一種將外源基因?qū)刖酒贩N8m30的水稻細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種將外源基因?qū)刖酒贩N8m30的水稻細(xì)胞的方法。具體地講，本發(fā)明是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將外源基因?qū)氲介]穎授粉的粳稻品種8m30中。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，本發(fā)明采用了特制的培養(yǎng)基以及比常規(guī)介導(dǎo)方法更好地轉(zhuǎn)化方式。通過PCR檢測鑒定，表明外源基因已導(dǎo)入8m30中。該方法成功實現(xiàn)了閉穎授粉的粳稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化，在加快性狀改良過程同時，可避免花粉外傳導(dǎo)致的基因漂移。
【專利說明】一種將外源基因?qū)刖酒贩N8m30的水稻細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及一種將外源基因?qū)氲介]穎授粉的粳稻品種8m30的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)是我國乃至世界上最重要的糧食作物，世界上60%以上的人口以稻米為主食。近年來面對日益頻繁的干旱、極端溫度等非生物脅迫的影響，人口增長和生態(tài)環(huán)境的壓力，現(xiàn)代生物技術(shù)手段，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物遺傳改良方面的重要性日漸凸顯。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為農(nóng)作物的產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良和抗性增強(qiáng)提供了新路徑、開拓了新空間。
[0003]但隨著轉(zhuǎn)基因作物的種植范圍迅速擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性，引起了廣泛關(guān)注。例如轉(zhuǎn)基因品種花粉外傳會帶來基因漂移，可能產(chǎn)生“超級雜草”等風(fēng)險，但目前缺乏實用有效的技術(shù)手段加以克服，比如物理隔離需要一定的空間阻止花粉傳播(水稻需在IOOm以上)，只適于小面積實驗，在大面積生產(chǎn)中是不切實際的。 [0004]而閉穎授粉品種在整個授粉過程中，穎花不張開，花藥不外露，花粉不會向外傳播，可以有效抑制花粉外傳，避免基因污染。通過閉穎受體來解決基因污染問題，是目前被認(rèn)為最可行的技術(shù)手段，但目前生產(chǎn)還缺乏實用化的閉穎水稻品種。本實驗室創(chuàng)制的8m30等閉穎授粉粳稻品種，不僅完全閉穎授粉，而且結(jié)實率、株高等重要農(nóng)藝性狀較好，可作為理想的轉(zhuǎn)基因受體應(yīng)用于品種快速遺傳改良，減少生態(tài)風(fēng)險。
[0005]但目前還沒有閉穎授粉水稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為充分利用具有閉穎授粉性狀的獨特遺傳資源，本發(fā)明旨在建立一種適用于閉穎授粉粳稻品種的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將外源基因?qū)氲介]穎授粉的粳稻品種8m30的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以及基于該方法來制備轉(zhuǎn)基因水稻植株的方法。本發(fā)明提供了下列技術(shù)方案來實現(xiàn)該目的。
[0008]具體而言，在一個方面，本發(fā)明提供一種將外源基因?qū)刖酒贩N8m30的水稻細(xì)胞的方法，包括下述步驟:
[0009]步驟1、將粳稻品種8m30的種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈傷組織；
[0010]步驟2、將所述次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；
[0011]步驟3、將步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶外源基因的農(nóng)桿菌接觸持續(xù)第一預(yù)定時間段；
[0012]步驟4、將步驟3所獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，21_23°C培養(yǎng)第二預(yù)定時間段，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基；[0013]步驟5、將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天；
[0014]步驟6、將步驟5處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織；
[0015]步驟7、將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和
[0016]步驟8、將步驟7所獲得的苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。
[0017]在一種優(yōu)選實現(xiàn)方式中，所述組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[N<V]/[NH4+] = 40mM/10mM ；
[0018]所述前篩選培養(yǎng)基中[NO3-] / [NH4+] = 40mM/10mM ;在所述分化再生培養(yǎng)基中[NO3I/[NH4+] = 40mM/10mM，并且含 1.5mg/L 萘乙酸(NAA)和 lmg/L6_ 芐氨基嘌呤(6-BA)；所述生根培養(yǎng)基中含0.4mg/L的萘乙酸。
[0019]在一種優(yōu)選實現(xiàn)方式中，所述步驟I中的種子是成熟種子；和/或
[0020]所述步驟1、2中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:(優(yōu)化的或預(yù)定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3g/L植物凝膠，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.80 ；和/或
[0021]所述步驟3中的與農(nóng)桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中，農(nóng)桿菌中攜帶有外源基因；和/或
[0022]所述步驟4中的 農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基包括:(優(yōu)化的或預(yù)定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4-D、20g/L鹿糖、10g/L葡萄糖、100 μ mol/L乙酰丁香酮,該農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基的pH為5.20 ;和/或
[0023]所述步驟5中的前篩選培養(yǎng)基包括所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及250mg/L羧芐青霉素；和/或
[0024]所述步驟6中的篩選培養(yǎng)基包括所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧芐青霉素；和/或
[0025]所述步驟7中的分化再生培養(yǎng)基包括大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、lg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、30g/L 山梨醇、500mg/L MES,2.5mg/L CuS04、l.5mg/L萘乙酸、lmg/L6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧節(jié)青霉素、2.5g/L植物凝膠,該分化再生培養(yǎng)基PH值為5.80 ;和/或
[0026]所述步驟8中的生根培養(yǎng)基包括1/2MS (Murashige&Skoog)基礎(chǔ)鹽2.165g/L、MS維生素、20g/L鹿糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧節(jié)青霉素、3.5g/L植物凝膠，該生根培養(yǎng)基pH值為5.80。
[0027]在一種優(yōu)選實現(xiàn)方式中，所述大量元素中[N<V]/[NH4+] = 40mM/10mM,包括KN0340mM, (NH4) 2S045mM, MgSO4.7H200.75mM, ΚΗ2Ρ042.93mM CaCl2.2Η201.13mM。
[0028]在一種優(yōu)選實現(xiàn)方式中，所述第一預(yù)定時間段為15分鐘；所述第二預(yù)定時間段為48小時。
[0029]在一種優(yōu)選實現(xiàn)方式中，所述步驟3包括選取分裂旺盛的愈傷組織收集至50mL的無菌離心管中與農(nóng)桿菌接觸。
[0030]另一方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括:
[0031]I)通過上述方法將預(yù)定外源基因?qū)胨炯?xì)胞；和
[0032]2)利用導(dǎo)入了所述外源基因的水稻細(xì)胞培育水稻植株。
[0033]在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于轉(zhuǎn)化水稻的培養(yǎng)基套組，包括如下所述的組分:
[0034](I)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
[0035](2)農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基；
[0036](3)前篩選培養(yǎng)基；
[0037](4)篩選培養(yǎng)基；
[0038](5)分化再生培養(yǎng)基；
[0039](6)生根培養(yǎng)基。
[0040]其中所述(1)-(6)分別包含如說明書表1所示的成分。
[0041]表1培養(yǎng)基的示例性配方
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種將外源基因?qū)刖酒贩N8m30的水稻細(xì)胞的方法，包括下述步驟: 步驟1、將粳稻品種8m30的種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以產(chǎn)生次級愈傷組織； 步驟2、將所述次級愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)； 步驟3、將步驟2中獲得的愈傷組織與攜帶所述外源基因的農(nóng)桿菌接觸持續(xù)第一預(yù)定時間段； 步驟4、將步驟3所獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，21-23°C培養(yǎng)第二預(yù)定時間段，所述無菌濾紙中加入2.5-3.5mL農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基； 步驟5、將步驟4處理后的愈傷組織置于前篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天； 步驟6、將步驟5處理后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培 養(yǎng)基上，以獲得抗性愈傷組織； 步驟7、將所述抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化再生培養(yǎng)基中分化成苗；和 步驟8、將步驟7所獲得的苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[Ν03-]/[ΝΗ4+]=40mM/10mM ； 所述前篩選培養(yǎng)基中[N03-]/[NH4+] = 40mM/10mM;在所述分化再生培養(yǎng)基中[N03_]/[NH4+] = 40mM/10mM，并且含L 5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_芐氨基嘌呤(6-BA);所述生根培養(yǎng)基中含0.4mg/L的萘乙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 所述步驟I中的種子是成熟種子；和/或 所述步驟1、2中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L鹿糖、2mg/L2,4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3g/L植物凝膠，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.80 ;和/或 所述步驟3中的與農(nóng)桿菌接觸是將愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中；和/或所述步驟4中的農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基包括:大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2, 4_D、20g/L鹿糖、10g/L葡萄糖、100 μ mol/L乙酰丁香酮,該農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基的pH為5.20 ;和/或 所述步驟5中的前篩選培養(yǎng)基包括所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及250mg/L羧芐青霉素；和/或 所述步驟6中的篩選培養(yǎng)基包括所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧芐青霉素；和/或 所述步驟7中的分化再生培養(yǎng)基包括大量元素、B5微量元素、MS鐵鹽、B5維生素、Ig/L 酪蛋白酶水解物、30g/L 蔗糖、30g/L 山梨醇、500mg/L MES,2.5mg/L CuS04、l.5mg/L 萘乙酸、lmg/L6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧芐青霉素、2.5g/L植物凝膠，該分化再生培養(yǎng)基PH值為5.80 ;和/或 所述步驟8中的生根培養(yǎng)基包括l/2MS(Murashige&Skoog)基礎(chǔ)鹽2.165g/L、MS維生素、20g/L鹿糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧節(jié)青霉素、3.5g/L植物凝膠,該生根培養(yǎng)基PH值為5.80。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述大量元素中[Ν03-]/[ΝΗ4+]=40mM/10mM,并且包括 KN0340mM, (NH4) 2S045mM, MgSO4.7H200.75mM, ΚΗ2Ρ042.93mM,CaCl2.2H201.13mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述第一預(yù)定時間段為15分鐘；所述第二預(yù)定時間段為48小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟3包括選取分裂旺盛的愈傷組織收集至50mL的無菌離心管中與農(nóng)桿菌接觸。
7.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括: 1)通過權(quán)利要求1-6中任一所述的方法將預(yù)定外源基因?qū)胨炯?xì)胞；和 2)利用導(dǎo)入了所述外源基因的水稻細(xì)胞培育水稻植株。
8.一種用于轉(zhuǎn)化水稻的培養(yǎng)基套組，包括如下組分: (1)愈傷組織 誘導(dǎo)培養(yǎng)基； (2)農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基； (3)前篩選培養(yǎng)基； (4)篩選培養(yǎng)基； (5)分化再生培養(yǎng)基； (6)生根培養(yǎng)基，其特征在于，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、所述農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基、所述分化再生培養(yǎng)基中[NO3-]/[NH4+] = 40mM/10mM。
【文檔編號】A01H5/00GK103981214SQ201410235525
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】李 浩, 楊劍波, 魏鵬程, 楊亞春, 倪大虎, 李莉, 倪金龍, 陸徐忠, 宋豐順, 馬卉, 秦瑞英 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所