甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及甜葉菊的組織培養(yǎng)繁殖方法及其培養(yǎng)基，尤其是涉及以甜葉菊葉片為外植體直接成芽的組織培養(yǎng)快繁方法。甜葉菊組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：(1)外植體采集，(2)消毒接種，(3)增厚誘導培養(yǎng)，(4)出芽成苗，(5)轉接生根，(6)煉苗移栽。本發(fā)明提供的甜葉菊組織培養(yǎng)方法，取材容易，可以迅速擴繁出大量種源，外植體組織培養(yǎng)沒有愈傷組織細胞增殖分化這一培養(yǎng)階段，縮短了培養(yǎng)時間，并且有極高的增殖率，易操作，可大規(guī)模生產，且培養(yǎng)過程便于遺傳轉化等研究的操作。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，確保葉片在各個階段能達到預期培養(yǎng)目標。
【專利說明】甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及甜葉菊的組織培養(yǎng)繁殖方法及其培養(yǎng)基，尤其是涉及以甜葉菊葉片為外植體直接成芽的組織培養(yǎng)快繁方法及其培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]菊科植物甜葉菊Stevin rebaudiann, Bertoni,以下稱甜葉菊,是原產于南美洲巴拉圭的菊科甜葉菊屬多年生草本植物，由于甜葉菊所含的甜菊糖苷有制血糖、降低血壓、促進新陳代謝以及治療糖尿病、肥胖癥、調節(jié)胃酸、恢復神經(jīng)疲勞的功效，并且物理、化學性質穩(wěn)定，無發(fā)酵性特點，其制品有比較長的保質期，特別適合作為糖尿病、高血壓等病患者食品的甜味劑、保健品添加劑等，具有廣闊的市場前景和應用范圍。
[0003]自我國于20世紀70年代年引種甜葉菊并成功擴大種植以來，已經(jīng)有30余年的歷史，但由于甜菊的繁育特性，傳統(tǒng)的繁殖方式包括種子、扦插方式。但是用種子繁育的方法，成活率低；而扦插繁殖導致品質退化，并且這兩種繁育方式時間長、需要大量以莖尖、帶腋芽的莖段、種子等材料。

【發(fā)明內容】

[0004]針對上述技術問題，本發(fā)明提供一種新的繁育方式和培養(yǎng)基，采用葉片為外植體，通過組織培養(yǎng)技術，并在不經(jīng)歷愈傷組織培養(yǎng)的階段直接出芽成苗，大大縮短培養(yǎng)時間，且外植體來源受限小，增殖率 高，短期內可獲得大量種苗。具體的技術方案為:
[0005]甜葉菊組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體采集
[0007]對于室外栽培的植株，選取無病、蟲損害的甜葉菊植株，米摘植株頂端第一、二對已經(jīng)完全展開，但未老熟的葉片作為外植體；
[0008]對于無菌組培苗，可使用長勢良好、健康的組培苗的所有葉片；
[0009](2)消毒接種
[0010]采摘自室外栽培植株的葉片用流水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用75%酒精處理6~8秒后再用0.1 %升汞浸泡8分鐘,倒去升汞溶液,用無菌水沖洗4~5次，每次不少于半分鐘，然后用無菌紙吸干表面水分并避免相互重疊，并接種到增厚誘導培養(yǎng)基中；
[0011]組培苗葉片可不經(jīng)消毒，在無菌條件下采摘后直接接種；
[0012]接種時將完整的葉片正面接觸增厚誘導培養(yǎng)基表面，若接種時葉片還存有葉柄，則將葉片基部彎曲，葉柄插入增厚誘導培養(yǎng)基，并保持葉片接觸培養(yǎng)基；
[0013](3)增厚誘導培養(yǎng)
[0014]葉片接種到增厚誘導培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)至7~9天后葉片出現(xiàn)肉質增厚，葉片肉質增厚特征表現(xiàn)為，葉片增厚，表面密布透明顆粒，葉片質地脆而易斷；
[0015](4)出芽成苗
[0016]將第(3)步所得的肉質增厚葉片轉接進入出芽成苗誘導培養(yǎng)基，在無菌培養(yǎng)室內，先完全遮光暗培養(yǎng)I周，再光培養(yǎng)I~2周后，葉片開始在中脈兩側或葉尖長出紫紅色的芽，每片葉片出芽個數(shù)約8~14個，每一個芽經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后顏色轉綠，并單獨成一株再生苗，待苗生長至高3~5cm后進入下一步驟；
[0017](5)轉接生根
[0018]將3~5cm高的苗相互分開成單株，保證每株苗有葉片5~7枚，轉接插入配置好的生根誘導培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)約3周后，苗基部長出多條綠色根，并有明顯白色根毛后，進行下一步驟；
[0019](6)煉苗移栽
[0020]將生根的苗連同培養(yǎng)容器一同移出無菌培養(yǎng)室，在控制溫度為正常室溫的育苗室內放置2~3天后，揭開培養(yǎng)容器蓋子或封口膜再放置2~3天，期間保持育苗室內濕度在80 %以上，之后用清水洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移栽入噴灑過多菌靈500倍液的室外土壤中，并保持土壤濕潤。
[0021]其中，所述的增厚誘導培養(yǎng)基包括:MS+芐基腺嘌呤6-BA 0.1~1.0mg/L+萘乙酸NAA 0.1 ~0.5mg/L+0.7% 瓊脂。
[0022]增厚誘導培養(yǎng)基優(yōu)選成分包括:MS+芐基腺嘌呤6-BA 0.4mg/L+萘乙酸NAA
0.lmg/L+0.7% 瓊脂。
[0023]所述的出芽成苗誘導培養(yǎng)基包括:MS+萘乙酸NAA 0.4~1.0mg/L+芐基腺嘌呤6-BA 1.0 ~2.5mg/L+0.7%瓊脂。
[0024]出芽成苗誘導培養(yǎng)基優(yōu)選成分包括:MS+萘乙酸NAA 0.5mg/L+芐基腺嘌呤6_BA`2.0mg/L+0.7% 瓊脂。
[0025]所述的生根誘導培養(yǎng)基包括:1/4MS+吲哚丁酸IBA 0.05~0.2mg/L+萘乙酸NAA
0.05 ~0.2mg/L+0.5% 瓊脂。
[0026]生根培養(yǎng)基優(yōu)選成分包括:1/4MS+吲哚丁酸IBA 0.2mg/L+萘乙酸NAA 0.2mg/L+0.5% 瓊脂。
[0027]增厚誘導培養(yǎng)基、出芽成苗誘導培養(yǎng)基、生根誘導培養(yǎng)均在121°C溫度下滅菌20分鐘，并在滅菌前調整pH值為5.6~5.8，培養(yǎng)溫度控制為23土1°C，光照10~12小時/天，使用照度為1800~2000Lx的日光燈源。
[0028]本發(fā)明提供的甜葉菊組織培養(yǎng)方法，取材容易，可以迅速擴繁出大量種源，外植體組織培養(yǎng)沒有愈傷組織細胞增殖分化這一培養(yǎng)階段，縮短了培養(yǎng)時間，并且有極高的增值率，易操作，可大規(guī)模生產，且培養(yǎng)過程便于遺傳轉化等研究的操作。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，確保葉片在各個階段能達到預期培養(yǎng)目標。
【具體實施方式】
[0029]結合實施例和對比例說明本發(fā)明的【具體實施方式】和技術效果。
[0030]實施例1:
[0031](I)無菌條件下取由甜葉菊莖段組織培養(yǎng)再生無菌苗的綠色葉片，將完整的葉片正面接觸培養(yǎng)基，在超凈工作臺上接種到增厚誘導培養(yǎng)基；增厚誘導培養(yǎng)基的成分為MS+芐基腺嘌呤6-BA 0.4mg/L+萘乙酸NAA 0.lmg/L+0.7%瓊脂；
[0032](2)在無菌培養(yǎng)室內培養(yǎng)9天后，葉片出現(xiàn)肉質增厚，無菌條件下轉接至出芽誘導培養(yǎng)基；出芽成苗誘導培養(yǎng)基成分為MS+萘乙酸NAA 0.5mg/L+芐基腺嘌呤6_BA 2.0mg/L+0.7% 瓊脂；
[0033](3)在無菌培養(yǎng)室遮光暗培養(yǎng)I周后開始光培養(yǎng)，12天后葉片在中脈兩側葉緣萌發(fā)出現(xiàn)紫色芽，每外植體出芽數(shù)13±2個，繼續(xù)培養(yǎng)后成苗，待苗高3~5厘米后轉接誘導生根；
[0034](4)再生苗相互分開成單株，保證每株有葉片5~7枚，無菌條件下轉接插入生根培養(yǎng)基；生根誘導培養(yǎng)成分為1/4MS+吲哚丁酸IBA 0.2mg/L+萘乙酸NAA 0.2mg/L+0.5%瓊脂；22天后每株生根16±2條，且18天時已經(jīng)有明顯的白色根毛，根較為粗壯；
[0035](5)將生根的再生苗連同培養(yǎng)容器一同移出無菌培養(yǎng)室，在正常室溫及相同光照條件下的室內放置2~3天，再除去培養(yǎng)容器蓋子或封口膜，在相同條件下放置2~3天，期間保持室內濕度80%以上，之后移栽入噴施多菌靈500倍液的土壤中，移到室外，最終成活率為90%。
[0036]其中，無菌培養(yǎng)室內條件為控制溫度為23±1°C，光照10小時/天，照度2000LX。
[0037]所有培養(yǎng)基附加蔗糖3%，調節(jié)pH為5.8，121°C滅菌20分鐘。
[0038]實施例2:
[0039](1)采摘自室外栽培植株的葉片，用流水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用75%酒精處理6~8秒后再用0.1 %升汞浸泡8分鐘,倒去升汞溶液,用無菌水沖洗4~5次，每次不少于半分鐘，后用無菌紙吸干表面水分并避免相互重疊，并盡快接種到增厚誘導培養(yǎng)基，增厚誘導培養(yǎng)基成分為MS+芐基腺嘌呤6-BA 0.4mg/L+萘乙酸NAA 0.lmg/L+0.7%瓊脂；
[0040](2)在無菌培養(yǎng)室內培養(yǎng)9天后出現(xiàn)肉質增厚，無菌條件下轉接至出芽誘導培養(yǎng)基，出芽成苗誘導培養(yǎng)基成分為MS+萘乙酸NAA 0.5mg/L+芐基腺嘌呤6-BA 2.0mg/L+0.7%瓊脂；
[0041](3)在無囷培養(yǎng)室遮光暗培養(yǎng)I周后開始光培養(yǎng)，14天后葉片在中脈兩側葉緣明發(fā)出現(xiàn)紫色芽，每外植體出芽數(shù)11±3個，繼續(xù)培養(yǎng)后成苗，待苗高3~5厘米后轉接誘導生根；
[0042](4)再生苗相互分開成單株，保證每株有葉片5~7枚，無菌條件下轉接插入生根培養(yǎng)基，生根誘導培養(yǎng)成分為1/4MS+吲哚丁酸IBA 0.2mg/L+萘乙酸NAA 0.2mg/L+0.5%瓊脂；19天后每株生根15±2條，在22天是有明顯的白色根毛，根較細；
[0043](5)將生根的再生苗連同培養(yǎng)容器一同移出無菌培養(yǎng)室，在正常室溫及相同光照條件下的室內放置2~3天，再除去培養(yǎng)容器蓋子或封口膜，在相同條件下放置2~3天，期間保持室內濕度80%以上，之后移栽入噴施多菌靈500倍液的土壤中，移到室外，最終成活率為90% ；
[0044]其中，所述的葉片接種時，應將完整的葉片正面接觸培養(yǎng)基表面，不用切割，若接種時葉片基本還存有葉柄，則應將葉片基部彎曲，葉柄插入培養(yǎng)基，并保持葉片接觸培養(yǎng)基。
[0045]無菌培養(yǎng)室內條件為控制溫度為23±1°C，光照10小時/天，照度2000LX。
[0046]所有培養(yǎng)基附加蔗糖3%，調節(jié)pH為5.8，121°C滅菌20分鐘。
[0047]實施例3:
[0048](1)采摘自室外栽培植株的葉片，用流水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用75%酒精處理6~8秒后再用0.1 %升汞浸泡8分鐘,倒去升汞溶液,用無菌水沖洗4~5次，每次不少于半分鐘，后用無菌紙吸干表面水分并避免相互重疊，并盡快接種到增厚誘導培養(yǎng)基，增厚誘導培養(yǎng)基成分為MS+芐基腺嘌呤6-BA 0.5mg/L+萘乙酸NAA 0.lmg/L+0.7%瓊脂；
[0049](2)在無菌培養(yǎng)室內培養(yǎng)9天后出現(xiàn)肉質增厚，無菌條件下轉接至出芽誘導培養(yǎng)基，出芽成苗誘導培養(yǎng)基成分為MS+萘乙酸NAA 1.01^/1+芐基腺嘌呤6-8八2.5mg/L+0.7%瓊脂；
[0050](3)在無囷培養(yǎng)室遮光暗培養(yǎng)I周后開始光培養(yǎng)，14天后葉片在中脈兩側葉緣明發(fā)出現(xiàn)紫色芽，每外植體出芽數(shù)11±3個，繼續(xù)培養(yǎng)后成苗，待苗高3~5厘米后轉接誘導生根；
[0051](4)再生苗相互分開成單株，保證每株有葉片5~7枚，無菌條件下轉接插入生根培養(yǎng)基，生根誘導培養(yǎng)成分為1/4MS+吲哚丁酸IBA 0.05mg/L+萘乙酸NAA 0.05mg/L+0.5%瓊脂；21天后每株生根15±2條，在23天是有明顯的白色根毛，根較細。
[0052](5)將生根的再生苗連同培養(yǎng)容器一同移出無菌培養(yǎng)室，在正常室溫及相同光照條件下的室內放置2~3天，再除去培養(yǎng)容器蓋子或封口膜，在相同條件下放置2~3天，期間保持室內濕度80%以上，之后移栽入噴施多菌靈500倍液的土壤中，移到室外，最終成活率為90% ；
[0053]其中，所述的葉片接種時，應將完整的葉片正面接觸培養(yǎng)基表面，不用切割，若接種時葉片基本還存有葉柄，則應將葉片基部彎曲，葉柄插入培養(yǎng)基，并保持葉片接觸培養(yǎng)基。
[0054]無菌培養(yǎng)室內條件為控制溫度為23±1°C，光照10小時/天，照度2000LX。
`[0055]所有培養(yǎng)基附加蔗糖3%，調節(jié)pH為5.8，121°C滅菌20分鐘。
[0056]對比例:
[0057](I)采摘自室外栽培植株的葉片，用流水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用75%酒精處理6~8秒后再用0.1 %升汞浸泡8分鐘,倒去升汞溶液,用無菌水沖洗4~5次，每次不少于半分鐘，后用無菌紙吸干表面水分并避免相互重疊；
[0058](2)完成消毒的葉片外植體盡快接種到增厚誘導對照培養(yǎng)基，增厚誘導對照培養(yǎng)基成分為MS培養(yǎng)基+0.7%瓊脂中，在無菌培養(yǎng)室內培養(yǎng)7天后褐化干枯死亡，
[0059](3)另用肉質增厚的葉片無菌條件下轉接至出芽誘導對照培養(yǎng)基，成分為MS+0.7%瓊脂；在無菌培養(yǎng)室遮光暗培養(yǎng)I周后褐化，干枯死亡；
[0060](4)另取再生苗相互分開成單株，保證每株有葉片5~7枚，無菌條件下轉接插入生根對照培養(yǎng)基，成分為1/4MS+0.5%瓊脂，不能生根，約3周后除培養(yǎng)基消耗外無明顯變化；
[0061]其中，葉片接種時，應將完整的葉片正面接觸培養(yǎng)基表面，不用切割，若接種時葉片基本還存有葉柄，則應將葉片基部彎曲，葉柄插入培養(yǎng)基，并保持葉片接觸培養(yǎng)基。
[0062]無菌培養(yǎng)室內條件為控制溫度為23±1°C，光照10小時/天，照度2000LX。
[0063]所有培養(yǎng)基附加蔗糖3%，調節(jié)pH為5.8，121°C滅菌20分鐘。
[0064]通過對比例和實施例對比，可見通過本發(fā)明提供的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基，可以迅速、有效的利用甜葉菊葉片組織培養(yǎng)直接成芽進行繁殖。
【權利要求】
1.甜葉菊組織培養(yǎng)方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)外植體采集 對于室外栽培的植株，選取無病、蟲損害的甜葉菊植株，米摘植株頂端第一、二對已經(jīng)完全展開，但未老熟的葉片作為外植體； 對于無菌組培苗，可使用長勢良好、健康的組培苗的所有葉片； (2)消毒接種 采摘自室外栽培植株的葉片用流水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用75%酒精處理6~8秒后再用0.1 %升汞浸泡8分鐘，倒去升汞溶液，用無菌水沖洗4~5次，每次不少于半分鐘，然后用無菌紙吸干表面水分并避免相互重疊，并接種到增厚誘導培養(yǎng)基中； 組培苗葉片可不經(jīng)消毒，在無菌條件下采摘后直接接種； 接種時將完整的葉片正面接觸增厚誘導培養(yǎng)基表面，若接種時葉片還存有葉柄，則將葉片基部彎曲，葉柄插入增厚誘導培養(yǎng)基，并保持葉片接觸培養(yǎng)基； (3)增厚誘導培養(yǎng) 葉片接種到增厚誘導培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)至7~9天后葉片出現(xiàn)肉質增厚，葉片肉質增厚特征表現(xiàn)為，葉片增厚，表面密布透明顆粒，葉片質地脆而易斷； (4)出芽成苗 將第(3)步所得的肉質增厚葉片轉接進入出芽成苗誘導培養(yǎng)基，在無菌培養(yǎng)室內，先完全遮光暗培養(yǎng)I周，再光培養(yǎng)I~2周后，葉片開始在中脈兩側或葉尖長出紫紅色的芽，每片葉片出芽個數(shù)約8~14個，每一個芽經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后顏色轉綠，并獨成一株再生苗，待苗生長至高3~5cm后進入下一步驟； (5)轉接生根 將3~5cm高的苗相互分開成單株，保證每株苗有葉片5~7枚，轉接插入配置好的生根誘導培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)約3周后，苗基部長出多條綠色根，并有明顯白色根毛后，進行下一步驟； (6)煉苗移栽 將生根的苗連同培養(yǎng)容器一同移出無菌培養(yǎng)室，在控制溫度為正常室溫的育苗室內放置2~3天后，揭開培養(yǎng)容器蓋子或封口膜再放置2~3天，期間保持育苗室內濕度在80%以上，之后用清水洗凈根上附著的培養(yǎng)基，移栽入噴灑過多菌靈500倍液的室外土壤中，并保持土壤濕潤。
2.根據(jù)權利要求1所述的增厚誘導培養(yǎng)基，其特征在于:包括，MS+芐基腺嘌呤6-BA0.1 ~1.0mg/L+ 萘乙酸 NAA 0.1 ~0.5mg/L+0.7%瓊脂。
3.根據(jù)權利要求2所述的增厚誘導培養(yǎng)基，其特征在于:包括，MS+芐基腺嘌呤6-BA0.4mg/L+ 蔡乙酸 NAA 0.lmg/L+0.7%瓊脂。
4.根據(jù)權利要求1所述的出芽成苗誘導培養(yǎng)基，其特征在于:包括，MS+萘乙酸NAA0.4 ~1.0mg/L+ 芐基腺嘌呤 6-BA 1.0 ~2.5mg/L+0.7%瓊脂。
5.根據(jù)權利要求4所述的出芽成苗誘導培養(yǎng)基，其特征在于:包括:MS+萘乙酸NAA0.5mg/L+ 芐基腺嘌呤 6-BA 2.0mg/L+0.7%瓊脂。
6.根據(jù)權利要求1所述的生根誘導培養(yǎng)，其特征在于:包括，1/4MS+吲哚丁酸IBA0.05 ~0.2mg/L+ 萘乙酸 NAA 0.05 ~0.2mg/L+0.5%瓊脂。
7.根據(jù)權利要求6所述的生根誘導培養(yǎng)，其特征在于:包括，1/4MS+吲哚丁酸IBA`0.2mg/L+ 萘乙酸 NA`A 0.2mg/L+0.5%瓊脂。
【文檔編號】A01H4/00GK103766222SQ201410049070
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月12日 優(yōu)先權日:2014年2月12日
【發(fā)明者】吳衛(wèi), 唐鑫, 宋倫, 楊昭, 李興嬌, 曾建威, 何曉洪, 陳艾萌 申請人:四川農業(yè)大學