一種利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法。本方法中，3個緊密連鎖的基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)入雌性不育水稻。這3個表達(dá)盒是：1）水稻雌性可育基因表達(dá)盒；2）花粉致死基因表達(dá)盒；3）熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒。雜合轉(zhuǎn)基因水稻在自交結(jié)實(shí)過程中，攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒敗育而不能參與受精；而沒有攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒能與雌配子正常受精而結(jié)實(shí)。通過光電分選，獲得純合的雌性不育水稻用于雜交稻機(jī)械化制種；而攜帶轉(zhuǎn)基因的雜合種子，繼續(xù)用于雌性不育水稻的繁殖。這一技術(shù)解決了雌性不育水稻繁殖難題，實(shí)現(xiàn)了雜交稻機(jī)械化制種，特別是混播混收方式的機(jī)械化制種。
【專利說明】一種利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國雜交水稻的年種植面積約1600萬hm2，種子生產(chǎn)面積約需15萬hm2，每年需商品雜交種2.4億kg左右。我國現(xiàn)行雜交水稻制種技術(shù)，自播種至收獲主要依靠人工操作。父母本分期播種，多為先播父本，后播母本；父母本箱式分開栽插，母本多行，父本雙行；收獲時父母本分開收割，或者授粉后成熟前割掉父本。整個制種過程工序繁雜，難以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化，需要足夠的勞動力做保證，只適宜在勞動密集型的農(nóng)村推廣應(yīng)用，大型農(nóng)場因缺少足夠的勞動力而不能制種。而且，由于父本的因素，減少了制種產(chǎn)量。隨著城鎮(zhèn)化、工業(yè)化、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化和農(nóng)村土地流轉(zhuǎn)政策的逐步實(shí)施，農(nóng)村人口將進(jìn)一步減少，現(xiàn)行勞動密集型、精耕細(xì)作型的制種技術(shù)已阻礙了雜交水稻種子生產(chǎn)的發(fā)展。因此，雜交水稻機(jī)械化制種技術(shù)研究迫在眉睫。
[0003]已有不少研究者作了各種嘗試開展雜交稻機(jī)械化制種。有研究者提出用谷殼顏色區(qū)別水稻不育系和恢復(fù)系種子，具體做法是將正常谷殼色的水稻不育系種子與非正常谷殼色的水稻恢復(fù)系種子機(jī)械混播，成熟后經(jīng)機(jī)械混收，再用色選機(jī)分選，獲得雜交種；有研究者提出用飛機(jī)將花粉噴施在母本田塊里進(jìn)行制種；也有研究者提出利用父、母本粒型的較大懸殊，用粒選機(jī)分選；還有研究者提出用半機(jī)械化操作的方法，即直播母本，人工栽插和收割父本，最后機(jī)械收割母本等方法；還有研究者利用水稻對除草劑苯達(dá)松的敏感特性進(jìn)行雜交水稻機(jī)械化制種。然而上述多種方法均存在諸多缺陷而不能從根本上實(shí)現(xiàn)雜交水稻機(jī)械化制種，目前在生產(chǎn)上也未見大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0006]所述利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法，包括如下步驟:
[0007](I)將水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和熒光篩選標(biāo)記基因插入水稻表達(dá)載體；
[0008](2)將步驟(1)所制備的水稻表達(dá)載體導(dǎo)入雌性不育水稻，得到雜合的轉(zhuǎn)基因水稻;
[0009](3)將步驟(2)所獲得的雜合的轉(zhuǎn)基因水稻或者利用步驟(2)所獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)育而成的雜合轉(zhuǎn)基因，進(jìn)行自交，通過光電分選法對自交后得到的種子進(jìn)行分選，篩選出不具有紅色熒光的種子，即為純合的雌性不育水稻種子，將該純合的雌性不育水稻種子用于雜交稻機(jī)械化制種；篩選出的具紅色熒光的種子即為轉(zhuǎn)基因種子，將該轉(zhuǎn)基因種子繼續(xù)用于雌性不育水稻的繁殖，即，繼續(xù)進(jìn)行雜合不育系自交，然后按前述步驟進(jìn)行光電分選，選出純合的雌性不育水稻種子，如此循環(huán)。
[0010]其中，步驟(1)所述水稻雌性可育基因?yàn)橐吧蚉TBl基因或雌性不育水稻SfSl的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ IDN0.1 ;所示野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]步驟(2)所述雌性不育水稻包括雌性不育水稻SfSl (該不育系已被申請?zhí)枮?01210096970.7的發(fā)明專利公開)，攜帶雌性不育基因PTBl (野生型PTBl基因已被申請?zhí)枮?01010194553.7的發(fā)明專利公開，所述雌性不育基因PTBl即為野生型PTBl基因發(fā)生任何缺失、插入、替換等修飾后產(chǎn)生的不育基因)的雌性不育水稻；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]所述花粉致死基因?yàn)閆M-AAl，其序列如SEQ ID N0.5所示；所述花粉致死基因由花粉發(fā)育后期特異性啟動子PG47驅(qū)動，其序列如SEQ ID N0.3所示；所述熒光篩選標(biāo)記基因?yàn)镽P，其序列如SEQ ID N0.8所示；所述突光篩選標(biāo)記基由愈傷組織/種皮特異性啟動子END2驅(qū)動，其序列如SEQ ID N0.7所示。所述水稻表達(dá)載體為pCAMBIA1300。
[0013]雌性不育水稻的繁殖和雜交稻機(jī)械化制種中利用了包含3個表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)育所獲得的水稻材料。 [0014]下面結(jié)合原理，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0015]本發(fā)明首先構(gòu)建了攜帶水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標(biāo)記基因3個緊密連鎖的基因表達(dá)盒的水稻表達(dá)載體。利用水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入雌性不育水稻。
[0016]本發(fā)明實(shí)質(zhì)上提供了一種雌性不育水稻繁殖技術(shù)，以及利用這一技術(shù)機(jī)械化生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因雜交稻種子的方法。將水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標(biāo)記基因3個緊密連鎖的基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)入雌性不育水稻。攜帶轉(zhuǎn)基因的雜合單株在自交結(jié)實(shí)過程中，攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒敗育而不能參與受精；而沒有攜帶轉(zhuǎn)基因的花粉粒能與雌配子正常受精而結(jié)實(shí)。通過光電分選，獲得純合的雌性不育水稻用于雜交稻機(jī)械化制種，因?yàn)楦副?恢復(fù)系)為雌性不育系，因此制種時可以混播混收。父母本按照一定的比例均勻混合，一次播種，能夠像常規(guī)水稻那樣進(jìn)行育秧和大田栽培管理，可以直播、拋秧、機(jī)插等，大大簡化栽插工序。成熟后進(jìn)行機(jī)械化收割；而攜帶轉(zhuǎn)基因的雜合種子，繼續(xù)用于雌性不育水稻的繁殖。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0018]本發(fā)明方法解決了雌性不育水稻繁殖技術(shù)難題，實(shí)現(xiàn)了雜交稻種子生產(chǎn)的混播混收；這一方法利用了轉(zhuǎn)基因技術(shù)，但生產(chǎn)的是非轉(zhuǎn)基因雜交稻種子。繁殖時，雌性不育水稻雖為轉(zhuǎn)基因水稻，但面積不大，易于隔離。制種時，可以箱式播插，也可以混播，父母本都不含有轉(zhuǎn)基因成分，不會造成轉(zhuǎn)基因的擴(kuò)散漂移，有利于生物安全；收獲時，可以混收，雜交種子也不含有轉(zhuǎn)基因成分。這一混播混收的雜交水稻種子生產(chǎn)技術(shù)，可以減少制種操作程序，便于進(jìn)行機(jī)械化操作，減輕勞動強(qiáng)度，降低種子生產(chǎn)成本，整體提高水稻種業(yè)的效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是實(shí)施例1中攜帶水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標(biāo)記基因3個基因表達(dá)盒的水稻表達(dá)載體圖譜；
[0020]圖2是實(shí)施例2中經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后表達(dá)紅色熒光蛋白的水稻愈傷圖；
[0021]圖3是實(shí)施例2中經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后獲得水稻轉(zhuǎn)基因植株圖；
[0022]圖4是實(shí)施例3中部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測圖(M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；+:正/陽性對照；一:負(fù)/陰性對照);
[0023]圖5是實(shí)施例3中部分轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測圖(一:陰性對照；+:以質(zhì)粒作為陽性對照);
[0024]圖6是實(shí)施例4中I2-KI轉(zhuǎn)基因植株花粉粒圖；
[0025]圖7是實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因植株穗部性狀圖；
[0026]圖8是實(shí)施例5中小規(guī)模制種現(xiàn)場圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不因此限制本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1:攜帶水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標(biāo)記基因3個基因表達(dá)盒的水稻表達(dá)載體構(gòu)建
[0029]在表達(dá)載體pCAMBIA1300上，插入3個表達(dá)盒:野生型PTBl表達(dá)盒、花粉致死的淀粉酶基因ZM-AAl表達(dá)盒、熒光篩選標(biāo)記基因RP表達(dá)盒。野生型PTBl攜帶有自身的啟動子和終止子(其核苷酸序列見SEQ ID N0.2);淀粉酶基因ZM-AAl表達(dá)盒元件包括:玉米的花粉發(fā)育后期特異性啟動子PG47 (其核苷酸序列見SEQ ID N0.3)、玉米的轉(zhuǎn)運(yùn)肽ZM-BTl (其核苷酸序列見SEQ ID N0.4)、玉米的淀粉酶基因編碼序列ZM-AAl (其核苷酸序列見SEQ IDN0.5)、玉米的終止子IN2-1 (其核苷酸序列見SEQ ID N0.6);紅色熒光蛋白基因RP表達(dá)盒元件包括:玉米的種子特異性啟動子END2 (其核苷酸序列見SEQ ID N0.7)、載體pLJ02上的RP編碼序列(其核苷酸序列見SEQ ID N0.8)、馬鈴薯的終止子PIN II (其核苷酸序列見SEQ ID N0.9)。完整的構(gòu)建載體圖譜見附圖1。
[0030]所構(gòu)建載體質(zhì)導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。導(dǎo)入方法米用電擊轉(zhuǎn)化方法，主要參考bio-rad公司的電擊儀使用說明書進(jìn)行，具體步驟如下:
[0031](I)將儲存于_80°C的DHlOB感受態(tài)細(xì)胞取出放在冰上凍融，Imm電激杯放在冰上預(yù)冷，把凍存的SOC放置在37°C解凍。
[0032](2)將干凈的EP離心管插在冰上預(yù)冷，一般EP離心管的數(shù)目比要轉(zhuǎn)化的樣品多兩個，一個用來做陰性對照(沒有加入DNA)、另一個做陽性對照(加入1μ I的IOng/μlpUC19)。
[0033](3)分別吸取1-2 μ I要轉(zhuǎn)化的DNA樣品放入預(yù)冷的EP離心管中，然后將融化的DHlOB感受態(tài)細(xì)胞20 μ I輕輕取出放入預(yù)冷的EP離心管底部，輕輕的將兩者混勻，盡量不要產(chǎn)生氣泡，離心管底部不要用手接觸，避免溫度變化對感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率造成影響，操作過程盡量的快。
[0034](4)設(shè)置轉(zhuǎn)化參數(shù)，1800ν, 25 μ F，200 Ω，lmm, BioRad電激儀一般有推薦的使用參數(shù)。
[0035](5 )輕輕吸取感受態(tài)和DNA混合物，放入電激杯中，輕敲使混合物均勻的分布于杯底，改上蓋子放入電激槽中，關(guān)上安全蓋，按下電激紅色按鈕，待電激完成后(一般會儀器會發(fā)出完成提示音)，將在37°C預(yù)熱好的SOC放入電激杯中，將混合物旋起，用吸頭將混合物轉(zhuǎn)入搖菌管中，于37°C恒溫?fù)u床,225rpm, Ihr0
[0036]實(shí)施例2:轉(zhuǎn)基因水稻獲得
[0037]2.1植物材料選擇
[0038]用于遺傳轉(zhuǎn)化的水稻(Oryza sativa L.)品種選擇為對應(yīng)的攜帶PTBl基因(SEQID N0.1)的水稻雌性不育系。
[0039]2.2水稻胚性愈傷組織的誘導(dǎo)[0040]取授粉后10-15d的未成熟水稻種子剝?nèi)シN皮，于70%酒精浸泡3min，再于0.1%升汞中浸泡15min (或再轉(zhuǎn)入20%的次氯酸鈉溶液中于搖床振蕩滅菌25min)，超凈工作臺中無菌水清洗3-5次，將消毒后種子的幼胚用鑷子擠出，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個皿約放35粒，28°C暗培養(yǎng)4 一 5d，切除胚根，繼續(xù)培養(yǎng)12-15d，待愈傷長大后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每兩周繼代一次，共繼代2-3次。
[0041]成熟胚去殼，經(jīng)上述方法消毒后，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。28°C暗培養(yǎng)至長出愈傷組織。選用培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)4天的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。(第三代開始可以選擇適當(dāng)?shù)呐咝杂鷤糜谵r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0042]2.3愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)
[0043]取生長旺盛的胚性愈傷組織(從繼代培養(yǎng)上挑選分散狀，顏色鮮黃的2 - 3mm的胚性愈傷顆粒)轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，27°C暗培養(yǎng)3~4天。生長旺盛的愈傷用于轉(zhuǎn)化。
[0044]2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化
[0045]農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。挑農(nóng)桿菌單菌落接種于含50mg/L YM培養(yǎng)基上,260C暗培養(yǎng)2~3天后，用一金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于AAM液體懸浮培養(yǎng)基中。調(diào)整菌落濃度至0.D.600為0.8~1.0，即可用于轉(zhuǎn)化。
[0046]愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)化的愈傷組織在被農(nóng)桿菌污染前均應(yīng)先在新鮮的繼代培養(yǎng)基頂上預(yù)培養(yǎng)3~4天。轉(zhuǎn)化時將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到一無菌的三角瓶中，然后倒入適量的農(nóng)桿菌懸浮液(至少保證有足夠的菌液與材料接觸)，室溫下放置10~20分鐘，并不時晃動。取出愈傷組織，在無菌紙上吸去多余的菌液，隨即將愈傷組織轉(zhuǎn)移到鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基CM上于260C暗培養(yǎng)2~3天。
[0047]2.5抗性愈傷的篩選
[0048]將愈傷轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷，每兩周轉(zhuǎn)接I次。培養(yǎng)4 一 8周，多數(shù)愈傷褐化死亡,有少數(shù)瘤狀抗性愈傷從干癟褐化的愈傷表面長出。挑選這些抗性愈傷繼續(xù)在選擇培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2次，挑選長大后愈傷的一部分轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上。
[0049]2.6抗性愈傷的分化培養(yǎng)
[0050]經(jīng)抗生素篩選長出的抗性愈傷，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，26°C~28°C，12h光照，12h黑暗條件下培養(yǎng)。
[0051]2.7轉(zhuǎn)基因植株的再生及幼苗移栽
[0052]轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上的愈傷組織，培養(yǎng)2周后愈傷開始轉(zhuǎn)綠，3周后即可長出幼芽，隨之根也長出。將幼苗轉(zhuǎn)移到含生根培養(yǎng)基的小三角瓶內(nèi)，每瓶一株，繼續(xù)光照培養(yǎng)，待苗高7~IOcm時，打開瓶蓋于溫室中煉苗5~7天，待小苗生長健壯后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈跟上的培養(yǎng)基，移至溫室盆栽(鐵盤中)。注意保濕，以提高移栽成活率。[0053]實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測
[0054]3.1DNA大規(guī)模抽提
[0055]T0代轉(zhuǎn)基因水稻DNA抽提采用CTAB法(Murry and Thompson, 1980)。稱取新鮮葉片2 — 4克，剪碎后放入一 20°C預(yù)冷的研缽中，用液氮磨成粉末，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的磨樣瓶中于一20°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛r加入預(yù)熱至100°C的10mll.5X CTAB，迅速攪勻，于56°C水浴保溫?fù)u床振蕩20分鐘，然后用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提。離心后，上清液再用1/10體積預(yù)熱至56°C的10% CTAB緩沖液及等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次，然后上清加入1% CTAB沉淀DNA，離心后加入添加有RNase A的lmol/L NaCl溶解DNA，于56°C過夜完全溶解酒精沉淀后，溶于適量TE中，用DNA微量測定儀(DNA Fluorometer)測定DNA濃度，平衡DNA濃度至250ng/ul，存于4°C備用。
[0056]3.2PCR 分析
[0057]對TO代轉(zhuǎn)基因水稻DNA進(jìn)行PCR檢測。以ZM-AAl基因作為模板設(shè)計引物。正向引物為:5’ -AAAAACGGAGACTTTGTGAGCCATT-3’ (SEQ ID N0.11)，反向引物為:5’-TCAACAAGTTTGGAATGAAGGATGC-3’ (SEQ ID N0.12)。擴(kuò)增產(chǎn)物片段為 1043bp。PCR 反應(yīng)體系:DNA30 — 90ng, IOx Buffer2.0ul, ImM dNTPl.8ul, 25mM MgCl2L 5ul, IOuM primer 兩種各0.5ul, Tag酶1.5U，然后加dd h20至20ul反應(yīng)體積。PCR循環(huán)條件-MV，變性3分鐘；94°C，I分鐘，550C，1.5分鐘，72°C，1.5分鐘，40個循環(huán)；72°C，延伸5分鐘。電泳檢測:用1.4%瓊脂糖凝膠電泳，照相記錄電泳結(jié)果。
[0058]附圖4為部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果，表明目的基因已整合進(jìn)入水稻基因組中。
[0059]3.3Southern 印跡分析
[0060]取水稻總DNA2.5ug，用限制性內(nèi)切酶XbaI37°C酶解20hr左右，經(jīng)電泳檢測酶切完全后，用0.6~0.8%瓊脂糖(Sigma公司生產(chǎn))凝膠電泳，經(jīng)12 — 16hr電泳后，凝膠用0.2NHCl變性10分鐘，用0.4N NaOH溶液將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜Hybond-N+上。轉(zhuǎn)移20小時，將尼龍膜用2X SSC漂洗2次，各5分鐘，膜晾干后于80 — 100°C真空烘烤3hr，取出冷卻后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0061]預(yù)雜交:先將尼龍膜用2X SSC漂洗，涼干后裝入雜交袋中，加入10 - 18ml (依膜的張數(shù)I 一 6張)預(yù)熱至65°C的雜交緩沖液。趕氣泡后，于65°C空氣搖床中預(yù)雜交6hr左右。
[0062]探針標(biāo)記:用隨機(jī)引物法按下列步驟進(jìn)行標(biāo)記。探針DNAlOOng，加入dd H2O至IOul, 100。。變性10分鐘，冰浴5分鐘冷卻后，加入dNTP(A+G+T)3ul，隨機(jī)引物緩沖液
5.0ul, Klenow Fragment 酶 2U，最后加入 a — 32P — dCTP10_40uCi (按雜交膜數(shù)量)，混勻后于25 C保溫3小時以上。
[0063]雜交:加600ul雜交液到標(biāo)記好的探針溶液中，打開管蓋，100°C變性10分鐘后，倒入雜交袋中，65 °C雜交6hr。
[0064]洗膜、壓片:雜交完畢后，將膜從雜交袋中取出，用洗膜液IX SSC、0.2%SDS室溫漂洗I次，然后再用預(yù)熱至65°c的洗膜液于65°C保溫?fù)u床中熱洗I 一 2次，每次15分鐘。涼干后用保鮮膜包膜，壓片后于一 20°C放射自顯影約4 一 7天。
[0065]探針DNA制備。探針DNA選自3.2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列見SEQ IDN0.10。[0066]附圖5為部分轉(zhuǎn)基因植株的Southern印跡分析。結(jié)果表明，目的基因已整合進(jìn)入水稻基因組中。
[0067]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因水稻植株的育性考察
[0068]對經(jīng)過分子鑒定的轉(zhuǎn)基因植株考察了花粉育性和結(jié)實(shí)情況。取開花時的花藥，經(jīng)常規(guī)的I2-KI染色后，觀察到部分花粉粒為黑染的可育花粉粒(見附圖6);與雌性不育對照比較，轉(zhuǎn)基因植株能正常結(jié)實(shí)(見附圖7)。
[0069]實(shí)施例5:水稻雌性不育系用于繁殖制種試驗(yàn)
[0070]水稻雌性不育系的繁殖。將攜帶雜合轉(zhuǎn)基因的水稻雌性不育系自交。自交種子通過對紅色熒光的光電分選，可以篩選出具有紅色熒光的種子，獲得純合的雌性不育水稻用于混播混收的雜交稻機(jī)械化制種；而攜帶轉(zhuǎn)基因的雜合種子，繼續(xù)用于雌性不育水稻的繁殖。
[0071]水稻雌性不育系應(yīng)用于雜交稻制種。因?yàn)楦副?恢復(fù)系)為雌性不育系，因此制種時可以箱式栽插，也可以混播混收。父母本按照一定的比例均勻混合，一次播種，能夠像常規(guī)水稻那樣進(jìn)行育秧和大田栽培管理，可以直播、拋秧、機(jī)插等。待成熟后進(jìn)行機(jī)械化收割，收獲的均為 雜交水稻種子。附圖7展示了小規(guī)模的制種現(xiàn)場。
【權(quán)利要求】
1.一種利用雌性不育的雜交稻機(jī)械化制種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)將水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和熒光篩選標(biāo)記基因插入水稻表達(dá)載體； (2)將步驟(1)所制備的水稻表達(dá)載體導(dǎo)入雌性不育水稻，得到雜合的轉(zhuǎn)基因水稻； (3)將雜合的轉(zhuǎn)基因水稻自交，通過光電分選法對自交后得到的種子進(jìn)行分選，篩選出不具有紅色熒光的種子，即為純合的雌性不育水稻種子，將該純合的雌性不育水稻種子用于箱式播插或者混播混收的雜交稻機(jī)械化制種；篩選出的具紅色熒光的種子即為轉(zhuǎn)基因種子，將該轉(zhuǎn)基因種子繼續(xù)用于雌性不育水稻的繁殖。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻雌性可育基因?yàn)橐吧蚉TBl基因或雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID N0.1 ;所示野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因?yàn)閆M-AA1，其序列如SEQID N0.5 所示。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因由花粉發(fā)育后期特異性啟動子PG47驅(qū)動，PG47序列如SEQ ID N0.3所示。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光篩選標(biāo)記基因包括紅色熒光蛋白基因RP，其序列如SEQ ID N0.8所示。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述熒光篩選標(biāo)記基由愈傷組織/種皮特異性啟動子END2驅(qū)動，END2序列如SEQ ID N0.7所示。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻表達(dá)載體為pCAMBIA1300。
【文檔編號】A01H1/02GK103834684SQ201410116096
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】曹孟良, 夏玉梅, 沈春修, 方真, 蔡立湘 申請人:湖南雜交水稻研究中心