一種桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體是以桑樹種子內(nèi)胚中子葉為外植體，流水沖洗浸泡的種子經(jīng)表面殺菌后分離得到子葉，接在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，不定芽長(zhǎng)至1cm移至生根培養(yǎng)基中，形成完整植株。采用本發(fā)明方法經(jīng)不定芽產(chǎn)生的再生植株時(shí)間周期短，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，主要用于桑樹轉(zhuǎn)基因，是桑樹轉(zhuǎn)基因育種的前提和基礎(chǔ)。
【專利說明】一種桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種子葉不定芽直接誘導(dǎo)方法，為桑樹轉(zhuǎn)基因的受體部分，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在眾多的植物再生體系中，通過誘導(dǎo)葉片不定芽、體細(xì)胞胚和原生質(zhì)體再生的方法屬單細(xì)胞起源，適合用于植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)。在眾多成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，花生、楊樹等植物大多采用侵染葉片產(chǎn)生不定芽再生植株的方式，棉花、水稻等作物大多采用侵染下胚軸誘導(dǎo)胚性愈傷經(jīng)過體胚方式再生植株或先誘導(dǎo)胚性愈傷，再侵染胚性愈傷，通過體胚萌發(fā)方式再生植株。原生質(zhì)體系統(tǒng)作為轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)用得較少，主要原因是這一方法不經(jīng)濟(jì)，成本高，難度也大。相比體細(xì)胞胚體系和不定芽體系，不定芽再生體系有明顯有優(yōu)勢(shì)，如果同一種植物同時(shí)能運(yùn)用體細(xì)胞胚方式和不定芽再生方式進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，一般都會(huì)采用不定芽再生的方式。直接誘導(dǎo)不定芽時(shí)間周期短，一般誘導(dǎo)3個(gè)星期左右，不定芽開始發(fā)生，再發(fā)育4周左右可以移瓶生根，整個(gè)周期在3個(gè)月左右；而采用誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的方式，步驟繁多，時(shí)間長(zhǎng)，從浸染開始到獲得植株需要9個(gè)月至I年時(shí)間。采用不定芽再生的方式，畸形苗少，再生苗長(zhǎng)勢(shì)旺，而采用體細(xì)胞胚的方式有較多畸形苗。
[0003]王勇等學(xué)者公開了桑子葉不定芽的誘導(dǎo)與再生植株，用桑子葉為受體開展桑樹基因工程研究作準(zhǔn)備，但是其細(xì)胞分裂素與植物生長(zhǎng)素濃度比較低，并且是采取一次誘導(dǎo)的方法，不考慮不定芽 發(fā)生和發(fā)育對(duì)激素濃度要求的不同，所以子葉不定芽誘導(dǎo)率很低；此外，該方法缺乏組織學(xué)和解剖學(xué)的方法證明所誘導(dǎo)的芽為不定芽還是胚芽來(lái)源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決的技術(shù)問題:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，根據(jù)不定芽發(fā)生和發(fā)育對(duì)激素濃度要求的不同進(jìn)行遞度誘導(dǎo)，在高濃度細(xì)胞分裂素(6-BA)下誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的啟動(dòng)，在不定芽發(fā)生啟動(dòng)后轉(zhuǎn)入較低濃度細(xì)胞分裂素(6-BA)中促進(jìn)不定芽發(fā)育，方法穩(wěn)定，誘導(dǎo)率高。
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，包括以下步驟:
(I)種子吸脹與培養(yǎng)
將桑樹種子清水浸泡12h后，用流水沖洗1-2h，其次用7%次氯酸鈉溶液或0.1%氯化汞溶液滅菌15分鐘，然后用滅菌蒸餾水沖洗3-4次。
[0006](2)子葉分離
將吸漲滅菌好的桑樹種子置于解剖鏡下，用尖嘴鑷撕去種皮，將兩片子葉分開，用手術(shù)刀將子葉從基部切除。
[0007](3)不定芽誘導(dǎo)
將分離得到子葉接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)26°C，光周期16L/8D誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中。[0008]所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+3mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值為5.8-6.0。
[0009]所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+2mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值為5.8-6.0。
[0010](4)不定芽生長(zhǎng)
不定芽形成后，當(dāng)不定芽形成3-4片葉片時(shí)移入桑樹組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)+0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 5.8-6.0。
[0011](5)不定芽生根
當(dāng)不定芽長(zhǎng)至I厘米時(shí)，移入生根培養(yǎng)基形成完整植株，生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值為5.8-6.0。
[0012]有益效果:本發(fā)明為桑樹轉(zhuǎn)基因提供了一個(gè)有效的受體再生系統(tǒng)，時(shí)間周期短，不定芽誘導(dǎo)效果好，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)效果好，為大規(guī)模轉(zhuǎn)基因桑樹創(chuàng)造了可能，實(shí)現(xiàn)桑樹種質(zhì)通過轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新與儲(chǔ)備。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為子葉分離圖；圖2為誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生的不定芽；
圖3為桑樹子葉不定芽掃描電鏡照片；圖4為桑樹子葉不定芽發(fā)生組織切片。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明范圍。
[0015]實(shí)施例1
(I)種子吸脹與培養(yǎng)
取200粒一代雜交桑豐馳桑種子,放入燒杯內(nèi)加清水浸泡12小時(shí),然后將燒杯放在水龍頭下流水沖洗2小時(shí)；之后將燒杯中水倒干，加入75%酒精晃動(dòng)10分鐘，倒干酒精后清水沖洗2次；加7%次氯酸鈉溶液表面殺菌15分鐘，其間不斷晃動(dòng)，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用滅菌蒸溜水沖洗3次。
[0016](2)子葉分離
將表面殺菌處理后的種子置于超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖鏡上，用手術(shù)刀在種臍處側(cè)面切開種皮缺口，用鑷子輕壓種子種皮缺口對(duì)側(cè)，將完整胚輕輕擠出；用解剖鑷將胚中兩片子葉輕輕分開，用手術(shù)刀將子葉從基部切除。
[0017](3)不定芽誘導(dǎo)
將分離得到子葉接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中(MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+3mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值
6.0)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)26°C，光周期16L/8D誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)3周移入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中(MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+2mg/L6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 6.0)。
[0018](4)不定芽生長(zhǎng)不定芽發(fā)育至3-4片葉片時(shí)將不定芽移出，剪去下部葉片，移入不定芽繼代培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6_BA)+0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值為6.0)。
[0019](5)不定芽生根
待不定芽長(zhǎng)至I厘米，將上部莖段剪下移入生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值為6.0);不定芽生根形成完整植株后將植株取出，洗去根部瓊脂，移入室內(nèi)栽培基質(zhì)中生長(zhǎng)煉苗。
[0020]圖1為實(shí)施例1不定芽分離，從圖1中可以看出，分離得到的子葉沒有附帶任何胚芽組織；圖2為誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生的不定芽，從圖2可以看出是一團(tuán)芽，沒有一個(gè)芽占據(jù)優(yōu)勢(shì)起主芽作用；圖3為不定芽掃描電鏡圖，從圖3可以看出在細(xì)微結(jié)構(gòu)上，不定芽相互疊在一起，沒有主芽側(cè)芽之分；圖4為不定芽組織切片，從圖4可以看出不定芽發(fā)生時(shí)沒有任何維管組織與之相連。
[0021]表1實(shí)施例1子葉不定芽誘導(dǎo)情況(誘導(dǎo)培養(yǎng)后I個(gè)月調(diào)查)
【權(quán)利要求】
1.一種桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將桑樹種子清水浸泡12h后,用流水沖洗l_2h，再用7%次氯酸鈉溶液或0.1%氯化汞溶液滅菌15分鐘，然后用滅菌蒸餾水沖洗3-4次； (2)在解剖鏡下無(wú)菌環(huán)境中剝?nèi)シN皮，分離子葉； (3)將分離得到子葉接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基I上，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)26°C，光周期16L/8D誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中； (4)當(dāng)不定芽形成3-4片葉片時(shí)移入桑樹組織培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基中； (5)當(dāng)不定芽長(zhǎng)至I厘米時(shí)，移入生根培養(yǎng)基形成完整植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+3mg/L6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 5.8-6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+K8P維生素+10%椰子汁+2mg/L6_芐氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值為 5.8-6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)+0.lmg/L 萘乙酸(NAA) ，PH 值為 5.8-6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑樹子葉不定芽的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉+B族維生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值為 5.8-6.0。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104026010SQ201410243674
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】潘剛, 邸炳榮, 胡穎健, 孫銀蘋, 雷朋 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)