轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法,由Tier-1毒性測定試驗，三級營養(yǎng)試驗，蛋白傳遞規(guī)律，捕食功能反應以及種群密度與種群動態(tài)比較5個部分組成。各部分分別評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對黑肩綠盲蝽的潛在毒性；評價轉Bt基因抗蟲水稻通過獵物介導對黑肩綠盲蝽的影響；評價黑肩綠盲蝽暴露于Bt蛋白的途徑和程度；評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽種群的影響。最終，根據(jù)5個方面的數(shù)據(jù)綜合評價所述轉基因作物的種植對該非靶標生物產生的生態(tài)后果。本發(fā)明建立了一套系統(tǒng)、科學的評價方法，對完善轉基因作物對非靶標生物的影響研究以及確定轉基因作物種植的生態(tài)安全性具有重要意義。
【專利說明】轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于轉基因作物生態(tài)風險評價【技術領域】，具體涉及一種轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有30多億人口以稻米為食。同時水稻又是蟲害最多的糧食作物之一，每年由于稻縱卷葉螟、鉆蛀性螟蟲等鱗翅目昆蟲的為害，造成重大的產量損失(Cheng，1996 ;Nathan，2006)。在生產實際中，鱗翅目害蟲的防治長期依賴于化學農藥，化學農藥的濫用不但增加了水稻的生產成本，而且污染環(huán)境，還容易使害蟲產生抗性，降低農藥的藥效(Su et al，2003)。因此，高抗鱗翅目的抗性品種是一種經濟、有效、環(huán)保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，難以找到高抗鱗翅目昆蟲的抗源。要培育高抗鱗翅目害蟲的水稻品種，需借助于外源抗蟲基因。Bacillus thuringiensis (Bt)殺蟲蛋白被用作生物源殺蟲劑已經有五十多年的歷史，對鱗翅目害蟲有穩(wěn)定的防治效果。目前是轉Bt基因抗蟲水稻是控制鱗翅目害蟲的主要抗蟲水稻。
[0003]然而，抗蟲轉基因植物的利用給人類帶來利益的同時，也存在一定潛在的生態(tài)風險。轉基因抗蟲植物的生態(tài)安全性評價集中在:對靶標害蟲的抗性治理、對非靶標生物和生物多樣性的影響、基因漂移問題和對土壤微生物的影響等。轉基因抗蟲植物對非靶標生物的潛在影響是有關轉基因作物環(huán)境風險評價的重要部分。目前，國際上的風險評價工作者以及轉基因植物相關管理部門廣泛采用“分層次評價體系”開展轉基因植物對非靶標生物影響方面的研究工作(Romeis et al., 2008 ;王圓圓等,2011)。該評價體系就是選擇合適的受試生物，然后依次開展從實驗室試驗到半田間試驗，再到田間試驗分層次分階段進行的系統(tǒng)評價。
[0004]褐飛風Nilaparvata lugens (StM>是溫帶和熱帶水稻田間最主要的害蟲之一，是轉Bt基因水稻種植過程中重要的非靶標植食性昆蟲。黑肩綠盲蝽是稻飛虱卵期與若蟲期重要的捕食性天敵，能明顯降低稻飛風的種群數(shù)量(Chen et al., 1992 ；Lou et al., 2013 ；Sigsgaard, 2007)，其通過捕食過程能夠攝取到Bt殺蟲蛋白，有存在生態(tài)風險的可能性，那么，建立一套系統(tǒng)評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽是否安全的方法尤為重要。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種安全有效、操作簡便、成本低廉的轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法。
[0006]本發(fā)明目的的實現(xiàn)方式為，轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法，包括如下5個部分:
[0007](1)Tier-1毒性測定試驗:評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物黑肩綠盲蝽的潛在毒性；
[0008]用人工飼育器飼養(yǎng)黑肩綠盲蝽，接入黑肩綠盲蝽試蟲，飼養(yǎng)時飼育器用黑布罩住，僅露出有飼料的端口，且朝光照方向，保持相對濕度達90%以上，再置于溫度28± I°C、光周期L:D=14:10h，濕度90 ±5%的智能人工氣候箱內培養(yǎng)；
[0009]用三種形式的全純人工飼料作為黑肩綠盲蝽的飼料即:全純人工飼料、含有轉基因水稻葉鞘組織表達的Bt蛋白濃度10倍以上及含有40 μ g/ml砷酸二氫鉀的全純人工飼料；用含有褐飛虱卵的稻苗將黑肩綠盲蝽飼養(yǎng)至2齡若蟲，單頭接入飼養(yǎng)裝置中，每個處理各接黑肩綠盲蝽若蟲36頭，每日更換飼料并觀察記錄黑肩綠盲蝽蛻皮及存活情況，直至羽化，新羽化成蟲在24小時內，2~3頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重；
[0010]試驗中通過ELISA和敏感昆蟲生測技術全程監(jiān)測殺蟲蛋白的濃度、穩(wěn)定性以及生物活性；
[0011]選擇黑肩綠盲蝽的若蟲發(fā)育歷期、若蟲存活率、雌性率以及初羽化體重作為評價參數(shù)指標，對其進行統(tǒng)計分析，以評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對黑肩綠盲蝽的毒性影響；
[0012](2)三級營養(yǎng)試驗:通過水稻一褐飛虱一黑肩綠盲蝽的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過獵物介導對黑肩綠盲蝽的安全性影響；
[0013]①以褐飛虱卵作為食物
[0014]向裝有6~7根15日齡稻苗的玻璃管中接入2頭已過產卵前期的褐飛虱雌成蟲，產卵2天，分別以不同水稻品種、系的產卵苗飼養(yǎng)黑肩綠盲蝽的若蟲至成蟲；每個玻璃管內接入孵化24h以內，來自非轉基因親本水稻的黑肩綠盲蝽若蟲I頭，每個品種、系各接黑肩綠盲蝽若蟲32頭，在黑肩 綠盲蝽的I~3齡若蟲期，每2天更換I次產卵苗，在4齡至成蟲期每天更換I次產卵苗；每天上午觀察記錄黑肩綠盲蝽若蟲的存活和蛻皮情況，直至若蟲羽化，新羽化成蟲24小時內，2~3頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重；
[0015]選擇黑肩綠盲蝽的若蟲發(fā)育歷期、若蟲存活率、雌性率以及初羽化體重作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價由褐飛虱卵介導的轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽的安全性影響；
[0016]②以褐飛虱若蟲作為食物
[0017]每日提供在不同水稻品種、系上孵化并取食24~48小時的褐飛虱若蟲作為食物飼喂黑肩綠盲蝽，具體操作如下:用含有褐飛虱卵的稻苗將黑肩綠盲蝽飼養(yǎng)至2齡若蟲，再喂以不同水稻品種、系的褐飛虱若蟲，2~3齡黑肩綠盲蝽若蟲期每日每頭提供10頭褐飛虱若蟲，4齡黑肩綠盲蝽到成蟲期每日每頭提供20頭褐飛虱若蟲，黑肩綠盲蝽若蟲單頭飼養(yǎng)于底部鋪有濕海棉保濕的指型管中，每個品種、系各接黑肩綠盲蝽若蟲80頭，每天上午觀察記錄黑肩綠盲蝽若蟲的存活和蛻皮情況，直至若蟲羽化，新羽化成蟲24小時內，3~5頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重；
[0018]選擇黑肩綠盲蝽的若蟲發(fā)育歷期、若蟲存活率、雌性率以及初羽化體重作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價由褐飛虱若蟲介導的轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽的安全性影響；
[0019](3)蛋白傳遞規(guī)律:通過ELISA檢測手段鑒定黑肩綠盲蝽暴露于Bt蛋白的途徑和程度；
[0020]于玻璃罐中分別放入15日齡不同水稻品種、系的稻苗，接入對應水稻材料飼養(yǎng)的20頭懷卵褐飛虱雌成蟲，產卵2天后接入3~4齡黑肩綠盲蝽，取食3天后，分別對水稻葉鞘，褐飛虱卵，黑肩綠盲蝽進行取樣，每個處理重復4~5次；
[0021]將不同水稻品種、系飼養(yǎng)孵化后24~48小時的褐飛風若蟲與3~4齡黑肩綠盲蝽同時接入含有對應稻苗的玻璃罐中，每日更換褐飛虱，取食3天后，分別對水稻葉鞘，褐飛虱若蟲以及黑肩綠盲蝽進行取樣，每個處理重量4~5次；
[0022]采用ELISA技術，分別對以上樣品中Bt蛋白的含量進行檢測，確定通過不同的食物鏈黑肩綠盲蝽暴露于Bt蛋白的程度；
[0023](4)捕食功能反應:通過比較轉Bt基因抗蟲水稻與非轉基因親本對照品種飼養(yǎng)的黑肩綠盲蝽捕食功能參數(shù)，評判轉Bt基因抗蟲水稻對該非靶標生物的影響；
[0024]黑肩綠盲蝽分別于不同水稻材料飼養(yǎng)一代，羽化后2天且已交配的雌蟲用于試驗，試驗前饑餓處理24小時，將黑肩綠盲蝽單頭放入底部鋪有海棉且含有稻苗的指形試管，I齡褐飛虱若蟲作為獵物；5個獵物密度處理，分別為10、20、30、40、50頭，每個密度處理重復5次，24小時后計錄被捕食的褐飛虱若蟲數(shù)；
[0025]選擇黑肩綠盲蝽的瞬時攻擊率和處理獵物時間作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽捕食功能反應的影響；
[0026](5)種群密度與種群動態(tài)比較:通過比較，轉Bt基因抗蟲水稻與非轉基因親本對照稻田黑肩綠盲蝽的發(fā)生動態(tài)，評價轉Bt基因抗蟲水稻的種植對該非靶標生物種群的影響；
[0027]采用對角線 取樣法，每小區(qū)面積為150m2，每次取5個樣，每樣0.25m2，約6叢稻株；水稻移栽后30天開始用吸蟲器取樣，至水稻收割前10天，共取樣5~7次；取樣立即用75%的酒精保存，在體視鏡下進行鑒定并計數(shù)，以統(tǒng)計黑肩綠盲蝽種群密度及種群動態(tài)，并對不同水稻稻田之間參數(shù)的差異性進行統(tǒng)計分析，評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽田間種群的安全性影響。
[0028]本發(fā)明通過Tier-1毒性測定試驗評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物黑肩綠盲蝽的潛在毒性；通過水稻一褐飛虱一黑肩綠盲蝽的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過獵物介導對黑肩綠盲蝽的影響；采用ELISA檢測手段鑒定黑肩綠盲蝽暴露于Bt蛋白的途徑和程度；通過對黑肩綠盲蝽捕食功能參數(shù)的比較，評價轉Bt基因抗蟲水稻對該非靶標生物捕食功能是否產生不利影響；通過比較轉Bt基因抗蟲水稻與非轉基因親本對照稻田黑肩綠盲蝽的發(fā)生動態(tài)，評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽種群的影響。最終，根據(jù)5個方面的研究數(shù)據(jù)綜合分析轉Bt基因抗蟲水稻的種植對該非靶標生物產生的生態(tài)后果。
[0029]本發(fā)明建立了一套系統(tǒng)、科學的評價方法，對完善轉Bt基因抗蟲水稻對非靶標生物的影響研究具有重要意義，對確定轉Bt基因抗蟲水稻種植的生態(tài)安全性具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為黑肩綠盲蝽人工飼育器結構示意圖，
[0031]圖2為取食純人工飼料以及加入Cry2Aa蛋白與PA人工飼料的黑肩綠盲蝽生存曲線圖，
[0032]圖3、4為T2A-1水稻葉鞘組織，褐飛虱卵及取食褐飛虱卵的黑肩綠盲蝽體內Cry2Aa蛋白含量圖，[0033]圖5、6為T2A-1水稻葉鞘組織，褐飛虱若蟲及取食褐飛虱若蟲的黑肩綠盲蝽體內Cry2Aa蛋白含量圖，
[0034]圖7、8為T2A-1、明恢63水稻材料飼養(yǎng)的黑肩綠盲蝽的功能反應圖，
[0035]圖9、10、11、12為吸蟲器法孝感2011年、2012年、2013年、隨州2011年采集的轉
基因水稻與對照水稻田黑肩綠盲蝽種群動態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0036]本發(fā)明的轉Bt基因抗蟲水稻選擇轉cry2Aa基因水稻T2A-1，其對鱗翅目害蟲有很高的抗性，非轉基因親本選擇對照明恢63水稻，水稻種子均由華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供。水稻于栽培盤(長X寬X高=25cmX20cmX3cm)中以Yoshida營養(yǎng)液培育至大約15cm高后用于評價試驗。稻苗培育條件為溫度(26±2°C)，相對濕度(80%)。
[0037]本發(fā)明的供試褐飛虱采自湖北武漢稻田，并在室內分別于T2A-1與明恢63的稻苗建立種群，飼養(yǎng)10代以上。黑肩綠盲蝽采自湖北孝感稻田，在室內用帶有褐飛虱卵的明恢63稻苗飼養(yǎng)6代以上用于試驗。飼養(yǎng)條件為溫度(28±1°C),相對濕度(70±5%),光暗比(L14h:D10h)。
[0038]本發(fā)明的評價方法由Tier-1毒性測定試驗，三級營養(yǎng)試驗，蛋白傳遞規(guī)律，捕食功能反應以及種群密度與種群動態(tài)比較5個關鍵部分組成。下面分別進行詳細說明。
[0039]UTier-1毒性測定試驗:評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物黑肩綠盲蝽的潛在毒性。
[0040]用人工飼育器飼養(yǎng)黑肩綠盲蝽，黑肩綠盲蝽人工飼育器為直徑X高=2cmX 12cm的雙通玻璃管2 (見圖1)，其一端為飼料室，飼料室由雙層Parafilm膜(3)中間包裹飼料而成。接入黑肩綠盲蝽試蟲后，用橡皮筋將質地細膩的尼龍紗布I扎于玻璃管另一端。飼養(yǎng)時飼育器用黑布罩住，僅露出有飼料的端口，且朝光照方向，保持相對濕度達90%以上，再置于溫度28±1°C，光周期L:D=14:10h，濕度90±5%的智能人工氣候箱內培養(yǎng)。
[0041]用三種形式的全純人工飼料作為黑肩綠盲蝽的飼料即:全純人工飼料(陰性對照)、含有300μ g/ml (>724&蛋白人工飼料、含有4(^8/1111 PA人工飼料(砷酸二氫鉀，陽性對照);用含有褐飛虱卵的稻苗將黑肩綠盲蝽飼養(yǎng)至2齡若蟲(因從I齡開始飼養(yǎng)，死亡率很高)，單頭接入飼養(yǎng)裝置中，每個處理各接黑肩綠盲蝽若蟲36頭，每日更換飼料并觀察記錄黑肩綠盲蝽蛻皮及存活情況，直至羽化，新羽化成蟲在24小時內，2~3頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重。
[0042]所述全純人工飼料為專利號99108791.7實施例2公布的飼料，所述氨基酸含有以下組分:半脫氨酸80 ;胱氨酸20 ;天冬酰胺230 ;谷酰胺240 ;精氨酸175 ;異亮氨酸100 ；谷氨酸250 ;絲氨酸400 ;組氨酸100 ;亮氨酸240 ;賴氨酸240 ;苯丙氨酸200 ;蘇氨酸130 ；酪氨酸10 ;繳氨酸300 ;蛋氨酸110 ; Y -氨基丁酸10 ;甘氨酸30 ;丙氨酸130 ;脯氨酸100 ；色氨酸105 ;天冬氨酸100。所述維生素含有以下組分:生物素0.025 ;泛酸鈣5.0 ;氯化膽堿50.0 ;葉酸1.0 ;肌醇50 ;煙酸15 ;煙酸嗶哆辛2.5 ;核黃素5.0 ;鹽酸硫胺素2.0 ;維生素 C100。所述無機鹽含有 以下組分:CaCl2.2H203.115 ；CuCl2.2H200.268 ；FeCl3.6H202.228 ；MnCl2.4H200.793 ；ZnCl20.396 ；MgCl2.6H20200 ;KH2P04500。所述蔗糖濃度9000。以上濃度單位為mg/100ml。[0043]取食三種食物的黑肩綠盲蝽生命表參數(shù)如表1所示，
[0044]表1
[0045]
【權利要求】
1.轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法，其特征在于包括如下5個部分: (1)Tier-1毒性測定試驗:評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對非靶標生物黑肩綠盲蝽的潛在毒性； 用人工飼育器飼養(yǎng)黑肩綠盲蝽，接入黑肩綠盲蝽試蟲，飼養(yǎng)時飼育器用黑布罩住，僅露出有飼料的端口，且朝光照方向，保持相對濕度達90%以上，再置于溫度28土 TC、光周期L:D=14:10h，濕度90 ±5%的智能人工氣候箱內培養(yǎng)； 用三種形式的全純人工飼料作為黑肩綠盲蝽的飼料即:全純人工飼料、含有轉基因水稻葉鞘組織表達的Bt蛋白濃度10倍以上及含有40 μ g/ml砷酸二氫鉀的全純人工飼料；用含有褐飛虱卵的稻苗將黑肩綠盲蝽飼養(yǎng)至2齡若蟲，單頭接入飼養(yǎng)裝置中，每個處理各接黑肩綠盲蝽若蟲36頭，每日更換飼料并觀察記錄黑肩綠盲蝽蛻皮及存活情況，直至羽化，新羽化成蟲在24小時內，2~3頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重； 試驗中通過ELISA和敏感昆蟲生測技術全程監(jiān)測殺蟲蛋白的濃度、穩(wěn)定性以及生物活性； 選擇黑肩綠盲蝽的若蟲發(fā)育歷期、若蟲存活率、雌性率以及初羽化體重作為評價參數(shù)指標，對其進行統(tǒng)計分析，以評價轉Bt基因抗蟲水稻表達的Bt蛋白對黑肩綠盲蝽的毒性影響； (2)三級營養(yǎng)試驗:通過水稻一褐飛風一黑肩綠盲蝽的食物鏈評價轉Bt基因抗蟲水稻通過獵物介導對黑肩綠盲蝽的安全性影響； ①以褐飛虱卵作為食物 向裝有6~7根15日齡稻苗的玻璃管中接入2頭已過產卵前期的褐飛虱雌成蟲，產卵2天，分別以不同水稻品種、系的產卵苗飼養(yǎng)黑肩綠盲蝽的若蟲至成蟲；每個玻璃管內接入孵化24h以內，來自非轉基因親本水稻的黑肩綠盲蝽若蟲I頭，每個品種、系各接黑肩綠盲蝽若蟲32頭，在黑肩綠盲蝽的I~3齡若蟲期，每2天更換I次產卵苗，在4齡至成蟲期每天更換I次產卵苗；每天上午觀察記錄黑肩綠盲蝽若蟲的存活和蛻皮情況，直至若蟲羽化，新羽化成蟲24小時內，2~3頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重； 選擇黑肩綠盲蝽的若蟲發(fā)育歷期、若蟲存活率、雌性率以及初羽化體重作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價由褐飛虱卵介導的轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽的安全性影響； ②以褐飛虱若蟲作為食物 每日提供在不同水稻品種、系上孵化并取食24~48小時的褐飛虱若蟲作為食物飼喂黑肩綠盲蝽，具體操作如下:用含有褐飛虱卵的稻苗將黑肩綠盲蝽飼養(yǎng)至2齡若蟲，再喂以不同水稻品種、系的褐飛虱若蟲，2~3齡黑肩綠盲蝽若蟲期每日每頭提供10頭褐飛虱若蟲，4齡黑肩綠盲蝽到成蟲期每日每頭提供20頭褐飛虱若蟲，黑肩綠盲蝽若蟲單頭飼養(yǎng)于底部鋪有濕海棉保濕的指型管中，每個品種、系各接黑肩綠盲蝽若蟲80頭，每天上午觀察記錄黑肩綠盲蝽若蟲的存活和蛻皮情況，直至若蟲羽化，新羽化成蟲24小時內，3~5頭相同性別成蟲合并后用萬分之一電子天平稱重； 選擇黑肩綠盲蝽的若蟲發(fā)育歷期、若蟲存活率、雌性率以及初羽化體重作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價由 褐飛虱若蟲介導的轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽的安全性影響； (3)蛋白傳遞規(guī)律:通過ELISA檢測手段鑒定黑肩綠盲蝽暴露于Bt蛋白的途徑和程度； 于玻璃罐中分別放入15日齡不同水稻品種、系的稻苗，接入對應水稻材料飼養(yǎng)的20頭懷卵褐飛虱雌成蟲，產卵2天后接入3~4齡黑肩綠盲蝽，取食3天后，分別對水稻葉鞘，褐飛虱卵，黑肩綠盲蝽進行取樣，每個處理重復4~5次； 將不同水稻品種、系飼養(yǎng)孵化后24~48小時的褐飛風若蟲與3~4齡黑肩綠盲蝽同時接入含有對應稻苗的玻璃罐中，每日更換褐飛虱，取食3天后，分別對水稻葉鞘，褐飛虱若蟲以及黑肩綠盲蝽進行取樣，每個處理重量4~5次； 采用ELISA技術，分別對以上樣品中Bt蛋白的含量進行檢測，確定通過不同的食物鏈黑肩綠盲蝽暴露于Bt蛋白的程度； (4)捕食功能反應:通過比較轉Bt基因抗蟲水稻與非轉基因親本對照品種飼養(yǎng)的黑肩綠盲蝽捕食功能參數(shù)，評價轉Bt基因抗蟲水稻對該非靶標生物的影響； 黑肩綠盲蝽分別于不同水稻材料飼養(yǎng)一代，羽化后2天且已交配的雌蟲用于試驗，試驗前饑餓處理24小時，將黑肩綠盲蝽單頭放入底部鋪有海棉且含有稻苗的指形試管，I齡褐飛虱若蟲作為獵物；5個獵物密度處理，分別為10、20、30、40、50頭，每個密度處理重復5次，24小時后計錄被捕食的褐飛虱若蟲數(shù)； 選擇黑肩綠盲蝽的瞬時攻擊率和處理獵物時間作為評價參數(shù)指標，并進行統(tǒng)計分析，評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽捕食功能反應的影響； (5)種群密度與種群動態(tài)比較:通過比較，轉Bt基因抗蟲水稻與非轉基因親本對照稻田黑肩綠盲蝽的發(fā)生動態(tài)，評價轉Bt基因抗蟲水稻的種植對該非靶標生物種群的影響； 采用對角線取樣法，每小區(qū)面積為150m2，每次取5個樣，每樣0.25m2，約6叢稻株；水稻移栽后30天開始用吸蟲器取樣，至水稻收割前10天，共取樣5~7次；取樣立即用75%的酒精保存，在體視鏡下進行鑒定并計數(shù)，以統(tǒng)計黑肩綠盲蝽種群密度及種群動態(tài)，并對不同水稻稻田之間參數(shù)的差異性進行統(tǒng)計分析，評價轉Bt基因抗蟲水稻對黑肩綠盲蝽田間種群的安全性影響。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法，其特征在于黑肩綠盲蝽人工飼育器為直徑X高=2cmX 12cm的雙通玻璃管(2)，其一端為飼料室，飼料室由雙層Parafi Im膜(3 )中間包裹飼料而成。
3.根據(jù)權利要求1所述的轉基因抗蟲水稻對捕食性天敵黑肩綠盲蝽安全性評價方法，其特征在于2cmX 12cm指型管中，每個品種、系各接黑肩綠盲蝽若蟲80頭。
【文檔編號】A01K67/033GK103875608SQ201410110665
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權日:2014年3月24日
【發(fā)明者】華紅霞, 韓宇, 何月平, 趙景, 蔡萬倫 申請人:華中農業(yè)大學