一種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法，其中所述的原料為：施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液。本研究結(jié)果表明，污泥復(fù)合微生物菌劑能與草坪植物形成良好的共生關(guān)系。復(fù)合微生物菌劑可能通過(guò)促進(jìn)宿主植物根系對(duì)土壤水分吸收的直接作用和改善植物體內(nèi)生理代謝活動(dòng)、提高保護(hù)酶活性的間接作用來(lái)增強(qiáng)植株的抗旱性，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。其中施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌的200倍稀釋液的節(jié)水率高達(dá)57.39%。
【專利說(shuō)明】—種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]草坪建植體系構(gòu)建是現(xiàn)代城市生態(tài)建設(shè)中必須考慮的重要內(nèi)容之一，是現(xiàn)代城市社會(huì)發(fā)展與經(jīng)濟(jì)實(shí)力的一個(gè)有力體現(xiàn)，草坪建植體系的構(gòu)建對(duì)于改善城市投資環(huán)境、吸引外資、促進(jìn)旅游等各個(gè)方面都起著不可忽略的作用，而城市中草坪綠化質(zhì)量及面積也已成為評(píng)價(jià)城市環(huán)境質(zhì)量的重要客觀標(biāo)準(zhǔn)。草坪綠化也日益受到人們的重視。
[0003]草坪對(duì)人類賴以生存的環(huán)境起著美化、保護(hù)和改善的良好作用。但是草坪草是生存于自然界的開放植物體系，雖然其地理分布范圍廣泛，如在高溫、干旱到寒冷潮濕環(huán)境中都有分布，但其生命周期中也常遭受不良環(huán)境的影響。其中水分是制約草坪草成坪、生長(zhǎng)及維持顏色青綠的主要環(huán)境因子。特別是在干旱、半干旱地區(qū)水資源數(shù)量有限，時(shí)空分布極不均勻，從而極大地限制了綠地草坪的建植，增加了保養(yǎng)難度，草坪水分管理不當(dāng)，使其失去本來(lái)的美麗，水分脅迫還可使草坪加速老化，縮短草坪使用年限。加之，城市人工培植草坪與天然草坪相比，前者的耐旱能力較差，其草坪根系淺，攝取土壤水分和養(yǎng)分的能力不足，需要進(jìn)行人工灌溉。研究表明，在我國(guó)北方城市，年灌水量大約為0.6-1.0 m3/m2。但是我國(guó)淡水資源匱乏，人均淡水資源擁有量居世界末位，我國(guó)大多數(shù)城市普遍存在水資源缺乏現(xiàn)象，這就進(jìn)一歩加重 了草坪生產(chǎn)管理中的干旱脅迫。因而對(duì)草坪草抗旱性研究對(duì)節(jié)約草坪灌溉用水，緩解城市水資源危機(jī)就顯得至關(guān)重要。
[0004]草坪的數(shù)量和質(zhì)量是城市綠化水平的重要標(biāo)志。目前，國(guó)內(nèi)草坪建植的方式多種多樣，鋪設(shè)草皮雖然建坪成本高，但見(jiàn)效快，易操作，適用于所有草坪草，被廣大綠化工作者普遍接受。北京市園林綠化局曾在2007年的首屆京津地區(qū)草皮卷產(chǎn)業(yè)論壇上表示，到2020年，北京城市綠地率將達(dá)到44%至48%。天津泰達(dá)生態(tài)園林有限公司也在此介紹，濱海新區(qū)要建成宜居生態(tài)城區(qū)，規(guī)劃2010年綠化率達(dá)額到40%，綠地覆蓋率達(dá)到35%。因此，草皮卷市場(chǎng)空間非常大。冷季型草最適宜的播種時(shí)間是夏末初秋和早春，暖季型草坪草在春末夏初。在播種后40~50d后，草皮上的草坪草的覆蓋率達(dá)95%以上時(shí)即可移坪。所以一般在五、六月份第一批草皮卷才可上市。如果能夠縮短草皮生產(chǎn)的年周期，提早草皮上市時(shí)間，可大幅提高草皮卷的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，提高人們的經(jīng)濟(jì)收入。而低溫是限制草皮生產(chǎn)周期的主要因素。冬季低溫還影響草坪草的綠期應(yīng)用范圍，降低其觀賞價(jià)值。因此，要提早草皮卷上市時(shí)間以及建植高質(zhì)量的草坪就必須深入細(xì)致地研究其抗寒性以便更好地在園林綠化中發(fā)揮其作用。
[0005]針對(duì)以上問(wèn)題，目前研究集中于選取抗逆性強(qiáng)的草坪植物、應(yīng)用保水劑、施加化學(xué)改良劑、施肥等措施。而微生物菌劑作為一種高效、環(huán)保的生物肥料，其抗逆促生作用已得到認(rèn)可，其抗逆作用方面也有一定研究。
[0006]復(fù)合微生物菌劑由兩種或兩種以上且互不拮抗的微生物菌種按合適比例共同培養(yǎng)，充分發(fā)揮群體的聯(lián)合作用優(yōu)勢(shì)，取得較佳應(yīng)用效果的一種微生物制劑，此類菌劑一般具有有種類全、配伍合理、見(jiàn)效快、投資少、操作簡(jiǎn)單、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等各個(gè)領(lǐng)域。
[0007] 施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及草坪養(yǎng)護(hù)管理中很重要的措施之一。在目前大部分選用的是無(wú)機(jī)肥。無(wú)機(jī)肥雖然能夠及時(shí)補(bǔ)充土壤養(yǎng)分，但是大量使用卻能對(duì)地表水、地下水以及空氣造成污染，對(duì)環(huán)境構(gòu)成威脅。施加微生物肥料是在較低的生態(tài)影響條件下維持較高產(chǎn)量的更加和諧的一種施肥方式.比如最經(jīng)典的菌根真菌、根瘤菌、根際促生細(xì)菌等。它的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在:1.創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境。2.提高土壤以及空氣造成污染的供肥能力3.對(duì)環(huán)境資源的有效利用。4.降低作物對(duì)化肥的依賴。5.抑制病蟲害的發(fā)生。其原因一是有益細(xì)菌的大量繁殖大植物根隙區(qū)域形成優(yōu)勢(shì)種群，抑制了病原微生物生長(zhǎng)繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，參與植物的防御反應(yīng)，提高植物的抗病蟲害能力。6.減少農(nóng)藥污染等具有重要作用。同時(shí)，以城鄉(xiāng)有機(jī)廢棄物為基質(zhì)，采用現(xiàn)代化的工業(yè)技術(shù)，制造成具有多種功能(如固氮、解磷、活鉀等)再生型復(fù)合生物肥料，將對(duì)資源的循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益一體化同樣具有重要意義。
[0008]自20世紀(jì)70年代以來(lái)，歐美日本等國(guó)家或地區(qū)都相繼研制成功了一些復(fù)合菌劑，很多已經(jīng)開始進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，并形成了系列化的產(chǎn)品，主要用于處理生活污水，工農(nóng)業(yè)廢水以及其他一些化合物污染的治理。我國(guó)國(guó)內(nèi)微生物發(fā)展?fàn)顩r經(jīng)歷了從50年代到90年代，從理論到實(shí)踐，從單一菌種的利用到多個(gè)的混合應(yīng)用，產(chǎn)品也從根瘤菌劑發(fā)展到復(fù)合微生物菌劑，相繼取得了一些成果。
[0009]目前多數(shù)研究已表明，微生物制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，且無(wú)毒、無(wú)公害、無(wú)污染，能持久均衡地供給農(nóng)作物氮磷鉀元素的，被廣泛開發(fā)用作生物肥料。目前研發(fā)的生物菌肥的熱點(diǎn)產(chǎn)品主要包括:有機(jī)物料腐熟菌劑(也稱發(fā)酵菌劑)、土壤修復(fù)菌劑、根瘤菌劑和溶磷菌劑、煙草等經(jīng)濟(jì)作物專用的功能菌劑、生物有機(jī)肥、抗旱菌劑等。美國(guó)哥斯達(dá)黎加大學(xué)應(yīng)用EM技術(shù)來(lái)種植香蕉，有效減小了香蕉葉斑病的發(fā)生和線蟲類的侵襲，大大提高了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生產(chǎn)效率。
[0010]另外，復(fù)合微生物菌劑在畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有很明顯的作用。復(fù)合微生物菌劑能防病抗病，提高成活率，提高生產(chǎn)性能，降低飼養(yǎng)成本，增加經(jīng)濟(jì)效，改善產(chǎn)品品質(zhì)，生產(chǎn)綠色食品。倪永珍等對(duì)雞進(jìn)行400d的EM飼喂結(jié)果表明，與對(duì)照組比較雞的死亡率平均下降了 35.5%。據(jù)石專林報(bào)道，在飼糧中添加5%的EM發(fā)酵飼料，可使肉仔雞增重提高10.3%，料肉比下降7.8%。劉華周等試驗(yàn)也表明，蛋雞日糧中EM發(fā)酵飼料占20%時(shí)，蛋殼厚度增加6.99%，蛋白哈氏單位提高10.31%，蛋黃顏色提高1.5羅氏級(jí)。
[0011]目前，給草坪草施加微生物菌劑已有報(bào)道。真菌可以改良高羊茅、黑麥草等草坪植物的抗逆作用，提高了其抗寒性、抗旱性、抗水分脅迫以及抵抗生物危害的影響。有研究發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌可使多年生黑麥草根系受到侵染，并可明顯增加多年生黑麥草葉片中葉綠素含量，VA菌根可促進(jìn)黑麥草對(duì)P、F e、Cu、M g、K、B、S 1、S和N等礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，但卻使黑麥草組織中M η的濃度降低。還研究表明，在干旱的條件下，叢枝菌根的侵染、菌絲的發(fā)育均良好，接種從枝菌根后，增強(qiáng)了白三葉草的抗旱能力。有也對(duì)五種押寶桿菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)施加過(guò)微生物菌劑的黑麥草與沒(méi)有施加菌劑的對(duì)照相比，其株高、干重、葉綠素含量、根系體積和總表面積、根系活力等都顯著升高。
[0012]城市污泥是城市污水處理廠在各級(jí)污水處理凈化后所產(chǎn)生的含水量75%_99%的固體或者流體狀物質(zhì)。它包括污水中的泥砂、纖維、動(dòng)植物殘?bào)w等固體顆粒及其凝結(jié)的絮狀物，各種膠體、有機(jī)物及吸附的金屬元素、微生物、病菌、蟲卵、雜草種子等綜合固體物質(zhì)。城市污泥中出現(xiàn)的微生物主要由細(xì)菌、放線菌、真菌以及原生動(dòng)物和后生動(dòng)物等，其中細(xì)菌是最主要成分，細(xì)菌主要有菌膠團(tuán)細(xì)菌和絲狀菌，數(shù)量可占污泥中微生物總量的90%-95%左右。
[0013]20世紀(jì)80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法為主。該方法從活性污泥中發(fā)現(xiàn)的主要優(yōu)勢(shì)菌群有:動(dòng)膠桿菌屬、叢毛單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、螺菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、短桿菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬等。但是后來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，在活性污泥中經(jīng)典純培養(yǎng)方法能夠培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量只占活性污泥微生物總數(shù)的1%~15%。
[0014]20世紀(jì)80年代后期，隨著以16 S r RNA為主要基石的細(xì)菌分子分類學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、克隆庫(kù)技術(shù)、熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)逐漸成為研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的復(fù)雜性和多樣性也以驚人的速度被人們認(rèn)識(shí)，大量傳統(tǒng)檢測(cè)方法未能發(fā)現(xiàn)卻在活性污泥中起關(guān)鍵作用的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如具有除磷作用的類紅環(huán)菌、小月菌、類Tetr asphaera的棒狀菌、俊片菌等；具有脫氮作用的反硝化生絲微菌屬、固氮弧菌屬相關(guān)菌、類硝化螺菌等；與污泥泡沫有關(guān)的諾卡氏菌形放線菌、絲狀菌和等。[0015]近期的相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)際生產(chǎn)表明:微生物菌劑在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)就還能夠明顯提高植物的抗病、抗旱能力，降低土壤PH和含鹽量，提高植物的抗凍能力。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報(bào)道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤或垃圾堆肥中提取。有關(guān)污泥內(nèi)部微生物菌種之間共生及相互影響關(guān)系，以及污泥微生物菌劑應(yīng)用對(duì)植物生長(zhǎng)和生理特性的影響方面的研究較少；而在草坪植物抗旱中的應(yīng)用則更是尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0016]城市污泥含有豐富的微生物種類，雖然有些是條件致病菌，但是也含有很多對(duì)植物有益菌種。例如假單胞菌的生防促生作用應(yīng)經(jīng)得到公認(rèn)，這方面的研究報(bào)道也很多。固氮弧菌屬有著高效的固氮作用，他能夠侵入水稻、小麥和高粱根內(nèi)，并提高了幼苗含氮量。并且污泥為微生物提供了一個(gè)天然的馴化場(chǎng)所，其微生物具有潛在利用價(jià)值。因此篩選污泥中微生物種，群篩選出合適的有益微生物菌株，配制成復(fù)合微生物菌劑，研究其對(duì)植物的促生作用已經(jīng)植物在干旱、鹽堿或寒冷等逆境條件下的影響是完全可行的。
[0017]基于以上考慮，本技術(shù)的主要開展工作是:通過(guò)提取和鑒定城市污泥中的微生物，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成不同的復(fù)合微生物菌劑，探索各污泥微生物菌劑對(duì)草坪植物生理生態(tài)的影響，篩選和復(fù)配出適合草坪植物生長(zhǎng)和抵抗逆境的污泥復(fù)合微生物菌劑，為以后在此基礎(chǔ)上增加其他功能菌株，制備更復(fù)雜的高效復(fù)合菌劑提供基礎(chǔ)。
[0018]綜上所述，由于城市污泥的含有豐富的有機(jī)質(zhì)和大量的植物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)污泥的園林綠地資源化利用已得到廣泛報(bào)道。但對(duì)城市污泥利用于園林綠地的研究多集中于污泥經(jīng)過(guò)各種處理后形成植物的生長(zhǎng)基質(zhì)，而對(duì)污泥微生物的利用則很少見(jiàn)。提取和鑒定城市污泥中微生物菌種，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成不同濃度的復(fù)合微生物菌劑接種到草坪建植體系中。通過(guò)研究污泥復(fù)合微生物菌劑對(duì)高羊茅生理生態(tài)特性以及逆環(huán)境下生長(zhǎng)的影響，為篩選優(yōu)良堆肥復(fù)合微生物菌劑，提高草坪植物生長(zhǎng)活性和抗旱性提供依據(jù)。同時(shí)為污泥資源有效化利用提供一條新的思路。
[0019]干旱脅迫是植物逆境最普遍的形式，在許多地區(qū)是農(nóng)林牧業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱地區(qū)占地球陸地面積的1/3，我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)約占國(guó)土面積的1/2，在這些地區(qū)建植草坪都會(huì)因干旱脅迫而使生長(zhǎng)受礙，即使是降水多的地區(qū)也普遍存在季節(jié)性和非周期性干旱問(wèn)題，因此干旱脅迫是限制草坪草生長(zhǎng)的最主要環(huán)境因子之一。針對(duì)干旱問(wèn)題，目前研究集中于選取抗旱性強(qiáng)的草坪植物、節(jié)水灌溉方式以及覆蓋保水、應(yīng)用保水劑等方面，亦有研究者利用氮磷鉀肥來(lái)提高草坪草抗旱性。
[0020]有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的光合菌能夠緩解干旱引起的歐李細(xì)胞膜丙二醛的增加，保護(hù)幼苗膜系統(tǒng)。人們發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、巨大芽胞桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可提高玉米種子在干旱脅迫條件下的出苗率，促進(jìn)幼苗及其根系的生長(zhǎng)，增強(qiáng)幼苗抗旱能力。在干旱脅迫條件下，接種印度梨形孢真菌能夠維持花生正常生長(zhǎng)，使得花生從植株外部形態(tài)上表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。但是目前關(guān)于假單胞菌，木霉及鏈霉菌的復(fù)合微生物菌劑的抗旱方面的研究還很少，其應(yīng)用于草坪植物抗旱性的技術(shù)更是尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0021]本發(fā)明基于前期接種施氏假單胞菌，里氏木霉及灰黃鏈霉菌的復(fù)合微生物菌劑對(duì)草坪植物生理生態(tài)影響研究的基礎(chǔ)上，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成不同濃度的復(fù)合微生物菌劑接種到草坪建植體系中，進(jìn)一步研究在水分脅迫條件下，復(fù)合微生物菌劑對(duì)栽培基質(zhì)的保水性能及對(duì)高羊茅生理特性的影響，目的是為篩選優(yōu)良抗旱污泥復(fù)合微生物菌劑，提高草坪植物抗旱性，促進(jìn)干旱環(huán)境草坪植物的建植提供技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明的目 的在于提供一種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法。本研究結(jié)果表明，污泥復(fù)合微生物菌劑能與草坪植物形成良好的共生關(guān)系。復(fù)合微生物菌劑可能通過(guò)促進(jìn)宿主植物根系對(duì)土壤水分吸收的直接作用和改善植物體內(nèi)生理代謝活動(dòng)、提高保護(hù)酶活性的間接作用來(lái)增強(qiáng)植株的抗旱性，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:
一種風(fēng)干污泥菌劑，其特征在于它是由下述成分組成:
施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液；
其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:13菌種的菌落數(shù)在(2.15±0.03) XlO9Ail~(2.07±0.07) X 109/ml之間，假單胞菌的0D600 nm 值為 0.592。
[0023]優(yōu)選的原料為:施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(1)材料的選擇:
選取挑選籽粒飽滿、均勻一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)種子為試驗(yàn)材料；供試土壤為普通園土，pH 7.44，飽和含水量0.58 ml/g，有機(jī)質(zhì)4.68%，全氮0.21%，有效磷 22.03 mg/kg,全鉀 45.61g/kg ；
(2)制備方法
復(fù)合微生物菌劑制備:選取施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線；選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，按照下面要求配制復(fù)合微生物菌劑；
施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液；
其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1
(3)試驗(yàn)方法:
試驗(yàn)米取室內(nèi)盆栽的方法，選取直徑75 cm,高8 cm的一次性水杯為草坪植物培植容器，裝入基質(zhì)土壤180 g，其最大持水量為43.54% ;本試驗(yàn)采用重度干旱脅迫，脅迫程度為30-40%田間最大持水量(MFC)，將0.4 g草坪種子播種其上，每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致，待植物生長(zhǎng)到10d后，以澆灌的形式加入上述不同處理的微生物菌劑15ml，接種菌劑3天后，再進(jìn)行干旱脅迫，采用稱重澆水，按照脅迫程度進(jìn)行定量給水，處理30天后進(jìn)行植物各指標(biāo)的測(cè)定。養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)室的平均溫度為22~30°C;平均濕度為52.3 %。光照為自然光，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定;
所述的不同處理的微生物菌劑為:
施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液；
其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1本發(fā)明同時(shí)也公開了污泥復(fù)合微生物菌劑在增強(qiáng)植株的抗旱性促進(jìn)植株生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。特別是在提高植物吸水吸肥能力緩解干旱壓力以及在提高植株節(jié)水率方面的應(yīng)用；其中所述的復(fù)合微生物菌劑為假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌的200倍稀釋液。
[0025]本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下:
I研制材料與方法
1.1研制材料
(I)草種與土壤
選取挑選籽粒飽滿、均勻一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)種子為試驗(yàn)材料。供試土壤為天津師范大學(xué)校內(nèi)園土，pH 7.44，飽和含水量0.58 ml/g，有機(jī)質(zhì)4.68%，全氮 0.21%，有效磷 22.03 mg/kg，全鉀 45.6 lg/kg0
[0026](2)菌株的培養(yǎng)
稱取新鮮污泥，采用稀釋分離法制備10_3、10_4、10_5、10_6的污泥懸浮液。根據(jù)所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液(真菌取10_3、10_4，放線菌取10_4、10_5，細(xì)菌取10_5、10_6)，搖勻后吸取0.2 mL加入到預(yù)先制好的平板中。真菌用馬丁氏瓊脂平板；放線菌用高氏一號(hào)瓊脂平板；細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨平板。用滅菌的涂布器涂抹均勻，每處理重復(fù)3次，28°C培養(yǎng)。根據(jù)平板內(nèi)菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長(zhǎng)速度等特點(diǎn)，從每個(gè)樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化。依據(jù)菌落培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征對(duì)菌株進(jìn)行歸類并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。確定優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)行編號(hào)保存，待進(jìn)一步鑒定。
[0027](3)菌種的鑒定
鏡檢:細(xì)菌的鑒定采用革蘭氏染色法，放線菌采用印片法，絲狀真菌直接鏡下觀察。
[0028]PCR鑒定:直接挑取單菌體溶于100 UL高純水中，沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來(lái)，直接作為PCR反應(yīng)的模版。細(xì)菌和放線菌采用通用引物27f (5’ 一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3，)和 1492R(5’一GGTTACCTTGTTACGACTT — 3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 16SrRNA基因。真菌采用真菌核糖體18S rDNA的通用引物ITSl (5，一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC 一3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序如下:940C 2 min,94°C I min,57°C I min,72°C I min，25 個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的16S rDNA和18S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。
[0029](4)菌劑的配制
選取對(duì)植物生長(zhǎng)有利的細(xì)菌、真菌、放線菌各I種，分別為假單胞菌、木霉和鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，配制成菌劑。
[0030]1.2研 制方法
復(fù)合微生物菌劑制備:選取對(duì)植物生長(zhǎng)有利的細(xì)菌、真菌、放線菌各I種，分別為施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制微生物的生長(zhǎng)曲線。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，按照下面要求配制復(fù)合微生物菌劑。
[0031]1.3技術(shù)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)米取室內(nèi)盆栽的方法，選取直徑75 cm,高8 cm的一次性水杯為草坪植物培植容器。裝入基質(zhì)土壤180 g，其最大持水量為43.54%。試驗(yàn)共設(shè)11個(gè)處理，分別是處理I為對(duì)照，不接種菌劑(CK);處理2加入施氏假單胞菌+里氏木霉原菌液(CM1);處理3加入施氏假單胞菌+里氏木霉100倍稀釋液的菌劑(CM2);處理4加入施氏假單胞菌+里氏木霉200倍稀釋液的菌劑(CM3);處理5加入施氏假單胞菌+里氏木霉300倍稀釋液菌劑(CM4);處理6加入施氏假單胞菌+里氏木霉400倍稀釋液菌劑(CM5),處理7加入施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌原菌液(CD1);處理8加入假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌100倍稀釋液的菌劑(⑶2);處理9加入假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌200倍稀釋液的菌劑(⑶3);處理10加入假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌300倍稀釋液菌劑(⑶4);處理11加入假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌400倍稀釋液菌劑(⑶5)。各處理菌液按體積比為1:1和1:1:1的比例混合后用無(wú)菌水稀釋，以上各處理分別為15ml，每個(gè)處理3次重復(fù)。本試驗(yàn)采用重度干旱脅迫，脅迫程度為30-40%田間最大持水量(MFC)。將0.4 g草坪種子播種其上。每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致。待植物生長(zhǎng)到10 d后，以澆灌的形式加入上述不同處理的微生物菌劑15ml，接種菌劑3天后，再進(jìn)行干旱脅迫，采用稱重澆水，按照脅迫程度進(jìn)行定量給水，處理30天后進(jìn)行植物各指標(biāo)的測(cè)定。養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)室的平均溫度為22~30°C ;平均濕度為52.3 %。光照為自然光。
[0032]1.4測(cè)定指標(biāo)
1.4.1葉綠素含量的測(cè)定:
葉綠素含量的測(cè)定:取0.1 g葉片，剪成1-2 mm碎片，浸泡于丙酮:乙醇(V:V=1:1)溶液中24小時(shí),浸泡液為待測(cè)液。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)633 nm和645 nm下測(cè)量吸光值,并根據(jù)公式計(jì)算葉綠素含量；計(jì)算公式結(jié)果計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種風(fēng)干污泥菌劑，其特征在于它是由下述成分組成: 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液； 其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1 ; 3菌種的菌落數(shù)在(2.15±0.03) XlO9Ail~(2.07±0.07) X 109/ml之間，假單胞菌的0D600 nm 值為 0.592。
2.權(quán)利要求1所述的風(fēng)干污泥菌劑，其中所述的原料為:施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液。
3.一種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: (1)材料的選擇: 選取挑選籽粒飽滿、均勻一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)種子為試驗(yàn)材料； (2)制備方法 復(fù)合微生物菌劑制備:選取施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線；選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，按照下面要求配制復(fù)合微生物菌劑； 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液； 其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1 ; (3)試驗(yàn)方法: 試驗(yàn)米取室內(nèi)盆栽的方法，選取直徑75 cm,高8 cm的一次性水杯為草坪植物培植容器，裝入基質(zhì)土壤180 g，其最大持水量為43.54% ;本試驗(yàn)采用重度干旱脅迫，脅迫程度為30-40%田間最大持水量，將0.4 g草坪種子播種其上，每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致，待植物生長(zhǎng)到10 d后，以澆灌的形式加入上述不同處理的微生物菌劑15ml，接種菌劑3天后，再進(jìn)行干旱脅迫，采用稱重澆水，按照脅迫程度進(jìn)行定量給水，處理30天后進(jìn)行植物各指標(biāo)的測(cè)定，養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)室的平均溫度為22~30°C ;平均濕度為52.3 %，光照為自然光，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定；所述的不同處理的微生物菌劑為: 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液； 其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1。
4.污泥復(fù)合微生物菌劑在增強(qiáng)植株的抗旱性促進(jìn)植株生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。
5.污泥復(fù)合微生物菌劑在提高植物吸水吸肥能力緩解干旱壓力方面的應(yīng)用。
6.污泥復(fù)合微生物菌劑在提高植株節(jié)水率方面的應(yīng)用；其中所述的復(fù)合微生物菌劑為假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌的200倍稀釋液。
【文檔編號(hào)】A01N63/04GK103947683SQ201410191130
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】多立安, 趙樹蘭, 王志旭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)