酵培養(yǎng)液、發(fā)酵培養(yǎng)液的過濾液或培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物在拮抗病原菌中的應(yīng)用，其中，所述病原菌為楊樹炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、柳樹腐爛病菌、蘋果腐爛病菌、甘棠腐爛病菌、尖孢鐮刀菌、棗縮果病菌。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK104164394SQ201410379855
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】田呈明, 黃華毅, 梁英梅, 于地美, 孫妍 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)