植物通過表達(dá)非哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶而表現(xiàn)出哺乳動(dòng)物類型的糖基化作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物通過表達(dá)非哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶而表現(xiàn)出哺乳動(dòng)物類型的糖基化作用。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及能以其野生型或修飾形式使用的非哺乳動(dòng)物β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)非哺乳動(dòng)物β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞，和產(chǎn)生糖基化作用改變的并優(yōu)選是哺乳動(dòng)物類型的糖基化作用的糖蛋白的方法。本發(fā)明另外還提供非哺乳動(dòng)物β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸分子和表達(dá)載體。
【專利說明】植物通過表達(dá)非晡乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶而表現(xiàn)出晡乳動(dòng)物類 型的糖基化作用
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00880016408. 0,申請日為2008年4月17日，發(fā)明名稱為"植 物通過表達(dá)非哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶而表現(xiàn)出哺乳動(dòng)物類型的糖基化作用"的中國專利申請 的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因植物中加工糖蛋白的領(lǐng)域，尤其涉及在用于生產(chǎn)重組生物藥 劑學(xué)蛋白的植物中加工糖蛋白的領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0003] 重組蛋白生產(chǎn)構(gòu)成了轉(zhuǎn)基因植物的重要應(yīng)用。除了重組蛋白的生產(chǎn)領(lǐng)域成本和產(chǎn) 量是有利的，轉(zhuǎn)基因植物比其他生產(chǎn)系統(tǒng)，如細(xì)菌，酵母，和動(dòng)物細(xì)胞具有一定的優(yōu)勢。事實(shí) 上，它們對人無傳染性，并能在存儲組織，如種子或塊莖中積累目的蛋白質(zhì)。這有利于在環(huán) 境溫度下將其處理，運(yùn)輸和儲存，而同時(shí)提供了隨后提取的可能性。此外，轉(zhuǎn)基因植物，或其 某些部分，可以用來作為藥物或疫苗的載體。
[0004] 雖然植物的蛋白類物質(zhì)工廠的優(yōu)勢主要是從生物制藥的角度解釋的，但植物也可 用于生產(chǎn)其他蛋白質(zhì)，例如，工業(yè)酶制劑等，因?yàn)樗鼈兊奶腔哪芰?，?dǎo)致例如更高的穩(wěn) 定性。目前，研究了利用植物生產(chǎn)用于治療和其他用途的異源蛋白，這些植物有大豆，煙草， 馬鈴薯，水稻和油菜，以及其中生產(chǎn)的糖蛋白包括單克隆抗體，激素，疫苗的抗原，酶和血液 蛋白。這些蛋白質(zhì)有一些已經(jīng)證明了它們在人體有效。
[0005] 在植物生產(chǎn)糖蛋白的缺點(diǎn)涉及到植物生產(chǎn)的糖蛋白的糖基化模式。像其他異源表 達(dá)系統(tǒng)一樣，與哺乳動(dòng)物相比，植物表現(xiàn)出不同的糖基化特征。與細(xì)菌（無 N-連接的聚糖） 和酵母（僅有高甘露糖型N-連接的聚糖）相比，植物能夠生產(chǎn)具有復(fù)雜類型的N相連的聚 糖的蛋白質(zhì)。然而，植物糖蛋白具有復(fù)雜的N-連接的聚糖，后者含有在哺乳動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)的 β 1，2-木糖和α 1，3-巖藻糖殘基。此外，植物糖蛋白缺乏在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的特征性的含 半乳糖的復(fù)雜的Ν-聚糖。
[0006] 總之，植物的糖蛋白分析顯示，盡管存在著相似之處，植物和哺乳動(dòng)物的糖基化途 徑在幾個(gè)步驟是不同的，特別是在復(fù)雜的聚糖合成中。植物的復(fù)雜聚糖通常要小得多，并且 包含β-1，2木糖或α-1，3巖藻糖殘基，連接至Man 3(GlcNAc)2核心上。已知糖蛋白上這些 殘基是免疫源性殘基，其導(dǎo)致帶有這些糖類的重組蛋白在某些應(yīng)用中存在一些問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 盡管已經(jīng)提出了或正在使用一些以植物為基礎(chǔ)的生產(chǎn)糖蛋白的系統(tǒng)，但是需要改 進(jìn)了的以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)用于人源化蛋白的生產(chǎn)。在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供 了這種改進(jìn)了的以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。
[0008] 以前提出的以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，例如，W001/31045(全部內(nèi)容納入本文）所述， 利用哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶用于人源化蛋白的生產(chǎn)。
[0009] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些以前沒有鑒定的糖基轉(zhuǎn)移酶，如那些來自非哺乳動(dòng)物，雞和斑 馬魚的糖基轉(zhuǎn)移酶，顯示出與已經(jīng)鑒定的哺乳動(dòng)物的β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的某些部分同 源，這表明在人源化蛋白的生產(chǎn)方面相對于以前的方法有意料不到的改進(jìn)。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供的生產(chǎn)能將半乳糖殘基以β-1，4-鍵加入到 Ν-連接的聚糖中的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法。這些方法包括將編碼非哺乳動(dòng) 物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸分子插入植物或植物細(xì)胞中，并選擇攝入編碼非哺乳動(dòng)物 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸分子和表達(dá)這種核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞， 從而產(chǎn)生出能將β -1，4鍵上的半乳糖殘基加入Ν-連接的聚糖中的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞。在某些【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶包含雞或斑馬魚的 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1。在某些【具體實(shí)施方式】中，雞β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1包含SEQ ID N0:2,而斑馬魚的β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1包含SEQ ID N0:14。在某些【具體實(shí)施方式】中， 雞或斑馬魚的非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶可增加能指導(dǎo)非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶在高爾基體內(nèi)定位的氨基酸序列。在某些【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物β-1，4-半 乳糖轉(zhuǎn)移酶可在Ν-末端增加對應(yīng)于哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1的Ν-末端氨基酸序 列的氨基酸序列。在某些【具體實(shí)施方式】中，Ν-末端氨基酸序列在前10個(gè)Ν-末端氨基酸中 至少包含序列[K/R]-X_[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基 酸。在某些【具體實(shí)施方式】中，N-末端氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQ ID N0:21)。在某 些【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的胞漿-跨膜-莖區(qū)（CTS)被另一 種定位在高爾基體的蛋白的CTS替代。在某些【具體實(shí)施方式】中，CTS來源于哺乳動(dòng)物或植 物的定位在高爾基體的蛋白。在某些【具體實(shí)施方式】中，CTS來源于哺乳動(dòng)物唾液酸轉(zhuǎn)移酶。 在某些【具體實(shí)施方式】中，CTS來源于大鼠 α 2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)包含一種或多種半乳糖基化Ν-連接聚 糖的異源性糖蛋白的方法，所述方法包含將編碼非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸 分子和編碼異源性糖蛋白的核酸分子插入植物或植物細(xì)胞中，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基 因植物細(xì)胞，并且在適于該核酸分子表達(dá)的條件下維持轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，藉 此產(chǎn)生包含一種或多種半乳糖基化的Ν-連接的聚糖的異源性糖蛋白。
[0012] 在某些【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶是雞β-1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶或斑馬魚β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶。在某些【具體實(shí)施方式】中，雞β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移 酶或斑馬魚β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶可在Ν-末端增加對應(yīng)于哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移 酶1的Ν-末端氨基酸序列。在某些【具體實(shí)施方式】中，雞β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或斑馬魚 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的CTS被另一種定位于高爾基體的蛋白的CTS取代。
[0013] 在某些【具體實(shí)施方式】中，方法進(jìn)一步包含將異源性糖蛋白從轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞中至少部分地分離出來。在某些【具體實(shí)施方式】中，糖蛋白在一個(gè)或多個(gè)Ν-聚糖上 包含一個(gè)或多個(gè)半乳糖殘基。在某些【具體實(shí)施方式】中，糖蛋白的Ν-聚糖基本上不含木糖或 巖藻糖殘基或這兩個(gè)殘基都不含。在某些【具體實(shí)施方式】中，編碼異源性糖蛋白的核酸分子 編碼激素；細(xì)胞因子、疫苗；粘附分子或抗體或其功能片段。
[0014] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物或植物細(xì)胞此外還包含編碼至少一種在植物或植 物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記的核酸分子。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物或植物細(xì)胞是或來 源于煙草屬的物種（Nicotiana ssp.)。在某些【具體實(shí)施方式】中，核酸分子經(jīng)顯微注射 法，PEG轉(zhuǎn)化法、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，電穿孔法，基因槍法、直接基因轉(zhuǎn)移法、脂質(zhì) 體融合、植物活體轉(zhuǎn)化法（in planta transformation)、磷酸興沉淀法、農(nóng)桿菌浸潤法 (agro-filtration)或病毒傳染法插入。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)能將半乳糖殘基以β-1，4-鍵加入到 Ν-連接的聚糖的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其中編碼非哺乳動(dòng)物β-1，4-半 乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸與雞β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID NO: 1)或斑馬魚的 β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID N0:13)至少具有85%的同一性。在另一具 體實(shí)施方式中，該核酸與雞β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID NO: 1)或斑馬魚的 β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID N0:13)至少具有90%，95%或98%的同一性。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)能將半乳糖殘基以β-1，4-鍵加入到 Ν-連接的聚糖的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其中非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn) 移酶的酶活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2) 或斑馬魚的β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 14)至少具有85%的同一性。 在另一【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的酶活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列 與雞β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)或斑馬魚的β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移 酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)至少具有90%，95%或98%的同一性。在某些具體實(shí)施 方式中，非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列此外還包含哺乳動(dòng)物延長序列。 在某些【具體實(shí)施方式】中，哺乳動(dòng)物延長序列是MRLREPLLSGSAA(SEQ ID Ν0:21)。在某些具 體實(shí)施方式中，非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的CTS被來自另一定位于高爾基體蛋白 的CTS取代，并且其中非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的酶活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與 雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)或斑馬魚的β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的 氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)有至少85%的同一性。在其他【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶酶活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序 列（SEQ ID Ν0:2)或斑馬魚的β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)有至少 90 %，95 %或98 %的同一性。在某些【具體實(shí)施方式】中，來自另一定位于高爾基體的蛋白的 CTS是來自大鼠 α 2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)能將半乳糖殘基以β-1，4-鍵加入到 Ν-連接的聚糖的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其中植物或植物細(xì)胞產(chǎn)生一種糖蛋 白，其包含既無 β?，2-木糖殘基也無 α?，3-巖藻糖殘基的雜交類型的Ν-連接的聚糖。在 某些【具體實(shí)施方式】中，產(chǎn)生的既無 β1，2_木糖殘基也無 al，3-巖藻糖殘基的雜交類型的 Ν-連接的聚糖的數(shù)量是表達(dá)野生型人β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物或植物細(xì)胞的產(chǎn)生的量 的兩倍。在另一【具體實(shí)施方式】中，產(chǎn)生的既無 β1，2_木糖殘基也無 al，3-巖藻糖殘基的 雜交類型的Ν-連接的聚糖的數(shù)量是表達(dá)野生型人β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物或植物細(xì)胞 的產(chǎn)生的量的五倍，十倍或五十倍。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物或植物細(xì)胞產(chǎn)生包含雙觸 角的Ν-聚糖的糖蛋白，其中該Ν-聚糖包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基。在這些具體 實(shí)施方式中，產(chǎn)生的包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角的N-聚糖的數(shù)量是表 達(dá)野生型人β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物或植物細(xì)胞的產(chǎn)生的量的兩倍，五倍，十倍或五十 倍。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生的糖蛋白。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生的植物或這種植物 的部分。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物是選自種子、胚胎、愈傷組織、葉、根、芽、花粉或小孢 子的植物部分。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生的植物細(xì)胞。在 某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式生長。在某些【具體實(shí)施方式】中，懸浮培養(yǎng) 的植物細(xì)胞選自煙草BY2、胡蘿卜或擬南芥細(xì)胞懸液。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞 是選自苔蘚植物（Bryophytaea)、小立碗蘚（Physcomitrella patens)、葫蘆蘚（Funaria hygrometrica)或角齒蘚（Ceratodon purpureus)的苔蘚的部分。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供編碼多肽的核酸，所述的多肽含有雞 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1 (SEQ ID N0:2)或斑馬魚的β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1 (SEQ ID N0:14) 及其N-末端延長的氨基酸序列，其中延長的氨基酸序列是對應(yīng)于哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶1的Ν-末端氨基酸序列的氨基酸序列，其中Ν-末端氨基酸序列在前10個(gè)Ν-末端 氨基酸中至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是 任何氨基酸。在某些【具體實(shí)施方式】中，氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQ ID N0:21)。在 某些【具體實(shí)施方式】中，氨基酸序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO: 15。在某些具體實(shí)施方 式中，編碼包含雞β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(SEQ ID N0:2)或斑馬魚β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶 1(SEQ ID Ν0:14)的多肽的核酸，其中雞β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或斑馬魚β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn) 移酶的CTS被另一定位于高爾基體的蛋白的CTS取代。在某些【具體實(shí)施方式】中，CTS來源 于哺乳動(dòng)物或植物的定位于高爾基體的蛋白。在某些【具體實(shí)施方式】中，CTS來源于哺乳動(dòng) 物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在某些【具體實(shí)施方式】中，CTS來源于大鼠 α 2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在某 些【具體實(shí)施方式】中，氨基酸序列包含SEQ ID Ν0:11或SEQ ID Ν0:18。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供編碼多肽的核酸，所述的多肽包含非哺乳動(dòng) 物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，其中非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的酶活性 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與雞β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(SEQ ID勵(lì):2)或斑馬魚0-1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶1 (SEQ ID NO: 14)的酶活性結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列同一性至少是90%，以及其N末端 延長序列，其中該延長序列的氨基酸序列對應(yīng)于哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1的N-末 端氨基酸序列，其中Ν-末端氨基酸序列在其前10個(gè)Ν-末端氨基酸上至少包含序列[Κ/ 幻4-0(/1?]，其中[1(/1?]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且乂能是任何氨基酸。在另一具體實(shí) 施方式中，該序列的同一性至少是95 %或98 %。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供包含本文所述的核酸分子的表達(dá)載體。在某 些【具體實(shí)施方式】中，核酸分子連接至對于核酸分子在真核或原核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄是足夠的調(diào)節(jié) 元件上。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本文所述的連 接至對于在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄是足夠的異源性調(diào)節(jié)元件上的核酸分子或包含本文所述的載 體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1描述各種哺乳動(dòng)物（人，小鼠，牛）和非哺乳動(dòng)物（雞，斑馬魚，蛙）起源的 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的序列比對（Clustal W)。"哺乳動(dòng)物延長序列"是哺乳動(dòng)物特異性的 氨基末端區(qū)域，在非哺乳動(dòng)物的β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的直系同源物上未發(fā)現(xiàn)該區(qū)（實(shí)線方 框）。"ΤΜ"標(biāo)記跨膜區(qū)（虛線方框）。
[0026] 圖2Α至2C描述從表達(dá)雞的基因的轉(zhuǎn)基因植物中純化的Ν-聚糖的Maldi-TOF分 析結(jié)果。從頂端至底端，正常雞的基因（雞GalT)，13氨基酸N-末端人GalT-雞GalT，和 SialT-CTS-雞 GalT。
[0027] 圖3A至3D描述從表達(dá)斑馬魚GalT基因的轉(zhuǎn)基因植物中純化的N-聚糖的 Maldi-TOF分析結(jié)果。從頂端至底端，正常斑馬魚的基因（斑馬魚GalT，2種植物），13氨基 酸N-末端人GalT-斑馬魚GalT，和SialT-CTS-斑馬魚GalT。
[0028] 圖4A至4C描述匯總了來自人，斑馬魚和雞GalT的結(jié)果的柱形圖，關(guān)于雙觸角的 "野生型"植物N-聚糖（GlcNAc2-Man3-Xyl-Fuc-GlcNAc2-Asn)，帶有一個(gè)半乳糖（并不含木 糖和巖藻糖）雜交類型的N-聚糖，和帶有兩個(gè)半乳糖的雙觸角N-聚糖（從頂端至底端）。
[0029] 圖 5 描述 Dgal (SEQ Dgal，SEQ ID N0:14)與推定的斑馬魚 β 1，4-GalTl (發(fā)表于 文獻(xiàn)：Machingo et al.，Dev Biol297, 471-82, 2006 ;NM_001017730)之間的氨基酸序列比 較。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 高爾基體是復(fù)雜的聚糖構(gòu)型發(fā)生的場所的細(xì)胞器和糖基化機(jī)械裝置的位點(diǎn)。糖基 化的關(guān)鍵介質(zhì)是糖基轉(zhuǎn)移酶。最佳的研究高爾基體相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶之一是β?，4-半乳 糖轉(zhuǎn)移酶1 (GalT)。β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1由細(xì)胞漿中的尾部，跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD)和催化 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。已經(jīng)克隆多種哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶基因。轉(zhuǎn)化植物系統(tǒng)的便宜性使得研究者 能夠?qū)碜圆溉閯?dòng)物的糖基轉(zhuǎn)移酶"補(bǔ)充"到植物的高爾基體中以將其產(chǎn)生的聚糖或糖蛋 白進(jìn)行"人源化"或"哺乳動(dòng)物源化"。
[0031] 迄今為止，尚未報(bào)道非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（GalT)用于在植物中生產(chǎn) 哺乳動(dòng)物源化或人源化的糖蛋白的用途。
[0032] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些以前未鑒定的非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，如來自雞和斑馬 魚的β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，能用于在植物中進(jìn)行Ν-連接的糖蛋白的末端半乳糖基化作用， 并且這些非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶相對于以前的生產(chǎn)人源化蛋白的方法顯示出出 乎意料的改進(jìn)。例如，雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生大多數(shù)不含β 1，2-木糖和α 1，3-巖藻 糖殘基的雜交型Ν-連接的聚糖。
[0033] 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，來自雞和斑馬魚的非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶比哺乳動(dòng)物 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶短，并不含在哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶中含有的氨基末端區(qū)。這 些非哺乳動(dòng)物β 1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶能在其氨基末端延長一段與哺乳動(dòng)物β 1,4-半乳糖轉(zhuǎn) 移酶的氨基末端相對應(yīng)的氨基酸序列，"哺乳動(dòng)物延長序列"。這些修飾版本的非哺乳動(dòng)物 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生某些Ν-連接聚糖達(dá)到比人β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶高的程度。例 如，其氨基酸末端被大鼠的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS區(qū)替換的斑馬魚GalT主要產(chǎn)生雙觸角，雙 半乳糖基化的N-聚糖。
[0034] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供用于在植物中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物化的糖蛋白的未 修飾的或修飾的來自雞或魚的非哺乳動(dòng)物GalT。某些【具體實(shí)施方式】還提供了在表達(dá)這種非 哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物或植物細(xì)胞中產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物化的糖蛋白。
[0035] "定義"
[0036] 本文所使用的術(shù)語"核酸"是指脫氧核糖核酸或核糖核酸多聚體，即單鏈或雙鏈形 式的多聚核苷酸，和除非另外限制，包含已知的類似物，在其與單鏈核酸以與天然存在的核 酸（例如肽核酸）相似的方式雜交方面具有天然核苷酸的主要性質(zhì)。多聚核苷酸能是天然 的或異源的結(jié)構(gòu)性或調(diào)節(jié)性基因的全長或子序列。除非另外限制，該術(shù)語是指特定序列以 及與其互補(bǔ)的序列。因此，為了使其穩(wěn)定或其它原因修飾其骨架的DNA或RNA是該術(shù)語所 指的"多聚核苷酸"。此外，包含罕見的堿基（如肌苷）或修飾堿基（如三苯甲基化的堿基） (僅是兩個(gè)例子）的DNA或RNA是該術(shù)語所指的"多聚核苷酸"。應(yīng)理解，已經(jīng)對DNA和RNA 進(jìn)行很多種修飾，這些修飾服務(wù)于對本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用的目的。正如在本文 所用的術(shù)語"多聚核苷酸"包含這種化學(xué)的，酶的或代謝修飾的多聚核苷酸的形式，以及具 有病毒或細(xì)胞（包括其它物種中的簡單和復(fù)雜細(xì)胞的）的特征的DNA和RNA的化學(xué)形式。
[0037] 本文所用的"為……編碼的核酸分子"或"編碼……的核酸分子"并不限于個(gè)體或 各個(gè)分子，例如作為各個(gè)實(shí)體的核酸分子，其中每個(gè)實(shí)體包含一種核酸分子，還包括一種或 多種核酸分子可連接至一種連續(xù)的序列中，可被任何插入序列分開。在一種連續(xù)序列中的 核酸分子的順序和方向不限于任何特定構(gòu)型，例如該核酸分子可連接至同一啟動(dòng)子或不同 啟動(dòng)子上，可是單向或雙向的，并可是直接相連或被插入序列分隔。本領(lǐng)域已知各種這種構(gòu) 型。此外，核酸分子可合并在一條連續(xù)的序列中，或可以各個(gè)實(shí)體提供。例如，在某些具體 實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含核酸分子的植物或植物細(xì)胞，所述核酸分子包含非哺乳動(dòng)物 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，異源性糖蛋白和一種或多種選擇標(biāo)記。這些核酸分子可以本文所述 的一種，兩種，三種，或多種載體的形式提供。
[0038] 術(shù)語"多肽"，"肽"和"蛋白"本文可互換使用，是指氨基酸殘基的多聚體。這些術(shù) 語應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸 多聚體人工化學(xué)類似物的氨基酸多聚體。這些天然存在的氨基酸多聚體的類似物的主要 特性是，當(dāng)摻入蛋白中時(shí)，該蛋白是特定響應(yīng)于同一蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，但是其完全由天 然存在的氨基酸構(gòu)成。術(shù)語"多肽"，"肽"和"蛋白"還包括修飾形式的"多肽"，"肽"和"蛋 白"，其包括但不限于糖基化、連接脂質(zhì)、硫酸化、谷氨酸殘基的Υ -羧化、羥基化和ADP核糖 基化。
[0039] "編碼"或"為……編碼"的序列是部分編碼蛋白的氨基酸序列的基因或編碼功 能性RNA (如tRNA或rRNA)的基因和特定指核酸序列包含翻譯成特定蛋白的信息這一事 實(shí)。編碼蛋白的核酸可在核酸的翻譯區(qū)內(nèi)包含非翻譯序列（例如內(nèi)含子），或可不含這種 插入性非翻譯序列（例如在cDNA內(nèi)）。蛋白編碼的信息通過使用密碼子限定。通常，使用 "通用"遺傳密碼子的核酸編碼氨基酸序列。然而，通用密碼子的變體，如在某些植物、動(dòng)物 和真菌線粒體，細(xì)菌山羊支原體（Mycoplasma capricolum)或纖毛蟲大核（the ciliate Macronucleus)中出現(xiàn)的變體可用于當(dāng)核酸在其中表達(dá)時(shí)。當(dāng)用合成方法制備或改變核酸 時(shí)，采用在欲將核酸在其中表達(dá)的目的宿主中存在的已知密碼子能是有優(yōu)勢的。例如，雖然 本發(fā)明的核酸序列既可在單子葉植物物種中表達(dá)也可在雙子葉植物物種中表達(dá)，但是序列 能被修飾以產(chǎn)生特定密碼子參數(shù)，并且單子葉植物或雙子葉植物中的GC含量的參數(shù)如這 些參數(shù)已經(jīng)顯示有區(qū)別。
[0040] "表達(dá)"是指基因轉(zhuǎn)錄成結(jié)構(gòu)性RNA (rRNA，tRNA)或隨后翻譯成蛋白的信使 RNA(mRNA)。
[0041] 涉及蛋白或核酸的術(shù)語"非哺乳動(dòng)物的"是指來源于非哺乳動(dòng)物，包括例如非哺乳 脊椎動(dòng)物，如鳥類（例如雞或鴨）或魚，和非哺乳無脊椎動(dòng)物的這種化合物。非哺乳動(dòng)物 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（和編碼序列）的非常合適的來源是雞和魚。
[0042] 涉及蛋白或核酸的術(shù)語"哺乳動(dòng)物的"是指來源于哺乳動(dòng)物，例如人，非人的靈長 類動(dòng)物，小鼠，豬，牛，山羊，貓，家兔，大鼠，豚鼠，倉鼠，馬，猴，綿羊，小袋鼠，鴨嘴獸或其他 非人類的哺乳動(dòng)物的這種化合物。
[0043] 術(shù)語"β-1，4_半乳糖轉(zhuǎn)移酶"是指糖基轉(zhuǎn)移酶EC2. 4. 1.38W-l，4-GalTl)， 其對于自2型鏈（Gal β 1 - 4GlcNAc)的骨架結(jié)構(gòu)的生物合成是必需的，2型鏈 (GalP 1 - 4GlcNAc)的骨架結(jié)構(gòu)似乎廣泛出現(xiàn)在N-連接聚糖上，即該酶對于固有活性 (i. a)的N-連接聚糖具有半乳糖基化活性。該2型鏈在合成分別在免疫系統(tǒng)和早期胚胎發(fā) 生中發(fā)揮作用的唾液酸化的路易斯抗原（sialyl lewis X)和SSEA-1中尤其重要。本發(fā)明 提供哺乳動(dòng)物β_1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（例如來自人，小鼠，大鼠）以及來自非哺乳動(dòng)物物種 如雞和魚的β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的直系同源物。
[0044] 本文所使用的術(shù)語"序列同一性"表示在兩條或多條多聚核苷酸之間或在兩條或 多條多肽之間存在同一性。當(dāng)與另一條多聚核苷酸或多肽進(jìn)行最大相關(guān)性的比對時(shí)，如果 一條多聚核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列是相同的，那么多聚核苷酸或多肽具有"同 一性"序列。兩條或多條多聚核苷酸或多肽之間的序列比較通常通過在比較窗口比較兩 條序列的部分進(jìn)行，以鑒定和比較序列的局部區(qū)域的相似性。比較窗口通常是自大約20 至200的連續(xù)核苷酸或是自大約7至70的連續(xù)氨基酸。對于多聚核苷酸或多肽的"序列 同一性百分?jǐn)?shù)"，如50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99或100百分?jǐn)?shù)的序列同一性可通過將兩條 最佳比對系列經(jīng)比較窗口進(jìn)行比較而確定，其中在比較窗口中的多聚核苷酸或多肽序列 部分可包括當(dāng)與參考序列比較時(shí)的添加或缺失（即縫隙），而用于兩條序列的最佳比對的 參考序列不包括添加或缺失。通過下列計(jì)算該百分?jǐn)?shù)：(a)確定相同的核酸堿基或氨基酸 殘基在兩條序列中都出現(xiàn)的位置的數(shù)目已產(chǎn)生出匹配位置數(shù)目；(b)將匹配位置數(shù)被比較 窗口中的位置的總數(shù)除；且（c)結(jié)果乘以100以產(chǎn)生同源性序列百分?jǐn)?shù)。進(jìn)行比較的最 佳比對可通過已知算法的計(jì)算機(jī)化的工具或通過檢查進(jìn)行。在比對進(jìn)行比較的序列和計(jì) 算序列同源性或同一性中適合使用的算法和軟件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。這種工 具的顯著的例子是基于皮爾森和利波曼查找的FASTA和BLAST程序，這些程序詳見文獻(xiàn) (Altschul et al(1997), Nucleic Acid Res. 25:3389-3402 ；Altschul et al(1990),J. Mol. Biol. 215:403-10 ；Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444-8 ； Lipman and Pearson(1985), Science227:1435-41))。其它合適的程序包括 PILEUP, LINEUP, GAP, BESTFIT 和 FASTA 程序（威斯康辛軟件包 GCG? 中）（the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI, USA)現(xiàn)在由 Accelrys Inc.提供。在互 聯(lián)網(wǎng)上通過 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST 或鏡像站點(diǎn)和 http: //www. accelrys. com/p:roducts/gcg Wisconsin package.可得到上沭程序的細(xì)節(jié)。因此，這種同源性或同一 性能使用公共或商業(yè)上可得到的軟件包或通過互聯(lián)網(wǎng)上的計(jì)算機(jī)服務(wù)器來確定。術(shù)語"同 一性"是指，雖然事實(shí)是該系列可在需要將縫隙導(dǎo)入的位置含有缺失或添加以獲得最高的 氨基酸或堿基百分?jǐn)?shù)，然而當(dāng)序列進(jìn)行最佳比對時(shí)，在參考序列的同一相對位置上發(fā)現(xiàn)的 所主張的氨基酸序列或核酸系列的起始百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選地，通過使用10或更少的縫隙進(jìn)行比 對，即導(dǎo)入兩個(gè)序列中的縫隙的總數(shù)當(dāng)加在一起時(shí)是10或更少。這種縫隙的長度不是特別 重要，但是通常不超過10個(gè)氨基酸（優(yōu)選不超過5個(gè)氨基酸）或30個(gè)堿基（優(yōu)選不超過 15個(gè)堿基）。
[0045] 術(shù)語"遺傳密碼子的簡并性"是指大量功能相同的核酸編碼任何特定蛋白這一事 實(shí)。例如，密碼子GCA，GCC，GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個(gè)以密碼子說明 丙氨酸的位置，該密碼子能變成描述的相應(yīng)的密碼子而未改變所編碼的多肽。這種核酸變 異是"沉默變異"。通過引用遺傳密碼子，在此處的編碼多肽的每一核酸序列也描述該核酸 的每一可能的沉默變異。
[0046] 在"互補(bǔ)鏈"中的術(shù)語"互補(bǔ)的"是指核酸鏈有一段核酸序列，該與核酸序列與 另一核苷酸序列根據(jù)Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則通過形成氫鍵而形成雙鏈。例如， 5' -AAGGCT-3' 的互補(bǔ)堿基序列是 3' -TTCCGA-5'。
[0047] 術(shù)語"半乳糖基化N-連接的聚糖"是指糖蛋白中的N-連接寡糖單位的通用核心， 所述的糖蛋白由殼二糖核心和至少3個(gè)甘露糖和至少1個(gè)N -乙酰葡糖胺殘基組成，并進(jìn) 一步在其非還原末端上延伸出至少一個(gè)N -乙酰葡糖胺上的半乳糖殘基。
[0048] 術(shù)語"抗體"包括對抗體（例如Fab，F(xiàn)(ab)2)的抗原結(jié)合形式的引用。術(shù)語"抗 體"經(jīng)常是指實(shí)質(zhì)上由免疫球蛋白基因或特異性結(jié)合并識別被分析物（抗原）免疫球蛋 白或其片段編碼的多肽。然而，當(dāng)各種抗體片段能被一種完整抗體的消化的術(shù)語來限定 時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這種片段可化學(xué)性地或通過使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行重新合成。 因此，術(shù)語抗體，如在本文所用，也包括抗體片段，如單鏈Fv，嵌合抗體（即包含不同物種 的恒定區(qū)和可變區(qū)），人源化抗體（即包含非人來源的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR))和異源偶聯(lián) (heteroconjugate)抗體（例如雙特異性抗體）。
[0049] 術(shù)語"抗體重鏈或輕鏈"使用其本領(lǐng)域公認(rèn)的含義。
[0050] 術(shù)語"功能片段"是指蛋白的截短了的版本，其是該蛋白的功能性變體或功能性衍 生物。蛋白的"功能性變體"或"功能性衍生物"是蛋白的氨基酸序列，其來源于通過將原 始蛋白的氨基酸序列進(jìn)行取代，缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而得到的蛋白的氨 基酸序列，以這種方式，盡管氨基酸序列發(fā)生了變化，但是功能性變體保留了原始蛋白的至 少一種生物活性的至少部分活性，該活性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可檢測的。功能性變 體通常與其能衍生它的蛋白之間的同源性是至少50%同源（優(yōu)選氨基酸序列至少50%相 同），至少70%同源或至少90%同源。功能性變體也可是蛋白的任何功能部分。在某些具體 實(shí)施方式中，該功能是半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性。在某些【具體實(shí)施方式】中，區(qū)別于SEQ ID N0:2 (雞 半乳糖轉(zhuǎn)移酶的蛋白序列）或SEQ ID NO: 14 (斑馬魚半乳糖轉(zhuǎn)移酶的蛋白序列）的氨基酸 序列主要或僅通過保守性取代產(chǎn)生。在某些【具體實(shí)施方式】中，該蛋白包含與SEQ ID N0:2 或SEQ ID NO: 14具有65%或更高，75%或更高，85%或更高，90%或更高或95%或更高的 序列同一性的氨基酸序列，且在某些【具體實(shí)施方式】中，與這些序列具有100%同一性。本文 所用的"功能性的"還包括植物中的功能性。
[0051] 所使用的術(shù)語"保守性取代"當(dāng)用于氨基酸時(shí)涉及特定氨基酸被具有相似的 生物化學(xué)特征的氨基酸取代。因此，在某些【具體實(shí)施方式】中，序列SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 14中的氨基酸具有疏水基團(tuán)時(shí)，保守性取代是其被另一也具有疏水基團(tuán)的氨基 酸取代；其它這種生物化學(xué)相似性的氨基酸是那些其特征性基團(tuán)是疏水、陽離子或陰 離子的氨基酸或含有硫醇或硫醚的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知這種取代（即見于 美國專利No. 5, 380, 712)。保守性氨基酸取代可在，例如在脂肪族非極性氨基酸組內(nèi) (Gly, Ala, Pro, lie, Leu, Val)，極性不帶電氨基酸組內(nèi)（Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gin)，極性 不帶電氨基酸組內(nèi)（Asp，Glu，Lys，Arg)或芳香族氨基酸組內(nèi)（His，Phe，Tyr，Trp)進(jìn)行。
[0052] 術(shù)語"選擇標(biāo)記"是指編碼用于分離轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因組織的代謝特征的多聚核 苷酸序列，并可指提供抗生素抗性。選擇標(biāo)記例如是編碼卡那霉素抗性標(biāo)記的aphLl，nptII 基因，編碼潮霉素抗性的基因。其它抗性標(biāo)記為本領(lǐng)域所熟知。其它選擇標(biāo)記是，例如報(bào)告 基因，如氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶，β_半乳糖苷酶，熒光素酶和綠色熒光蛋白。報(bào)告基因產(chǎn)物的 鑒定方法包括但不限于酶學(xué)檢測或熒光檢測。報(bào)告基因和測定器產(chǎn)物的檢測被本領(lǐng)域所熟 知并見于（例如Current Protocols in Molecular Biology, eds.Ausubel et al.，Greene Publishing and Wiley_Interscience:New York(1987)及其定期更新資料）所述。
[0053] 如本文所用，術(shù)語"載體"包括引用在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中使用的核酸和能被插入多聚 核苷酸的核酸。載體經(jīng)常復(fù)制。表達(dá)載體可使插入其中的核酸轉(zhuǎn)錄。
[0054] 如本文所用，術(shù)語"可通過操作連接"是指功能性連接或排列，其中所描述成分之 間的關(guān)系使得它們以其預(yù)期的方式發(fā)揮功能。"可通過操作連接"至另一對照序列中和/或 連接至編碼序列中的對照序列以該編碼序列在適合于對照序列的條件下達(dá)到轉(zhuǎn)錄或表達(dá) 的這樣的方式被連接起來。通常，可通過操作連接意味著被連接的核酸序列是連續(xù)的，當(dāng)有 必要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)之間時(shí)是連續(xù)的并且位于同一讀碼框內(nèi)。
[0055] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指含有載體并支持載體的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞 可是原核細(xì)胞如E. coli，或真核細(xì)胞如植物，酵母，昆蟲，兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0056] 如本文所使用"異源性"當(dāng)引用核酸時(shí)是指來源于異源物種的核酸，或者如果是來 自同一物種，是指其原始形式在成分和/或基因座通過插入修飾的核酸。例如，可通過操作 連接至異源性結(jié)構(gòu)基因上啟動(dòng)子是來源于與結(jié)構(gòu)基因所來源的物種不同的物種，或者，如 果來源于同一物種，其中一個(gè)或兩個(gè)經(jīng)自它們的原始來源形式修飾。異源蛋白可來源于外 來物種或如果來源于同一物種，通過插入將其自欺原始形式進(jìn)行修飾。
[0057] 本文限定的術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"或"控制序列"包括任何對于編碼序列的表達(dá)是必要 的或有利的成分。調(diào)節(jié)序列可是編碼序列本身或外來的。這種調(diào)節(jié)序列包括但不限于引導(dǎo) 序列（leader)，多腺苷酸化序列，前肽序列，啟動(dòng)子，信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。這種序列為本 領(lǐng)域所熟知。最少，調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子或某些啟動(dòng)子元件和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。調(diào)節(jié) 序列可與為了將特定限制性位點(diǎn)導(dǎo)入的連接子一起提供，以簡化調(diào)節(jié)序列與編碼多肽的核 酸序列的編碼區(qū)的連接。
[0058] 本文所使用的術(shù)語"啟動(dòng)子"是其本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，是指含有DNA序列的基因的 一部分，該部分供RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始之用。通常但不總是發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列位于基 因的5'非編碼區(qū)。"植物啟動(dòng)子"是能在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子而不管其是否來源 于植物細(xì)胞。示例性的植物啟動(dòng)子包括但不限于那些自植物，植物病毒和包含在植物細(xì)胞 中表達(dá)的基因的細(xì)菌（土壤桿菌屬或根瘤菌屬）中獲得的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子的例子是 花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子及其衍生物，鐵氧化還原蛋白啟動(dòng)子，膽脂堿合酶（nos)，甘 露堿合成酶（mas)和章魚肉堿合酶（ocs)啟動(dòng)子（ΕΡ Ο 122 791，ΕΡ Ο 126 546，ΕΡ Ο 145 338)，泛素啟動(dòng)子（ΕΡ 0 342 926)，木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子和二磷酸核酮糖氧合酶/羧化 酶（Rubisco)的短的亞基額菊花啟動(dòng)子。
[0059] 術(shù)語"轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞"包括對基因組內(nèi)包含異源多聚核苷酸的植物或植 物細(xì)胞的引用。通常，異源多聚核苷酸穩(wěn)定整合進(jìn)基因組中，以至于多聚核苷酸能傳遞至下 一代。異源多聚核苷酸可單獨(dú)或作為部分重組表達(dá)盒整合進(jìn)入基因組中。而且，有可能是 異源多聚核苷酸不整合或不穩(wěn)定整合進(jìn)入被轉(zhuǎn)化植物的基因組中。在這種情況下，該基因 能瞬時(shí)表達(dá)，意味著表達(dá)一段特定時(shí)間，之后被導(dǎo)入的多聚核苷酸從細(xì)胞中丟失。為了本發(fā) 明的目的，轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞還包括瞬時(shí)表達(dá)異源多肽的植物或植物細(xì)胞。本文所用 的"轉(zhuǎn)基因"包括任何基因型因存在異源核酸而改變的細(xì)胞，細(xì)胞系，愈傷組織，組織，植物 部分或植物，包括那些起始就已改變的轉(zhuǎn)基因以及起始轉(zhuǎn)基因通過兩性雜交或無性繁殖創(chuàng) 造出來的轉(zhuǎn)基因。本文所使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"不包含（染色體基因組或染色體外基因組） 通過常規(guī)植物育種方法或通過天然存在的事件如隨機(jī)異體受精，非重組病毒感染，非重組 細(xì)菌轉(zhuǎn)化，非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)性突變而使基因組發(fā)生的改變。
[0060] 在將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的上下文中的術(shù)語"插入"意味著"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)" 并包括引用使核酸摻入真核或原核細(xì)胞中，核酸在這些真核或原核細(xì)胞中可摻入細(xì)胞的基 因組（例如染色體，質(zhì)粒，質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制或瞬時(shí)表達(dá)（例如轉(zhuǎn)染的 mRNA)。
[0061] 如本文所使用，術(shù)語"植物"包括（引用）整個(gè)植物，植物器官（例如葉，莖，根等）， 種子和植物細(xì)胞以及上述的子代。植物細(xì)胞，如本文所使用，包括但不限于種子，胚胎，分生 組織區(qū)，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉和小孢子。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物 細(xì)胞以懸浮培養(yǎng)方式生長。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞能夠再生出整個(gè)植物。能在 本發(fā)明所述的方法中使用的植物的類型通常很廣泛，以至于能接受轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物都 能使用，包括單子葉植物和雙子葉植物。本文中所使用，當(dāng)指植物時(shí)，除非另有說明，是指從 藻類到樹的范圍的整個(gè)植物譜。優(yōu)選的植物是煙草屬的物種（Nicotiana ssp.)，優(yōu)選普通 煙草（N.tabacum)或本塞姆氏煙草（N.benthamiana)。
[0062] 術(shù)語"特異性識別"包括引用抗體和具有被抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)識別的表位的蛋 白之間的結(jié)合反應(yīng)。這種結(jié)合反應(yīng)由具有被識別的表位的蛋白決定，所述的表位是蛋白或 其它生物分子的異質(zhì)性群體之中存在的表位之一。因此，在特定的免疫檢測條件下，特定的 抗體與具有被識別的表位的被檢測物的結(jié)合，實(shí)質(zhì)上比與缺乏樣本中存在的表位的所有被 檢測物的結(jié)合實(shí)質(zhì)上達(dá)到更大的程度（例如至少是背景的2倍）。在這種條件下與抗體的特 異性結(jié)合可需要選擇對特定蛋白是特異性的抗體，例如，能選擇抗本文所述的多肽（例如 SEQ ID N0S. 2, 4, 7, 9, 11，14, 16, 18和20)的抗體以獲得特異性識別這些多肽的抗體。用作 免疫原的蛋白或多肽能是天然形式或?qū)⑵渥冃砸援a(chǎn)生線性表位?？墒褂酶鞣N免疫檢測方法 來選擇特異性識別特定蛋白（或其它被檢測物）的抗體。例如，常規(guī)使用固相ELISA免疫檢 測來選擇與蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。文獻(xiàn)描述了能用于確定選擇性反應(yīng)性 的免疫檢測方法和條件（見于 Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988))〇
[0063] 核酸分子和細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
[0064] 盡管編碼本發(fā)明所述的多肽的核酸分子能在任何細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（如植物，酵母， 細(xì)菌，非哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)）中表達(dá)，該核酸分子優(yōu)選在可懸浮生長的植 物或植物細(xì)胞中表達(dá)。
[0065] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供包含能生物合成N-聚糖的功能蛋白的植物 或植物細(xì)胞，其中該蛋白是非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，例如是雞或魚起源。在其他

【具體實(shí)施方式】中，所述的非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的Ν-末端延伸出Ν-末端延伸 序列，該序列使其易于定位于高爾基體，以能夠使該酶具有預(yù)期的功能。Ν-末端延伸序列 通常構(gòu)成包含高爾基體-定位信號序列和跨膜結(jié)構(gòu)域的胞漿中的尾部。這種Ν-末端序列 (命名為"CTS"）能來源于哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，哺乳動(dòng)物唾液酸轉(zhuǎn)移酶或任何 其它定位于高爾基體的蛋白，并與非哺乳動(dòng)物GalT (例如雞或魚起源）的胞漿結(jié)構(gòu)域融合， 并在植物細(xì)胞或植物中表達(dá)。
[0066] 糖基轉(zhuǎn)移酶的N-末端胞漿區(qū)，跨膜區(qū)（本文"CTS區(qū)"）決定該酶在ER或高爾基體 膜上定位。為了產(chǎn)生天然或所需的糖基化，糖基轉(zhuǎn)移酶能在植物細(xì)胞中表達(dá)因其出現(xiàn)在哺 乳細(xì)胞中，但是也能作為兩種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶或兩種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶的部分之間的融 合蛋白表達(dá)。在這種情況下，定位由一種酶決定，催化活性由第二種決定。作為例子的是， 大鼠唾液酸轉(zhuǎn)移酶的胞漿區(qū)，跨膜區(qū)和莖區(qū)與哺乳動(dòng)物半乳糖轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域之間形 成的融合蛋白，如例如在SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:17之間產(chǎn)生的融合蛋白，產(chǎn)生具有半 乳糖轉(zhuǎn)移酶活性和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的定位功能的酶。
[0067] 哺乳動(dòng)物GalT酶的有用的N-末端延伸序列經(jīng)鑒定，其長約10-20氨基酸，并在其 胞漿尾序列的前10個(gè)氨基末端的氨基酸上含有[K/R]-X-[K/R]基序（其中K/R意味著賴 氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸）。
[0068] 在某些【具體實(shí)施方式】中，N-末端氨基酸序列延伸序列包含人β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移 酶多肽1序列前13個(gè)氨基酸殘基，S卩MRLREPLLSGSAA(SEQ ID Ν0:21)(見圖1)。在其他具 體實(shí)施方式中，非哺乳動(dòng)物GalT的CTS被置換為來自另一種定位于高爾基體的蛋白的CTS ; 置換能例如來源于大鼠 α2,6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS(Genbank accession M18769)。
[0069] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶，該酶與雞β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶核酸序列（SEQ ID NO: 1)至少具有85%的同一性。 在其他【具體實(shí)施方式】中，功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移 酶核酸序列（SEQ ID NO: 1)的同一性是90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98 或 99!%。
[0070] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供該酶的與雞β 1，4_半乳糖轉(zhuǎn)移酶核酸序列 (SEQ ID NO: 1)的同一性是 85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% 或99 %的核酸和載體。
[0071] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶，該酶與雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)至少具有65%的同一 性。在其他【具體實(shí)施方式】中，功能性非哺乳動(dòng)物β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與雞β?，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95%，96%，97%，98%或 99%。
[0072] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶，該酶與雞β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)具有至少65 %的 同一性，并包含帶有哺乳動(dòng)物延伸序列的N-末端。哺乳動(dòng)物延伸序列可以包含，例如， 人β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽1序列的前13個(gè)氨基酸殘基，即MRLREPLLSGSAA(SEQ ID N0:21)，或非哺乳動(dòng)物GalT的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS ;置換物 能例如來源于大鼠 α2,6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS(Genbank accession M18769)。在其它

【具體實(shí)施方式】中，包含哺乳動(dòng)物延伸序列的功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與雞 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)的同一性是75%，85%，90%，91%，92 %，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%。
[0073] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供核酸及其載體，所述核酸及其載體包含上述 的哺乳動(dòng)物延伸序列或改變的CTS區(qū)，它們僅在與雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶核酸序列相關(guān)的 方面與雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶核酸序列（SEQ ID NO: 1)的同一性是85%，90%，91%，92% ，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%;也就是說，序列同一性的確定不通過哺乳動(dòng)物 延伸序列或改變的CTS區(qū)。
[0074] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶，該酶與斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID Ν0:13)的同一性是至少 85%。在其它【具體實(shí)施方式】中，功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與斑馬魚β 1，4-半 乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID Ν0:13)的同一性是90%，91%，92%，93%，94%，95%，96 %，97%，98%或 99%。
[0075] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供該酶的與斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核 酸序列（SEQ ID Ν0:13)的同一性是85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97%，9 8 %或99 %的核酸和載體。
[0076] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶，該酶與斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)的同一性是 至少65%。在其它【具體實(shí)施方式】中，功能性非哺乳動(dòng)物β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與斑馬魚 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)的同一性是75%，85%，90%，91%，92 %，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或 99%。
[0077] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶， 該酶與斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)的同一性是至少65%并 包含帶有哺乳動(dòng)物延伸序列的修飾N-末端。在其它【具體實(shí)施方式】中，包含哺乳動(dòng)物延伸序 列的功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列 (SEQ ID Ν0:14)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98 或 99!%。
[0078] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶， 該酶與斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)的同一性是至少65%， 其中斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。在其 它【具體實(shí)施方式】中，包含哺乳動(dòng)物延伸序列的功能性非哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶與 斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列（SEQ ID Ν0:14)的同一性是75%，85%，90%， 91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98%或 99%。
[0079] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供核酸及其載體，所述核酸及其載體包含上述 的哺乳動(dòng)物延伸序列或改變的CTS區(qū)，它們僅在與斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列 相關(guān)的方面與斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（SEQ ID NO: 13)的同一性是85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%;也就是說，序列同一性的確定 不通過哺乳動(dòng)物延伸序列或改變的CTS區(qū)。
[0080] 在某些【具體實(shí)施方式】中，非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶是雞或魚的 β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶，其Ν-末端延伸序列來自于人β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因或CTS來 源于大鼠唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在某些【具體實(shí)施方式】中，雞β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列 是SEQIDN0 :2，魚的β-l，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶來源于斑馬魚（DaniOreriO)，其氨基酸序列 是SEQ ID Ν0:14。在某些【具體實(shí)施方式】中，該酶分別由SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:13核酸 序列編碼。
[0081] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供表達(dá)例如來自雞或魚的非哺乳動(dòng)物 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞或植物。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)功 能性野生型雞β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（SEQ ID Ν0:2)。在某些【具體實(shí)施方式】中，上面提到的植 物細(xì)胞或植物產(chǎn)生至少雜合類型N-連接的聚糖（即至少包含三甘露糖基化的殼二糖核心， 一個(gè)另外的甘露糖和在N-連接的聚糖的α 1，3-臂上的非還原末端的半乳糖基化GlcNAc 殘基），不含β?，2-木糖和α?，3-巖藻糖殘基。在某些【具體實(shí)施方式】中，不含β?，2-木糖 和α 1，3-巖藻糖殘基的雜合類型Ν-連接的聚糖的總量較表達(dá)野生型人的β 1，4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的量增加2倍。在某些【具體實(shí)施方式】中，所述的量增加3, 4， 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500, 1000 或 10, 000 倍。
[0082] 在其它【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)包含Ν-末端的13個(gè)氨基酸的雞 β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（SEQ ID Ν0:9)。在某些【具體實(shí)施方式】中，上面提到的植物細(xì)胞或植 物至少產(chǎn)生不含β?，2-木糖和α?，3-巖藻糖殘基的雜合類型Ν-連接的聚糖。在某些具 體實(shí)施方式中，不含β 1，2-木糖和α 1，3-巖藻糖殘基的雜合類型Ν-連接的聚糖的總量較 表達(dá)野生型人β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的量增加2倍。在其它具體實(shí) 施方式中，該量增加 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500, 1000 或 10, 000 倍。
[0083] 在其它【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)在Ν-末端包含唾液酸轉(zhuǎn)移酶CTS延 伸序列的雞β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（SEQ ID Ν0:11)。在某些【具體實(shí)施方式】中，上面提到的植 物細(xì)胞或植物至少產(chǎn)生不含β 1，2-木糖和α 1，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖， 以及包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角Ν-連接的聚糖（即除三甘露糖基化殼 二糖核心外還在非還原末端帶有至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的N-連接的聚糖）。在 某些【具體實(shí)施方式】中，不含β 1，2-木糖和α 1，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖和 /或包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角Ν-連接的聚糖的總量較表達(dá)野生型人 β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的量的增加2倍。在其它【具體實(shí)施方式】中，該 量增加 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500, 1000 或 10, 000 倍。
[0084] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)野生型斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移 酶（SEQ ID Ν0:14)。在某些【具體實(shí)施方式】中，上面提到的植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生至少雙觸角 N-連接的聚糖，以及包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖。在某 些【具體實(shí)施方式】中，雙觸角N-連接的聚糖或包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸 角N-連接的聚糖的總量較表達(dá)野生型人β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的量 的增加2倍。在其它【具體實(shí)施方式】中，該量增加3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 50 0, 1000 或 10, 000 倍。
[0085] 在其它【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)N-末端包含13個(gè)氨基酸的斑馬魚 β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（SEQ ID N0:16)。在某些【具體實(shí)施方式】中，上面提到的植物細(xì)胞或 植物產(chǎn)生至少雙觸角N-連接的聚糖，以及包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角 N-連接的聚糖。在某些【具體實(shí)施方式】中，雙觸角N-連接的聚糖和/或包含至少一個(gè)半乳糖 基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖的總量較表達(dá)野生型人β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的 植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的量的增加2倍。在其它【具體實(shí)施方式】中，該量增加3, 4, 5, 6, 7, 8, 9， 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500, 1000 或 10, 000 倍。
[0086] 在其它【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物表達(dá)Ν-末端包含唾液酸轉(zhuǎn)移酶CTS延伸 序列的斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（SEQ ID Ν0:16)。在某些【具體實(shí)施方式】中，上面提到的 植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生至少雙觸角N-連接的聚糖，以及包含至少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘 基的雙觸角N-連接的聚糖。在某些【具體實(shí)施方式】中，雙觸角N-連接的聚糖和/或包含至 少一個(gè)半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖的總量較表達(dá)野生型人β 1，4-半 乳糖轉(zhuǎn)移酶的植物細(xì)胞或植物產(chǎn)生的量的增加2倍。在其它【具體實(shí)施方式】中，該量增加3， 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500, 1000 或 10, 000 倍。
[0087] 在某些【具體實(shí)施方式】中，編碼非哺乳動(dòng)物β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸，該核酸 在其Ν-末端被延伸，延伸的序列為來源于哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1的Ν-末端的序 列或哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或唾液酸轉(zhuǎn)移酶（本文所描述的）的Ν-末端CTS序 列，可替代性地被延伸為任何其它CTS序列，所述其它CTS序列來源于植物，動(dòng)物或真菌的 定位于高爾基體的蛋白，以使非哺乳動(dòng)物GalT的催化結(jié)構(gòu)域跨高爾基體定位表達(dá)到將其 在C末端融合的位置。本發(fā)明提供這種核酸。
[0088] 在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物除了表達(dá)非哺乳動(dòng)物β-1,4-半乳糖 轉(zhuǎn)移酶（本文所描述的）外，還表達(dá)第二種蛋白，優(yōu)選哺乳動(dòng)物蛋白以產(chǎn)生半乳糖基化的 Ν-連接的聚糖，從而產(chǎn)生異質(zhì)性糖蛋白，該糖蛋白的Ν-聚糖的β 1，4-半乳糖基化，雙觸角 或可以雜合形式替代令人感興趣。本發(fā)明還提供在表達(dá)非哺乳動(dòng)物β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶 的植物細(xì)胞或植物中產(chǎn)生的這種糖蛋白。
[0089] 在某些【具體實(shí)施方式】中，所述第二蛋白自編碼抗體的重鏈和/或輕鏈或其功能片 段的核酸表達(dá)。
[0090] 技術(shù)人員熟知重組核酸在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，如例如能產(chǎn)生整個(gè)植物的植物 細(xì)胞。表達(dá)載體可用于表達(dá)在細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)重組核酸。在某些【具體實(shí)施方式】中，這 種載體包含編碼非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或其酶學(xué)活性衍生物或部分的DNA，該 DNA可選在Ν-末端延伸或其本身的CTS被置換為另一種定位于高爾基體的蛋白的Ν-末端 CTS序列，以這種方式，該酶在Ν-連接的聚糖上具有半乳糖基化活性。合適的載體進(jìn)一步包 含調(diào)節(jié)元件，如啟動(dòng)子，并可選包含至少一種可在所述的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的選擇標(biāo)記。 該表達(dá)載體可進(jìn)一步編碼至少一種編碼能糖基化的哺乳動(dòng)物糖蛋白的進(jìn)一步DNA。
[0091] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供產(chǎn)生功能性非哺乳動(dòng)物的酶的植物或植物細(xì) 胞該功能性非哺乳動(dòng)物的酶可選在Ν-末端被延伸，延伸的序列為來源于哺乳動(dòng)物GalT或 其內(nèi)源性CTS被另一種來源于植物的定位于高爾基體的蛋白的CTS置換，該植物或植物細(xì) 胞能進(jìn)行正常情況下在植物中不出現(xiàn)的N-聚糖的生物合成從而例如產(chǎn)生加入半乳糖后使 N-連接的聚糖延伸的能力。在某些【具體實(shí)施方式】中，表達(dá)是瞬時(shí)的，而在其它【具體實(shí)施方式】 中，表達(dá)非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或其酶學(xué)活性衍生物或部分，和可選表達(dá)另外 的可被糖基化的異源蛋白的植物或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在某些【具體實(shí)施方式】中， 植物或植物細(xì)胞可另外表達(dá)第三種蛋白。這種第三種蛋白可是進(jìn)一步將所述的半乳糖基化 的第二種蛋白糖基化。在某些【具體實(shí)施方式】中，植物細(xì)胞或植物可包含兩條核酸，其編碼二 聚體或多聚體蛋白的單體。在某些【具體實(shí)施方式】中，各個(gè)核酸是抗體的輕鏈和重鏈或其功 能片段或是任何其它目的二聚體或多聚體蛋白。當(dāng)然，不必要表達(dá)全長蛋白質(zhì)。在某些具 體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的植物細(xì)胞或植物僅表達(dá)片段，優(yōu)選是所述第二種哺乳動(dòng)物糖 蛋白的功能片段，所述片段具有完整蛋白的至少一種活性并且其進(jìn)一步特征是例如具有截 短的多肽鏈或是未充分延伸的聚糖，例如僅延伸出半乳糖。本發(fā)明也提供這種糖蛋白或其 片段。
[0092] 將植物特異性殘基如β 1，2-木糖和α 1，3-巖藻糖殘基加至植物中產(chǎn)生的糖蛋白 上使得這種糖蛋白較不適于藥物用途，因?yàn)棣?，2-木糖和α?，3-巖藻糖殘基在哺乳動(dòng)物 體內(nèi)產(chǎn)生非預(yù)期的抗原性和免疫原性特征。為了實(shí)質(zhì)上限制β?，2-木糖和α?，3-巖藻糖 殘基在植物中產(chǎn)生的糖蛋白上的數(shù)目或?yàn)榱诉_(dá)到完全不含這些殘基，需要以合成顯示人源 化火哺乳動(dòng)物源化特征的糖蛋白的方式修飾植物細(xì)胞基因組的策略。
[0093] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供這樣的植物細(xì)胞或植物：其中第二種蛋白和 優(yōu)選第二種哺乳動(dòng)物蛋白或其功能片段包含不含木糖和/或巖藻糖延伸出來的Ν-連接的 聚糖。植物來源的半乳糖基化糖蛋白仍然可含有木糖和巖藻糖殘基。在某些【具體實(shí)施方式】 中，在本發(fā)明的別處所述的非哺乳動(dòng)物β 1，4_半乳糖轉(zhuǎn)移酶或其修飾版本因此在植物中 以下列方式表達(dá)：在高爾基體中酶作用于天然底物，也就是在Ν-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I，高 爾基體-甘露糖苷酶II和Ν-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶II的作用后，假如這些酶不在另一中途 徑中被抑制，在木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶作用之后。自植物中獲得的半乳糖基化蛋 白本文是指植物來源的。本文也提供這種植物來源的半乳糖基化蛋白。
[0094]為了在植物中產(chǎn)生定制的糖蛋白，使植物的糖基化作用最大化，可將木糖基轉(zhuǎn)移 酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶敲除或沉默，并且在幾種哺乳動(dòng)物的糖基轉(zhuǎn)移酶中至少一種表達(dá)。如 果木糖基轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶敲除并因此降低植物的非所需的糖基化潛力是可行的 選擇，因?yàn)槔缇幋aΝ-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I的基因發(fā)生突變的擬南芥突變體是完全有活 力的。由于Ν-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I是起始復(fù)雜聚糖的形成的酶，該植物完全缺乏含有復(fù) 雜聚糖的木糖和巖藻糖殘基。
[0095] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供這樣的植物或植物細(xì)胞：其中可被糖基化的 非哺乳動(dòng)物β -1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或其酶學(xué)活性衍生物或部分，另外的異源蛋白，和可選 另外提供進(jìn)一步Ν-聚糖的生物合成的第三種蛋白被表達(dá)，并且其中編碼負(fù)責(zé)添加木糖和/ 或巖藻糖的酶的基因被敲除，或者其中使用反義鏈或RNAi技術(shù)使這些基因沉默表達(dá)。在植 物中進(jìn)行基因敲除或通過RNAi使基因沉默的方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0096] RNA干擾（RNAi)是抑制基因在翻譯階段表達(dá)或通過阻礙特定基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。小 干擾RNA鏈（siRNA)對于RNAi過程是關(guān)鍵的，并具有與靶RNA鏈互補(bǔ)的核酸鏈。特異性 RNAi途徑蛋白，如dicer (RISC)，被siRNA導(dǎo)向靶信使RNA (mRNA)，在此處它們將靶序列剪切 成為不再能翻譯成蛋白的小的部分。RNA干擾是對病毒和其它異源遺傳物質(zhì)的免疫應(yīng)答的 重要的部分，尤其是在植物中。
[0097] RNA干擾已經(jīng)用于在植物生物技術(shù)的應(yīng)用中，例如在工程化產(chǎn)生較低水平的天 然植物毒素的農(nóng)作物的應(yīng)用中，在番茄植物降低變應(yīng)原水平，和在番茄中強(qiáng)化含食用抗 氧化劑的植物（Sunilkumar G.et al. (2006)Proc Natl Acad Sci USA103(48) :18054 -9 ；Siritunga D, Sayre R(2003)Planta217 (3) : 367 - 73 ；Le L. et al. (2006)Plant Biotechnol J4(2):231 - 42 ；Niggeweg R.et al. (2004)Nat Biotechnol22(6):746 - 54) 〇 這種技術(shù)具有在植物家系中具有穩(wěn)定的和可遺傳的RNAi表型的優(yōu)勢。
[0098] 在其它【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供將包含延伸的不含木糖和/或巖藻糖N-連 接的聚糖的糖蛋白特異性分離和純化的方法。有幾種分離技術(shù)，如（免疫）親和純化或 分子大小排除層析或電泳，以進(jìn)行所需的純化。這些方法為本領(lǐng)域所熟知（例如見US 2008/0003680)〇
[0099] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明不限于植物或植物細(xì)胞，還提供其它生物體，像動(dòng) 物，真菌或酵母，或細(xì)胞系，像哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或昆蟲細(xì)胞系，能產(chǎn)生本發(fā)明所述的糖蛋白 (基本上是非唾液酸化的）其中所述的N-連接的聚糖包含半乳糖。
[0100] 在某些【具體實(shí)施方式】中，通過接種含有包含如本文所述的編碼N-糖基化修飾的 酶的核酸序列和編碼商業(yè)目的異源糖蛋白基因的（二元）載體的帶有土壤桿菌屬品系的植 物細(xì)胞或組織可建立產(chǎn)生定制的商業(yè)目的糖蛋白的產(chǎn)生瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。可替代 地，在某些【具體實(shí)施方式】中，產(chǎn)生定制商業(yè)目的糖蛋白的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物可通過同 時(shí)接種（共轉(zhuǎn)化）兩種或多種土壤桿菌屬品系，每種帶有包含編碼N-糖基化修飾酶的核酸 序列或編碼異源的商業(yè)目的糖蛋白的核酸序列的載體而產(chǎn)生?？商娲?，在某些具體實(shí)施 方式中，產(chǎn)生定制商業(yè)目的糖蛋白的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物能通過將修飾N-糖基化的植 物與表達(dá)編碼商業(yè)目的蛋白的多聚核苷酸的植物進(jìn)行（多重）雜交而產(chǎn)生。在所有這些程 序中，載體可還包含賦予其抗選擇劑的抗性的核酸序列。
[0101] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，為了獲得涉及N-糖基化的蛋白和商業(yè)目的糖蛋白或多 肽的滿意表達(dá)，可使核酸系列適應(yīng)于宿主植物中的特異性轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制。例如，可在編碼 區(qū)內(nèi)導(dǎo)入沉默突變以改進(jìn)密碼子用法，且可使用特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述基因在相關(guān)植物組 織中的表達(dá)?？杀话l(fā)育中（developmentally)調(diào)節(jié)的或能隨意誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可用于確保在 合適的時(shí)間表達(dá)，例如，僅在植物組織在從田地里收獲后并被送進(jìn)控制條件下后表達(dá)。在所 有這些情況下，應(yīng)選擇在同一細(xì)胞中表達(dá)以使糖蛋白發(fā)生所需翻譯后修飾的糖基化修飾蛋 白的和商業(yè)目的糖蛋白的表達(dá)盒。
[0102] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供煙草植物或與煙草屬物種相關(guān)的植物，優(yōu)選 是普通煙草（N. tabacum)或本塞姆氏煙草（N. benthamiana)。在其它【具體實(shí)施方式】中，可 使用其它相對容易轉(zhuǎn)化的植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana)或玉米（Zea mays),或 與其有關(guān)的植物。對于重組糖蛋白的產(chǎn)生，使用浮萍具有特別的優(yōu)勢。該植物一般小，并 通過營養(yǎng)體的出芽進(jìn)行無性生殖。大多數(shù)浮萍物種具有大得多的植物的所有的組織和器 官，包括根，莖，花，種子和葉。浮萍能在能輕易地將其收獲的滿的容器（containment)中在 簡單的液體溶液的表面以自由漂浮的植物廉價(jià)和非?？焖俚厣L。在某些【具體實(shí)施方式】 中，浮萍是重組的，其產(chǎn)生非哺乳動(dòng)物β_1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶或其修飾版本（本文中所描述 的）和/或編碼商業(yè)上的目的性異源糖蛋白的基因。浮萍植物可包含例如紫萍屬（genus Spirodella)，無根萍屬（genus Wolffia)，扁無根萍屬（genus Wolffiella)或浮萍屬（genus Lemna),小浮萍（Lemna minor),微小浮萍（Lemna miniscula)和圓浮萍（Lemna gibba)。
[0103] 在某些【具體實(shí)施方式】中，表達(dá)在番茄果實(shí)中進(jìn)行。番茄能容易地在含有 (contained)和控制條件下在溫室中生長，并且能在全年大量連續(xù)收獲番茄果實(shí)生物量。能 容易地將含有目的糖蛋白的水樣部分從番茄果實(shí)的其余部分中分離以使糖蛋白的純化更 容易。在某些【具體實(shí)施方式】中，表達(dá)在其它作物的貯藏器官中進(jìn)行，所述的貯藏器官包括但 不限于玉米仁，馬鈴薯根莖和油菜籽或向日葵的種子，其是有吸引力的替代方法可產(chǎn)生巨 大的生物量的器官以便于使用收獲和加工技術(shù)。
[0104] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，如轉(zhuǎn)基因煙草亞種， 優(yōu)選普通煙草（N. tabacum)或本塞姆氏煙草（N. benthamiana)，擬南芥或玉米，馬鈴薯，番 茄或浮萍，這些植物能表達(dá)能通過半乳糖延伸N-連接的聚糖的重組蛋白，所述方法包含將 所述轉(zhuǎn)基因植物與至少包含一種可選的功能性非哺乳動(dòng)物蛋白的植物雜交，例如，能進(jìn)行 N-聚糖生物合成的運(yùn)載體或酶正常不存在于植物中，自所述的雜交中收獲子代并選擇表 達(dá)所述重組蛋白的子代和表達(dá)參與哺乳動(dòng)物樣N-聚糖的生物合成的功能性非哺乳動(dòng)物的 酶，該酶正常不存在于植物中。在一種【具體實(shí)施方式】中，該方法可進(jìn)一步包含選擇表達(dá)所述 的包含延伸的N-連接的至少包含半乳糖的聚糖的重組蛋白的所需子代植物。
[0105] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供表達(dá)包含N-連接的聚糖的所述重組糖蛋白 的植物和表達(dá)參與哺乳動(dòng)物樣N-聚糖的生物合成的非哺乳動(dòng)物的酶的植物。在另外的具 體實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生所需糖蛋白或其功能片段的用途，尤其其 中所述的糖蛋白或其功能片段包含延伸的N-連接的至少包含半乳糖的聚糖。
[0106] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供產(chǎn)生能表達(dá)能以半乳糖延伸N-連接的聚糖 的重組蛋白的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物如轉(zhuǎn) 基因煙草物種，優(yōu)選BY2煙草，胡蘿卜或擬南芥細(xì)胞懸浮物。
[0107] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供產(chǎn)生能表達(dá)能以半乳糖延伸N-連接的聚糖 的重組蛋白的轉(zhuǎn)基因苔蘚的方法，所述的轉(zhuǎn)基因苔蘚如轉(zhuǎn)基因苔蘚植物（Bryophytaea)， 優(yōu)選小立碗蘚（Physcomitrella patens)或葫蘆蘚（Funaria hygrometrica)，角齒蘚 (Ceratodon purpureus)〇
[0108] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供獲得所需糖蛋白或其功能片段的方法，該方 法包含例如至少包含半乳糖的聚糖延伸N-連接的聚糖。所述的方法包含將本發(fā)明所述的 植物培養(yǎng)直至所述植物達(dá)到收獲階段，例如當(dāng)長出足夠的生物量時(shí)進(jìn)行有盈利的收獲，接 著本領(lǐng)域已建立的已知技術(shù)收獲所述的植物并將采用本領(lǐng)域已建立的已知技術(shù)分離所述 的植物，以獲得各部分植物材料和從所述的各部分植物材料中至少是部分分離所述糖蛋 白。
[0109] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供植物來源的包含以至少包含半乳糖的聚糖延 伸N-連接的聚糖的糖蛋白及其片段，例如通過上面解釋的方法獲得的及其片段。這種植物 來源的帶有以至少包含半乳糖的聚糖延伸的聚糖的糖蛋白實(shí)質(zhì)上能是任何所需的能在植 物中表達(dá)的糖蛋白。例如，抗體，疫苗，細(xì)胞因子，F(xiàn)SH，TSH和其它激素糖蛋白，其它激素像 ΕΡ0,酶像抗胰蛋白酶或脂酶，細(xì)胞粘附分子像NCAM或膠原能在植物中產(chǎn)生并能產(chǎn)生實(shí)質(zhì) 上哺乳動(dòng)物糖基化模式。
[0110] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供如上所述的這種植物來源的糖蛋白及其功能 片段的用于產(chǎn)生藥物組合物，例如用于產(chǎn)生用于以抗體，激素，細(xì)胞因子，疫苗抗原，酶等治 療患者的藥物組合物的用途。本發(fā)明還提供這種包含糖蛋白及其功能片段的藥物組合物。
[0111] 植物的轉(zhuǎn)化
[0112] 能通過使用本領(lǐng)域已知方法表達(dá)蛋白，這些蛋白如例如產(chǎn)生N-聚糖的生物合成 的非哺乳動(dòng)物酶，以及糖蛋白，如抗體，細(xì)胞因子，疫苗，激素等。例如，通過土壤桿菌屬介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化電穿孔或基因槍的穩(wěn)定表達(dá)，或通過使用病毒載體如PVX，例如，或農(nóng)業(yè)濾過作用或 本領(lǐng)域其它已知方法的瞬時(shí)表達(dá)。本發(fā)明所述的能進(jìn)行聚糖的生物合成糖基轉(zhuǎn)移酶，和/ 或承擔(dān)糖基化的糖蛋白可在特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)，所述的特異性啟動(dòng)子能易化其在 特定組織或器官中的表達(dá)。編碼所需非哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶和/或本文所述的糖蛋白的多 肽的DNA序列，例如編碼蛋白全長的cDNA或基因組序列，可被用于構(gòu)建能被導(dǎo)入所需植物 中的重組表達(dá)盒。
[0113] 如本文所述分離的核酸，例如包含如SEQ ID N0:1，8, 10, 13, 15和17的序列，能根 據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)導(dǎo)入植物中。通常，制備上述和適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組表達(dá)盒。本 文所述的分離核酸然后能用于轉(zhuǎn)化。以這種方式，能獲得遺傳修飾植物，植物細(xì)胞，植物組 織，種子等。
[0114] 轉(zhuǎn)化流程可依進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物 而不同。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適的方法包括顯微注射法（Crossway et al. (1986) Biotechniques4:320-334),電穿孔法（Riggs et al (1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:5602-5606)，土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（見于例如 Zhao et al. U. S. Patent5, 981，840 ; Hinchee et al. (1988) Biotechnology6:915-921),直接基因轉(zhuǎn)移方法（Paszkowski et al(1984)ΕΜΒ0 J.3:27172722),和基因槍法（見于例如 Sanford et al. U. S. Patent4, 945, 050 ；Tomes et al·''Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment〃In Gamborg and Phillips (Eds.) Plant Cell, Tissue and Organ Culture:Fundamental Methods, Springer-Verlag, Berlin(1995) ;and McCabe et al. (1988)Biotechnology6:923-926)〇
[0115] 被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞根據(jù)常規(guī)方法在植物中生長。見于文獻(xiàn)（例如McCormick et al.(1986)Plant Cell R印orts, 5:81-84·)。然后，種植這些植物，并與同一轉(zhuǎn)化品系或不 同品系授粉，且所得雜交品系具有所需鑒定過的表型特征?？煞N植兩代或多代以確保主題 表型特征穩(wěn)定保留并遺傳，然后收獲種子以確保所需表型或其它特性可得到。
[0116] 轉(zhuǎn)基因的再生
[0117] 轉(zhuǎn)化植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞能再生，例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)植物組織培養(yǎng)技術(shù)從單細(xì) 胞中，愈傷組織或葉片中再生。本領(lǐng)域熟知，能成功地培養(yǎng)任何植物的幾乎各種細(xì)胞， 組織和器官以再生整個(gè)植物。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體重再生植物見于文獻(xiàn)所述（Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company, New York, pp. 124176(1983) ；and Binding, Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，CRC Press，Boca Raton，pp. 21-73(1985)·)。
[0118] 能實(shí)現(xiàn)從葉子分離體中使含有通過土壤桿菌屬導(dǎo)入的異源基因的植物再生，（見 Horsch et al.，Science, 227:1229-1231 (1985)所述）。在這個(gè)程序中，轉(zhuǎn)化體生長在選擇 劑存在和在誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的植物物種的芽再生的培養(yǎng)基中（見Fraley et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S. A. ),80:4803(1983)所述）。該程序通常在兩周至四周的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生芽，并 且然后將這些轉(zhuǎn)化體芽轉(zhuǎn)移至含有選擇劑和預(yù)防細(xì)菌生長的抗生素的合適的芽-誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中。可使本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因植物增殖或使其不能增殖。
[0119] 再生也能從植物的愈傷組織，移出物，器官或其部分。這種再生技術(shù)通常見文獻(xiàn) 所述（Klee et al.，Annu Rev Plant Phys. 38:467-486(1987))。本領(lǐng)域熟知，從來自單 一植物原生質(zhì)體或各種移出物進(jìn)行植物的再生（見，例如Methods for Plant Molecular Biology, A. ffeissbach and H. ffeissbach, eds. , Academic Press,Inc. , San Diego, Calif. (1988))。這種再生和生長過程包括選擇轉(zhuǎn)化體細(xì)胞和芽，使轉(zhuǎn)化體芽生根并在土壤中生 長成小的植株的步驟。玉米細(xì)胞培養(yǎng)和再生通常見文獻(xiàn)（The Maize Handbook, Freeling and ffalbot, Eds. , Springer,New York (1994) ；Corn and Corn Improvement,3rd edition, Sprague and Dudley Eds. , American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988))。
[0120] 技術(shù)人員意識到重組表達(dá)盒穩(wěn)定摻入轉(zhuǎn)基因植物中并被證實(shí)是可操作的之后，其 能通過性別雜交導(dǎo)入其它植物中。能使用任何數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)，這取決于待雜交物種。 在營養(yǎng)體繁殖的作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物能通過取其切屑或通過組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖以產(chǎn) 生多個(gè)同一植物。
[0121] 為商業(yè)用途選擇所需轉(zhuǎn)基因體，并獲得新的品種并優(yōu)選將其進(jìn)行營養(yǎng)體繁殖。在 種子繁殖作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物能自交以產(chǎn)生純合的近親交配植物。該近親交配植物 產(chǎn)生含有新導(dǎo)入的異源核酸的種子。這些種子能長成產(chǎn)生所選表型的生產(chǎn)植物。
[0122] 本發(fā)明包括從再生植物獲得的部分，如花，種子，葉，枝條，果實(shí)等，如果這些部分 包含含有本文所述的分離核酸的細(xì)胞。再生植物的子代和變體和突變體也包括在本發(fā)明的 范圍內(nèi)，如果這些部分包含導(dǎo)入的核酸序列。
[0123] 表達(dá)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物能通過例如標(biāo)準(zhǔn)免疫印跡和DNA檢測技術(shù)以篩選本 文所說述的核酸的傳遞。通常還在異源核酸的表達(dá)水平上評價(jià)轉(zhuǎn)基因品種。能在起初確定 RNA水平上的表達(dá)以鑒定和定量表達(dá)陽性植物。能使用RNA分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，這些技術(shù)包 括使用設(shè)計(jì)用以僅擴(kuò)增異源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR擴(kuò)增檢測和使用異源核酸特異 性探針的溶液雜交檢測。然后能將RNA陽性植物通過Western免疫印跡檢測進(jìn)行蛋白表分 析，該檢測使用本文提供的特異性反應(yīng)抗體。此外，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程，分別使用異源核酸特異 性多聚核苷酸探針和抗體能進(jìn)行原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測來定位在轉(zhuǎn)基因組織中的 表達(dá)位點(diǎn)。通常，篩選多個(gè)轉(zhuǎn)基因品種的摻入的核酸以鑒定和選擇具有適合的表達(dá)譜的植 物。
[0124] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供對于添加的異源核酸是純合的轉(zhuǎn)基因植物； 即含有兩種添加的核酸序列，在每對染色體的每條染色體上同一基因座上各有一個(gè)基因的 轉(zhuǎn)基因植物。能通過將含有單添加的異源核酸進(jìn)行性別交配（自交），使所產(chǎn)生的種子中的 一些發(fā)芽，并分析本文所述的多聚核酸表達(dá)相對于對照植物（即天然非轉(zhuǎn)基因植物）發(fā)生 改變所產(chǎn)生的所得植物獲得純合轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也關(guān)注與親代植物回交和與非轉(zhuǎn)基因 植物異型雜交。
[0125] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的生產(chǎn)過程， 該過程包含（a)將DNA插入植物或植物細(xì)胞的基因組中，所述的DNA包含編碼非哺乳動(dòng)物 β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸序列（其可選以哺乳動(dòng)物N-末端序列衍生，如本文所述）或 編碼所述GalT的核酸序列（其中它的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS，如 本文所述）或其酶學(xué)活性衍生物或部分，且此外優(yōu)選至少一種需將其N-連接的聚糖半乳糖 基化的哺乳動(dòng)物蛋白的核酸序列，該DNA另外編碼至少一種在所述植物或所述植物細(xì)胞中 表達(dá)的選擇標(biāo)記，（b)選擇已經(jīng)攝入（a)所述的DNA的植物或植物細(xì)胞；和（c)在合適的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)所需的轉(zhuǎn)基因植物或所需的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。技術(shù)人員應(yīng)理解術(shù)語"包含半乳 糖基化的N-連接的聚糖的蛋白"與編碼所述蛋白的核酸分子之間的關(guān)系，該核酸分子僅編 碼多肽，然而半乳糖基化N-連接的聚糖是該蛋白在高爾基體中的加工的結(jié)果。
[0126] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供生產(chǎn)表達(dá)重組GalT蛋白和包含半乳糖基化 N-連接的聚糖的蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的另外的方法。這種方法可例如包含將本文所述的轉(zhuǎn)基 因植物與另一種植物雜交，收獲所述雜交的子代，并選擇所需表達(dá)重組GalT蛋白和表達(dá)重 組哺乳動(dòng)物糖蛋白，尤其是包含半乳糖基化N-聚糖或其功能片段的蛋白的子代植物。
[0127] 蛋白純化
[0128] 在某些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明提供獲得所需糖蛋白或其功能片段的方法，該方 法包含將本文所述的植物培養(yǎng)直到所述植物達(dá)到可以收獲的階段，收獲并將植物分割以獲 得分割的植物材料，并從所述分割的植物材料中至少部分分離所述糖蛋白。在某些具體實(shí) 施方式中，獲得所需糖蛋白或其功能片段的方法包括在發(fā)酵罐中在細(xì)胞培養(yǎng)中使植物細(xì)胞 生長直到所述的細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)達(dá)到可以收獲的階段或能從培養(yǎng)基中將所需糖蛋白收集起 來。本文所述的糖蛋白，如例如抗體，疫苗，細(xì)胞因子和激素，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。重組蛋白通過聯(lián)合使用細(xì)胞裂解（例如超聲裂解法，法國出版社）和親 和層析或其它基于親和力的方法純化。對于融合產(chǎn)物，融合蛋白以合適的蛋白水解酶進(jìn)行 后續(xù)消化，釋放出所需重組蛋白。
[0129] 本文所述蛋白，重組蛋白或合成蛋白，可通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其純化至 實(shí)質(zhì)上是純凈的（程度），這些方法包括去污劑增溶溶解，以如硫酸胺的物質(zhì)進(jìn)行選擇沉 淀，柱層析，免疫純化方法及其他（見例如R. Scopes, Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag: New York (1982) ；Deutscher,Guide to Protein Purification, Academic Press (1990))。例如，可產(chǎn)生抗本文所述的蛋白的抗體。遵循美國 專利No. 4, 511，503所述的程序能達(dá)到從E. coli中純化。然后，從表達(dá)該蛋白的細(xì)胞中分 離該蛋白，并通過本文所述的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)將其進(jìn)一步純化。通過本領(lǐng)域已知的方 達(dá)到檢測表達(dá)蛋白，這些方法包括，例如放射性免疫檢測方法，Western印跡技術(shù)活免疫沉 淀方法。
[0130] 實(shí)施例
[0131] 實(shí)施例1 :
[0132] 鑒定推定的非哺乳動(dòng)物β 1，4GalT
[0133] β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（GalT)家族包含至少七個(gè)成員，其中數(shù)個(gè)已經(jīng)被克隆出來 但僅有少數(shù)幾個(gè)被鑒定出來。人和牛起源的β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)被最佳地鑒定出 來，并顯示出能以β-1，4-鍵將半乳糖殘基加至Ν-聚糖的末端GlcNAc殘基上。非哺乳動(dòng) 物物種基因序列中推定的參與N-糖基化的GalT基因基于同源性而被鑒定。圖1顯示，哺 乳動(dòng)物GalT基因序列（人，小鼠 和牛）和非哺乳動(dòng)物推定的GalT基因序列（雞，斑馬魚和 蛙）之間的Clustal W比對。顯著地，哺乳動(dòng)物的氨基末端（位于實(shí)線方框內(nèi)，位于細(xì)胞漿 內(nèi)并與跨膜區(qū)相連（TM，虛線方框內(nèi)）且推定其參與高爾基體-定位過程）在非哺乳動(dòng)物 起源的如例如雞和斑馬魚（見圖1)的GalT直系同源物中不保守。
[0134] 認(rèn)為高爾基體-定位過程對于GalT活性是重要的，GalT活性能是"晚期"（可能 跨高爾基體），這意味著GalT的催化活性出現(xiàn)在其它糖基轉(zhuǎn)移酶的作用之后，這些糖基轉(zhuǎn) 移酶產(chǎn)生雙觸角N-聚糖，如例如植物中的Man-I，GnT-I，Man-II，GnT-II，XylT和FucT，或 GalT的催化活性出現(xiàn)在"早期"（順式/中間-高爾基體），其出現(xiàn)在Man-II，XylT和FucT 活性之前，從而預(yù)防在不含巖藻糖和木糖的雜合類型N-聚糖的植物中產(chǎn)生的這些酶的活 性。
[0135] 非哺乳動(dòng)物GalT直系同源物，例如來源于雞和斑馬魚的GalT直系同源物，以前未 就其將半乳糖殘基以β -1，4-鍵加到N-聚糖的末端GlcNAc殘基上的能力進(jìn)行鑒定，尤其 是沒有就在植物中表達(dá)的異源性GalT直系同源物的這種能力進(jìn)行鑒定。尚未研究當(dāng)其在 植物中與非哺乳動(dòng)物GalT直系同源物融合表達(dá)時(shí)，不同哺乳動(dòng)物氨基末端對雙觸角或雜 合類型的N-聚糖的產(chǎn)生的影響（其可影響細(xì)胞內(nèi)的定位）和對在N-聚糖上添加植物特異 性巖藻糖和木糖殘基的效應(yīng)。
[0136] 克隆和檢測了雞和斑馬魚中每一種的三個(gè)GalT構(gòu)建體的N-糖基化活性：a) 野生型非哺乳動(dòng)物雞和斑馬魚i3-l，4-GalTl ;b)將有13個(gè)氨基酸的保守的哺乳動(dòng)物 (人）氨基末端（見圖1)延伸序列與非哺乳動(dòng)物雞和斑馬魚β -1，4-GalTl融合；和c) 哺乳動(dòng)物胞漿尾和大鼠唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因來源的跨膜結(jié)構(gòu)域（CTS)與非哺乳動(dòng)物雞和斑 馬魚i3-l，4-GalTl形成的融合蛋白，置換帶有大鼠唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS的雞和斑馬魚 β -1，4-GalTl的氨基末端（見實(shí)施例2和3).
[0137] 實(shí)施例2:
[0138] 編碼全長雞β 1，4-GalTl酶及其變體的基因的克隆和表達(dá)
[0139] 推定的雞 β l，4-GalTl(GGal ;GenBank accession U19890 ;SEQ Ggal，SEQ ID N0:2)克隆得較早，盡管未顯示能將N-聚糖半乳糖基化（Shaper et al.，J Biol Chem272, 31389-31399, 1997)。在我們實(shí)驗(yàn)室，以引物 GgalLEEVAST 和 GgGaldw 用 RT-PCR 將包含114至362殘基的cDNA片段（SEQ GgGalll4-362, SEQ ID N0:3)從雞脾臟總RNA中 擴(kuò)增出來（見表1)。所得的含有C-末端的片段用Xho I和Bam HI進(jìn)行消化，請然后將其 克隆進(jìn)質(zhì)粒pCASeco中，后者是pUC19衍生物，其中多克隆位點(diǎn)兩翼的Hin dill和Eco RI 位點(diǎn)用于插入序列SEQ CASeco,同時(shí)將骨架中的這兩個(gè)位點(diǎn)和Eco31I-位點(diǎn)刪除。該質(zhì)粒 pCASeco用Xho I和Bam HI消化以適應(yīng)于產(chǎn)生C-末端GGal片段的克隆GgGalC。
[0140] 含有GGal的N-末端的cDNA片段和包含1至113殘基的cDNA片段使用基于 PCR的方法從長寡核苷酸中合成性產(chǎn)生。天然cDNA片段的富含GC的特性阻礙了直接 RT-PCR克隆的進(jìn)行，并且該片段的與野生型序列相比無氨基酸改變的密碼子優(yōu)化版本（SEQ GgGalsyn，SEQ ID N0:6)與編碼 SEQ GgGalll4-362 的克隆 GgGalC 以產(chǎn)生編碼野生型 GGal 氨基酸序列（SEQ Ggal，SEQ ID N0:2)的基因 （SEQ GgGalhybr，SEQ ID N0:1)的方式合并。 然后將文中稱為SEQ GgGalhybr的基因用作起始材料以產(chǎn)生兩種變體，一種變體是其N-末 端以編碼全長人0 1，4_GalTl(GenBank accession NM_001497)的13個(gè)氨基酸殘基的序列 延伸，且另一種是其編碼包含GGal的催化結(jié)構(gòu)域的40至362殘基的片段與N-末端結(jié)構(gòu)域 包含1-53殘基的大鼠 α 2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的C-末端融合，因此包括胞漿尾，跨膜結(jié)構(gòu)域 和部分莖區(qū)。大鼠 SialT-來源序列包含相對于野生型序列的一個(gè)沉默突變。
[0141] 帶有13個(gè)氨基酸的N-末端延伸序列的GGal使用PCR以寡核苷酸HsGgGalstart 和M13上游引物從編碼GGal的雜合克隆中制備出來（表1)。所得PCR片段用Bpi I和Xba I消化并克隆進(jìn)進(jìn)行同樣消化的GGal克隆。所得的克隆含有帶SEQ HsGGal(SEQ ID N0:8) 的基因。
[0142] 帶有大鼠 SialT N-末端結(jié)構(gòu)域的變體使用PCR以寡核苷酸GgGal 142和M13上游 引物從編碼完整GGal的克?。⊿EQ GgGalhybr，SEQ ID N0:1)中制備出來（表1)。所得的片 段用Eco31I和Bam HI消化，并克隆進(jìn)經(jīng)Nco I和Bam HI消化的含有大鼠序列的pCASeco 質(zhì)粒。所得的克隆含有帶SEQ sialGGal (SEQ ID NO: 10)的基因。
[0143] 含有三種不同GGal基因的植物轉(zhuǎn)化載體的制備過程如下：首先將用Ec〇31I和 Bam HI消化的基因克隆進(jìn)用Nco I和Bam HI消化的pRAP40載體中，使該基因位于增強(qiáng)的 CaMV35S啟動(dòng)子和AMV翻譯增強(qiáng)子的下游。pRAP40是pUC19衍生物，其含有增強(qiáng)的CaMV35S 啟動(dòng)子和兩翼的nos終止子，其借助Asc I位點(diǎn)位于該啟動(dòng)子的上游，借助Pac I位點(diǎn)位于 該終止子的下游；包括兩翼的限制性位點(diǎn)的完整盒被稱作SEQ RAP40(SEQ ID N0:12)。然 后將這三個(gè)包含啟動(dòng)子，三個(gè)基因中的一個(gè)基因和終止子的盒中的每一個(gè)盒分別轉(zhuǎn)移至二 元載體PM0G22的修飾版本中，所述版本中多克隆位點(diǎn)中的Eco RI和Hin dill位點(diǎn)已分 別被 Pac I 和 Asc I 置換（Goddijn et al.，1993，Plant J4:863-873)。為了達(dá)到這個(gè)目 的，pRAP來源克隆用Pac I和Asc I消化，然后克隆進(jìn)Asc-Pac消化的雙元載體中，假使三 種不同載體適于進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。在根瘤土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草之后，表達(dá)GGal及其變體 的轉(zhuǎn)基因植物通過分析通過轉(zhuǎn)化體合成的N-聚糖進(jìn)行選擇，使用的方法如前所述（例如 Bakker et al. Proc Natl Acad Sci U S A98:2899-904, 2001and Proc Natl Acad Sci U S A103:7577-82, 2006)〇
[0144] 從表達(dá)雞的基因的轉(zhuǎn)基因植物中純化的N-聚糖的MALDI-T0F分析結(jié)果（見圖 2A-2C，并在圖4右欄和表3中總結(jié)）顯示僅雞的帶有13個(gè)氨基酸延伸序列（HsGGal，SEQ ID NO:8)或SialT-CTS(sialGGal, SEQ ID NO: 10)的基因序列的表達(dá)導(dǎo)致帶有半乳糖殘基 的全部雙觸角N-聚糖的產(chǎn)生。野生型雞GalT基因的表達(dá)僅導(dǎo)致雜合類型的N-聚糖的產(chǎn) 生。雞 GalT 的 13 個(gè)氨基酸延伸序列（HsGGal，SEQ ID N0:8)或 SialT-CTS(sialGGal，SEQ ID NO: 10)也都有某些雜合類型半乳糖基化N-聚糖。
[0145] 顯著地，三種不同GGal基因的表達(dá)導(dǎo)致幾乎完全不含末端是兩個(gè)GlcNAc殘基的 雙觸角N-聚糖（見表3和圖4A-4C，上行，右欄）占優(yōu)勢，而不是帶有一個(gè)半乳糖切不含木 糖和巖藻糖的雜合類型半乳糖基化的N-聚糖，尤其是對于表達(dá)野生型雞GalT (見圖4A-4C， 中行，右欄）。這個(gè)N-聚糖產(chǎn)生模式顯著不同于以人GalT或斑馬魚GalT轉(zhuǎn)化的植物中獲 得的模式（分別見表3和圖4A-4C，左和中欄，且見下文）。植物特異性木糖和巖藻糖殘基 減少或完全不含，如當(dāng)在植物中表達(dá)野生型雞GalT時(shí)，見于雜合類型半乳糖基化N-聚糖， 當(dāng)產(chǎn)生例如異源性治療性糖蛋白時(shí)，由于β?，2-木糖和β?，3-巖藻糖殘基不連接至哺乳 動(dòng)物的糖蛋白上而作為變應(yīng)原，是所需的。
[0146] 實(shí)施例3 :編碼全長斑馬魚β 1，4-GalTl酶及其變體的基因的克隆和表達(dá)。
[0147] 已經(jīng)鑒定了 推定的斑馬魚 β 1，4-GalTl (Machingo et al.，Dev Biol297, 471-82, 2006 ;NM_001017730)，但其功能尚未證實(shí)，且本發(fā)明人相信，鑒定是不正 確的。從整體斑馬魚總RNA開始，全長DGal基因 （SEQ Dgal，SEQ ID N0:13)使用RT-PCR以 引物DrGalup和DrGaldw(見表2)進(jìn)行擴(kuò)增。所得的片段用Xba I和Bam HI消化，然后克 隆進(jìn)同樣消化的質(zhì)粒pCASeco (見上文）中。序列測定顯示，其事實(shí)上與未鑒定的Genbank 登錄號為001077259相同，盡管有三個(gè)突變?nèi)绱颂幩荆ㄗ?1開始，且非沉默突變下劃 線）：T126C. T230G. G862C〇 Dgal (SEQ Dgal, SEQ ID NO: 14)與推定的斑馬魚 β 1，4-GalTl 之間的氨基酸序列比較（如已發(fā)表于Machingo et al.，Dev Biol297, 471-82,2006; NM_001017730)顯示在氨基酸水平上有少數(shù)序列同源性，尤其是在N-末端，假設(shè)N-末端參 與高爾基體-定位過程，且在我們的克隆中的C-末端顯著延長（見圖5)。
[0148] 帶有13個(gè)氨基酸的N-末端延伸序列的DGal從編碼DGal的克?。⊿EQ Dgal，SEQ ID N0:13)中使用PCR以寡核苷酸HsDrup和DrGaldw(表2)制備出來。所得PCR片段用 Acc I和Bpi I消化，并克隆進(jìn)同樣消化的DGal克隆中。所得的克隆含有帶SEQHsDGal(SEQ ID NO: 15)的基因。
[0149] 帶有大鼠 SialT N-末端結(jié)構(gòu)域的變體從編碼完整DGal的克?。⊿EQ Dgal，SEQ ID N0:13)中使用PCR以寡核苷酸DrGall60和DrGaldw(見表2)制備出來。所得片段用Bpi I和Bam HI消化，并克隆進(jìn)含有大鼠序列的用Nco I和Bam HI消化的pCASeco質(zhì)粒中。所 得克隆含有與大鼠的SialT基因 （SEQ sialDGal，SEQ ID N0:17)的N-末端融合的DGal催 化結(jié)構(gòu)域。
[0150] 含有三個(gè)不同DGal基因的植物轉(zhuǎn)化載體的制備過程如下：首先將用Eco31I和Bam HI消化的該基因克隆進(jìn)用消化的pRAP40載體中，造成該基因在增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子的下 游。然后這三個(gè)包含啟動(dòng)子，這三個(gè)基因之一和終止子的盒中每一個(gè)盒分別轉(zhuǎn)移至二元載 體PM0G22的修飾版本中，其中多克隆位點(diǎn)中的Eco RI和Hin dill位點(diǎn)被分別置換為Pac I 和Asc I(Goddijn et al.，1993，Plant J4:863-873)。為了達(dá)到這個(gè)目的，pRAP來源克隆用 Pac I和Asc I消化，然后克隆進(jìn)用Asc-Pac消化的二元載體中，加入三中不同載體適于進(jìn) 行植物轉(zhuǎn)化。在根瘤土壤桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化煙草后，表達(dá)DGal或其變體的轉(zhuǎn)基因植物通過分 析由轉(zhuǎn)化體合成的N-聚糖進(jìn)行選擇，所用的方法見前所述（例如Bakker et al.，Proc Natl Acad Sci U S A98:2899-904, 2001and Proc Natl Acad Sci U S A103:7577-82, 2006)。
[0151] 表達(dá)斑馬魚GalT基因序列的轉(zhuǎn)基因植物中純化的N-聚糖的MALDI-T0F分析結(jié)果 (見圖3A-3D，并總結(jié)于圖4A-4C的中欄和表3)顯示，野生型斑馬魚GalT基因序列的表達(dá)產(chǎn) 生某些雜合類型的半乳糖基化N-聚糖，和完全的帶有兩個(gè)半乳糖的雙觸角N-聚糖。取決 于植物，某些植物表達(dá)野生型斑馬魚GalT基因序列后僅有半乳糖基化雙觸角N-聚糖（見 圖3A-3D，最上端與從頂端行數(shù)第二行進(jìn)行比較）。雙半乳糖基化雙觸角N-聚糖能顯著地通 過 13 個(gè)氨基酸 N-末端人 GalT(HsDGal，SEQ ID N0:15)或 SialT-CTS-GalT(sialDGal，SEQ ID NO: 17)而增加，后者具有最高的量的半乳糖基化雙觸角N-聚糖（見表3和圖4A-4C的 底端行中間欄）。
[0152] 顯著地，通過在煙草中表達(dá)Sial-CTS-斑馬魚GalT而獲得的雙-半乳糖基化雙 觸角N-聚糖的半乳糖基化在SialT-CTS-斑馬魚GalT中較SialT-CTS-人GalT增加50% (分別見表3和圖4A-4C的底端行，中間欄和左欄）。Sial-CTS-斑馬魚GalT產(chǎn)生高達(dá)有一 個(gè)或多個(gè)半乳糖殘基的總的N-聚糖的45% (見表3)。
[0153] 當(dāng)生產(chǎn)例如異源性治療性糖蛋白時(shí)，高產(chǎn)量的有一個(gè)或多個(gè)半乳糖殘基的總的 N-聚糖是需要的，如在當(dāng)Sial-CTS-斑馬魚GalT在植物中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的雙觸角N-聚糖中 所見。表1.實(shí)施例1中使用的寡核苷酸（5'至3'）
[0154] 表1.實(shí)施例1中使用的寡核苷酸（5'至3'）
[0155]

【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)生能將半乳糖殘基以β 1，4-鍵加至N-連接的聚糖上的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞的方法，該方法包含： (a) 將編碼斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸分子插入植物或植物細(xì)胞中；并且 (b) 選擇攝入（a)中所述核酸分子并表達(dá)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì) 胞，從而產(chǎn)生出能將半乳糖殘基以β 1，4-鍵加至N-連接的聚糖上的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶如SEQ ID NO: 14所 /_J、1 ο
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶在其Ν-末端帶有哺 乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的Ν末端片段延伸，且其中哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的 Ν末端片段如SEQ ID NO: 21所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶如SEQ ID NO: 16所 /_J、1 ο
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶中的胞漿-跨膜-莖 區(qū)CTS由來源于哺乳動(dòng)物唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS取代，且其中斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶如 SEQ ID NO: 18 所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因煙草或煙草 細(xì)胞。
7. -種產(chǎn)生包含一種或多種雜合類型的半乳糖基化N-連接的聚糖的異源糖蛋白的方 法，該方法包含 ： (a) 將編碼斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的第一核酸分子和編碼異源糖蛋白的第二核 酸分子插入植物或植物細(xì)胞中，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；并且 (b) 在適合所述的第一和第二核酸分子表達(dá)的條件下維持所述的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞，從而產(chǎn)生出包含半乳糖基化的N-連接的聚糖的異源糖蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含從轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞 中分離異源糖蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中異源糖蛋白選自抗體、疫苗抗原、細(xì)胞因子、激素、 酶、細(xì)胞粘附分子和膠原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶在其N-末端帶有哺 乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的Ν末端片段延伸，且其中哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的 Ν末端片段如SEQ ID NO: 21所示。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述斑馬魚β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶如SEQ ID NO: 16所示。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶中的胞漿-跨膜-莖 區(qū)CTS由來源于哺乳動(dòng)物唾液酸轉(zhuǎn)移酶的CTS取代，且其中斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶如 SEQ ID NO: 18 所示。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物或植物細(xì)胞是煙草或煙草細(xì)胞。
14. 一種編碼多肽的核酸，所述的多肽包括： (a)斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，和 (b)其N-末端延伸，其中該延伸是哺乳動(dòng)物β?，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的N末端片段，且其 中該哺乳動(dòng)物β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的N末端片段如SEQ ID NO: 21所示。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的核酸，其中核酸編碼SEQ ID NO :16的氨基酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14的核酸，其包含SEQ ID NO : 15的核苷酸序列。
17. 編碼斑馬魚β 1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的核酸，其如SEQ ID NO : 18所示。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的核酸，其包含SEQ ID NO : 17的核苷酸序列。
【文檔編號】A01H5/00GK104195166SQ201410338812
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2008年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2007年4月17日
【發(fā)明者】G·J·A·勞溫德, D·E·A·弗洛拉克, H·J·博斯 申請人:基金會(huì)農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心