一種高效率菊花雜交育種效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種高效率菊花雜交育種的方法，屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，本發(fā)明選擇雜交后代種子，經(jīng)75%乙醇消毒1min及5%次氯酸鈉消毒50min后，播種于含15g·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基上，并結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)一步擴(kuò)繁和繼代培養(yǎng)，獲得大量的無菌苗。本方法切實(shí)提高了雜交種子發(fā)芽率和成苗率，并且對(duì)于部分存在雜交不親和性的菊花品種，可將由少量的雜交后代種子獲得的無菌苗于當(dāng)年進(jìn)行繼代擴(kuò)繁，以獲得較大群體的株系，從而縮短育種周期，并進(jìn)一步豐富了菊花育種手段。
【專利說明】一種高效率菊花雜交育種效率的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種高效率菊花雜交育種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菊花是原產(chǎn)我國的十大傳統(tǒng)名花，也是世界上最重要的花卉之一，距今已有1600多年的栽培歷史，由毛華菊、野菊和紫花野菊等天然雜交并經(jīng)人工長期選育而成。唐朝時(shí)期，中國菊花經(jīng)朝鮮傳入日本，17世紀(jì)中葉始，中國菊花傳入荷蘭、法國、英國等國家，現(xiàn)已成為世界四大切花之一。目前，我國選育的菊花品種約有4000多個(gè)，全球品種總數(shù)在2萬之上，是世界上商品產(chǎn)值最高的花卉之一。菊花不僅在切花和盆花中具有十分重要的地位，而且在園林應(yīng)用中也發(fā)揮了極大的作用，因此加強(qiáng)菊花育種具有很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
[0003]菊花是典型的多起源雜種，實(shí)生后代極易產(chǎn)生花色、花型等性狀的分離，因此利用雜交或開放授粉獲得的實(shí)生苗后代進(jìn)行菊花新品種選育是目前菊花育種的主要手段。但由于不同品種的結(jié)實(shí)率差異極大，部分品種尤其是瓣性較高的蜂窩型、蓮座型等花型的品種結(jié)實(shí)率低，種子少，飽滿度低，田間播種的發(fā)芽率和成苗率也較低，較難獲得大量播種苗后代，極大地影響了育種效率。此外，田間播種后播種苗生長較慢，當(dāng)年難以獲得較大群體的株系，需要當(dāng)年初選后，于第二、三年復(fù)選和優(yōu)選，也延長了育種周期。鑒于此，針對(duì)部分結(jié)實(shí)率低、種子飽滿度差的雜交后代組合，采用無菌播種方法，一方面可以克服不良環(huán)境的影響，提高發(fā)芽率和成苗率，同時(shí)可在可控環(huán)境下利用無菌播種獲得的種苗進(jìn)行繼代擴(kuò)繁，于當(dāng)年獲得較大群體的株系，可大幅度縮短育種周期，提高育種效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明的目的是針對(duì)目前菊花育種上部分雜交組合后代種子少、飽滿度低、常規(guī)田間播種的發(fā)芽率和成苗率也較低這一現(xiàn)狀，通過種子消毒、無菌播種和繼代擴(kuò)繁，提供一套簡(jiǎn)單易操作的方法，以提高菊花雜交種子的發(fā)芽率、成苗率，并于當(dāng)年形成雜交后代的無性株系，從而縮短育種周期，提高育種效率，實(shí)用性和科學(xué)性突出。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種高效率菊花雜交育種的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]I)雜交種子的消毒:
[0008]將雜交種子用自來水沖洗15~20min后,經(jīng)無菌水浸泡24~26h,然后在再用體積百分比75%乙醇消毒Imin,再用質(zhì)量百分比5%次氯酸鈉消毒50min后,用無菌水沖洗3~4次；
[0009]2)無菌播種:
[0010]消毒完的種子接種于含15g.L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基中，15d后，將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基；
[0011]3)雜種株系的獲得:
[0012]MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10~15d后，將幼苗莖段切割3~5段，分別轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)，當(dāng)幼苗長至2~3cm時(shí)，將其移至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；40d后煉苗移植。
[0013]上述方法中雜交種子采收后陰干，置于牛皮紙袋中，4°C冰箱保存。次氯酸鈉溶液中可添加次氯酸鈉溶液體積0.3%的表面活性劑TritonX-1OO。
[0014]繼代和生根培養(yǎng)的溫度均為25±2°C，光照14h，光強(qiáng)1500~20001x。繼代培養(yǎng)時(shí)可以根據(jù)需要確定繼代數(shù)，從而使每粒種子獲得數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)不等個(gè)體的株系。繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基可為MS+6-BA0.2mg .L-1的培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基可以為添加生長素ΝΑΑ0.1mg.L-1的1/2MS培養(yǎng)基。
[0015]上述方法具體包括以下步驟:
[0016]1)雜交種子的保存與消毒
[0017]將菊花雜交種子采收后陰干，4°C冰箱保存；種子用自來水沖洗15min后，經(jīng)無菌水浸泡24h。然后用體積百分比75%乙醇消毒Imin,再用質(zhì)量百分比5%次氯酸鈉消毒50min后用無菌水沖洗3次。
[0018]2)無菌播種
[0019]消毒完的種子接種于含15g.L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20粒種子，15d后，將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0020]3)雜種后代株系的獲得
[0021]MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10~15d后，將幼苗莖段切割3~5段，分別轉(zhuǎn)入MS+6-BA0.2mg噸―1的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)，并根據(jù)需要確定繼代數(shù)，從而使每粒種子獲得數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)不等個(gè)體的株系。當(dāng)幼苗長至2~3cm時(shí)，移至添加NAA0.1mg -L-1的1/2MS培養(yǎng)基上壯苗并生根，約40d后煉苗移植，即可獲得雜種株系。無菌播種、繼代和生根培養(yǎng)的溫度均為25±2°C，光照 14h，光強(qiáng) 1500 ~20001x。
[0022]無菌播種技術(shù)及無菌播種體系在本發(fā)明前在菊花育種實(shí)踐中并未見報(bào)道。在本技術(shù)的摸索過程中，綜合比較了不同消毒劑(H2O2、次氯酸鈉)、消毒時(shí)間、培養(yǎng)基類型(MS、B5、恥)、無機(jī)鹽濃度(1/41^、1/21^、1^)、蔗糖濃度(158.L-1JOg.L'45g.L-1)等因素對(duì)種子的消毒和培養(yǎng)效果的影響，通過設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳種子預(yù)處理方法、消毒方法和萌發(fā)培養(yǎng)基，從而建立起一整套的菊花無菌播種體系。其中，針對(duì)消毒時(shí)間這一重要變量，分別設(shè)置消毒時(shí)間5min、10min, 15min,等每間隔5min,直到Ih,仔細(xì)比較播種過程中的出苗率、污染率及幼苗的生長狀態(tài)，最終確定最適宜的消毒時(shí)間，既保證污染率為0，又保證種子發(fā)芽率較高(> 50%)。因此，本發(fā)明為一種提高菊花雜交育種效率的方法，將無菌播種技術(shù)與組培快繁技術(shù)結(jié)合，運(yùn)用于雜交育種實(shí)踐中，既可提高雜交種子發(fā)芽率和成苗率，又可于當(dāng)年獲得雜交后代株系，便于較大群體觀察比較雜交后代的性狀，從而縮短育種周期，提高育種效率。
[0023]本發(fā)明提供的菊花無菌播種和繼代擴(kuò)繁的方法，與現(xiàn)有田間播種技術(shù)相比具有如下積極效果:
[0024]I)與常規(guī)播種方法相比，本發(fā)明方法針對(duì)結(jié)實(shí)率低、種子少、飽滿度低的雜交組合后代，利用可控環(huán)境下的無菌播種方法，可提高種子發(fā)芽率20.8 %以上，且成苗率達(dá)到100%,從而擴(kuò)大了選種后代規(guī)模。針對(duì)結(jié)實(shí)率較低、后代種子較少的優(yōu)異親本雜交組合，是一種有效的育種輔助手段和技術(shù)。[0025]2)通過將無菌播種技術(shù)獲得的無菌苗進(jìn)一步利用組培快繁技術(shù)進(jìn)行繼代擴(kuò)繁，可以使每粒雜種種子在當(dāng)年根據(jù)需要獲得數(shù)株乃至數(shù)十株不等的較大群體的株系，在當(dāng)年完成初選的同時(shí)，為優(yōu)選株系第二年開展生產(chǎn)中試奠定了基礎(chǔ)，可縮短育種年限一年以上。
[0026]3)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行、成本低廉，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為無菌播種和繼代擴(kuò)繁獲得雜交后代株系的各步驟植株顯示圖
[0028](材料:利用切花菊品種‘Feelinggreen dark’和‘瑪麗’，以‘瑪麗’為父本經(jīng)雜交獲得的種子)。其中:
[0029]A:消毒完的雜交種子接種于含15g.L-1蔗糖的MS培養(yǎng)基，標(biāo)尺=Icm ；[0030]B:無菌播種7d后，種子發(fā)芽，標(biāo)尺=Icm ；
[0031]C:15d后，發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基，標(biāo)尺=0.5cm ；
[0032]D.10~15d后，幼苗莖段轉(zhuǎn)入MS+6-BA0.2mg L-1的培養(yǎng)基，繼代擴(kuò)繁，標(biāo)尺=Icm ；
[0033]E.1Od后，莖段移至1/2MS+NAA0.1mg.L-1的培養(yǎng)基上生根，標(biāo)尺=Icm ；
[0034]F.40d 后，煉苗，標(biāo)尺=lcm。
【具體實(shí)施方式】
[0035]本發(fā)明所提供的通過無菌播種及繼代擴(kuò)繁提高菊花雜交育種效率的方法，其實(shí)施方式如下:
[0036]實(shí)施例1
[0037]I)種子的保存與消毒
[0038]將菊花雜交種子采收后陰干，置于牛皮紙袋中，4°C冰箱保存。
[0039]種子用自來水沖洗15min后，經(jīng)無菌水浸泡24h。然后在超凈工作臺(tái)上用體積百分比75%乙醇消毒lmin，再用質(zhì)量百分比5%次氯酸鈉消毒50min。其中，次氯酸鈉溶液中需添加次氯酸鈉溶液體積0.3%的表面活性劑TritonX-100。最后用無菌水沖洗3次，每次沖洗時(shí)間約為2min。
[0040]2)無菌播種
[0041]消毒完的種子接種于培養(yǎng)皿中，皿內(nèi)裝有含15g.I71鹿糖的MS培養(yǎng)基,每個(gè)培養(yǎng)皿接種20粒種子。15d后，將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基。
[0042]3)雜種后代株系的獲得
[0043]MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10~15d后，將幼苗莖段切割3~5段，分別轉(zhuǎn)入MS+細(xì)胞分裂素6-BA0.2mg.L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)，繼代數(shù)I~3次。當(dāng)幼苗長至2~3cm時(shí)，將其移至添加生長素NAA0.1mg -L-1的1/2MS培養(yǎng)基上生根。約40d后煉苗，無菌苗移植于由營養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖按照體積比2:2:1混合而成的基質(zhì)中培養(yǎng)，兩周后，即可定植于田間，獲得雜種株系。
[0044]繼代和生根培養(yǎng)的溫度均為25±2°C，光照14h，光強(qiáng)1500~20001x。
[0045]實(shí)施例2:
[0046]將盆栽小菊品種‘鐘山早白’、‘金陵陽光’開放授粉獲得的種子采收后陰干，置于牛皮紙袋中，4°C冰箱保存。[0047]消毒時(shí),種子先用自來水沖洗15min后,經(jīng)無菌水浸泡24h。然后在超凈工作臺(tái)上用體積百分比75%乙醇消毒lmin，再用質(zhì)量百分比5%次氯酸鈉消毒50min。其中，次氯酸鈉溶液中需添加次氯酸鈉溶液體積0.3%的表面活性劑TritonX-100。最后用無菌水沖洗3次，每次沖洗時(shí)間約為2min。
[0048]將消毒完的種子接種于培養(yǎng)皿中，皿內(nèi)裝有含15g.L—1蔗糖的MS培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20粒種子。15d后，將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基。
[0049]以常規(guī)播種為對(duì)照，即將陰干的種子播在72孔穴盤中，每個(gè)穴盤播一粒種子，穴盤基質(zhì)是用營養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖(2:2:1)混合而成。
[0050]將播好的種子放在24~26°C的光照培養(yǎng)室按照實(shí)施例1 “雜種后代株系的獲得”步驟進(jìn)行，其中，繼代數(shù)I次，每日澆兩次水。分別于5月6日和7月8日統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和成苗率。結(jié)果表明，‘鐘山早白’、‘金陵陽光’無菌播種的發(fā)芽率較常規(guī)播種分別提高了 29.1%和20.8%，同時(shí)，成苗率分別提高了 29.2%和14.6%。證明利用本發(fā)明方法，能切實(shí)提高種子發(fā)芽率和成苗率。
[0051]表1無菌播種和常規(guī)播種的發(fā)芽率和成苗率比較
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種高效率菊花雜交育種的方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)雜交種子的消毒: 將雜交種子用自來水沖洗15~20min后,經(jīng)無菌水浸泡24~26h，然后在再用體積百分比75%乙醇消毒Imin,再用質(zhì)量百分比5%次氯酸鈉消毒50min后,用無菌水沖洗3~4次； 2)無菌播種: 消毒完的種子接種于含15g.L1蔗糖的MS培養(yǎng)基中，15d后，將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基; 3)雜種株系的獲得: MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10~15d后，將幼苗莖段切割3~5段，分別轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)，當(dāng)幼苗長至2~3cm時(shí)，將其移至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；40d后煉苗移植。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊花雜交育種的方法，其特征在于該方法中雜交種子采收后陰干，置于牛皮紙袋中，4°C冰箱保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊花雜交育種的方法，其特征在于繼代和生根培養(yǎng)的溫度均為 25±2°C，光照 14h，光強(qiáng) 1500 ~20001x。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊花雜交育種的方法，其特征在于繼代培養(yǎng)時(shí)根據(jù)需要確定繼代數(shù)，從而使每粒種子獲得數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)不等個(gè)體的株系。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊花雜交育種的方法，其特征在于繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2mg.L1的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊花雜交育種的方法，其特征在于生根培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為添加生長素ΝΑΑ0.1mg.L1的1/2MS培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊花雜交育種的方法，其特征在于次氯酸鈉溶液中添加次氯酸鈉溶液體積0.3%的表面活性劑TritonX-1OO。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK103828710SQ201410100386
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】房偉民, 金詩媛, 陳發(fā)棣, 管志勇, 陳素梅, 蔣甲福, 滕年軍, 方庚 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)