黃花葉病毒p2蛋白及其基因在培育抗黃花葉病小麥中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了黃花葉病毒P2蛋白及其基因在培育抗黃花葉病小麥中的應用。本發(fā)明提供的如下1）-3）中任一種物質在調控植物抗病性中的應用：1）蛋白P2；2）編碼蛋白P2的DNA分子；3）含有編碼蛋白P2的DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；所述蛋白P2的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明將P2蛋白的編碼基因導入小麥中，得到轉基因小麥，該轉基因小麥的抗黃花病性大于非轉基因小麥，且同時獲得了對病毒病具有較強抗性的轉基因小麥新品系，說明該蛋白抗黃花病性，從而對于減少病毒病危害，保障小麥穩(wěn)產具有重要意義。
【專利說明】黃花葉病毒P2蛋白及其基因在培育抗黃花葉病小麥中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種黃花葉病毒P2蛋白及其基因在培育抗黃花葉病小麥中的應用。
【背景技術】
[0002]小麥是世界最重要谷物資源之一，是人類主要的食物資源，也是重要的工業(yè)原料。近年來，全球能源緊缺的不斷加重，小麥作為最主要的谷物資源之一，其需求量也越來越大。世界種植小麥的國家很多，但產量主要集中在中國、印度、美國、俄羅斯、加拿大和澳大利亞等國家，這幾個國家小麥產量占世界總產量的一半；而中國的產量位居世界第一。
[0003]小麥在中國谷物生產中占有極其重要的地位，其種植面積與產量均占谷物產量的1/4以上，小麥作為我國三大糧食作物之一，其常年種植面積約2000萬公頃，總產量達1200億公斤。然而，近些年來，由于小麥病毒病逐漸加重，已成為我國小麥生產上的重要病害，尤其是小麥黃花葉病。小麥黃花葉病于1927年日本首次報道(Sawada，1927)，我國20世紀60年代以前只是零星發(fā)生，70年代以來不斷擴大蔓延(孫謙等，1997;陶家風等，1980;王鳴岐等，1980;于善謙，1986)，主要分布于我國長江、黃河中下游和淮河流域，涵蓋了我國小麥主要產區(qū)的大部分省區(qū)，包括四川、陜西、江蘇、浙江、安徽、湖北、山東和河南等省，其中江蘇省的里下河地區(qū)和寧鎮(zhèn)揚丘陵地區(qū)、山東半島及濰坊和臨沂等地區(qū)、河南信陽、南陽和駐馬店等地區(qū)、湖北省東北沿大別山地區(qū)、陜西省渭河流域關中地區(qū)發(fā)生較重(Han etal.，2000)。自90年代以來每年該病發(fā)生面積都達66.67萬公頃以上，2005年僅江蘇省發(fā)生面積達4.636萬公頃，危害日趨嚴重。一般病田減產10-30%，嚴重地達70-80%，一些發(fā)病嚴重的田塊甚 至絕收(孫謙等，1992)。目前，小麥黃花葉病已成為我國小麥生產上的重要病毒病害之一。
[0004]在我國小麥黃花葉病害的病原是小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaicvirus, WYMV)，基因組是由兩條正義單鏈RNA組成，屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae),大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)。在自然條件下，WYMV是由根腫菌目多粘菌屬的禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)傳播(Barr, et al., 1988)。過多年對WYMV的研究，已經獲得了一些有關小麥黃花葉病毒分子生物學特性的研究結果(Chen et al., 2000a;Chen etal., 2000b; Namba et al., 1998; Yu et al.，1999;董家紅等，2003;于嘉林等，1995)。對于RNA2編碼的P2蛋白的功能尚不確定。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供如下物質在調控植物抗病性中的應用。
[0006]本發(fā)明提供的如下I) -3)中任一種物質在調控植物抗病性中的應用:1)蛋白P2 ；2)編碼蛋白P2的DNA分子；3)含有編碼蛋白P2的DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；[0007]所述蛋白P2的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0008]上述應用中，所述編碼蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I ;
[0009]所述含有編碼蛋白P2的DNA分子的重組載體為將所述編碼蛋白P2的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白P2的重組載體。
[0010]在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pActl.cas，重組載體為將序列I所示的核苷酸插入載體pActl.cas的Sma I位點得到的重組載體。
[0011 ] 上述應用中，所述調控植物抗病性為提高植物抗病性。
[0012]上述應用中，所述病為小麥黃花葉病,所述小麥黃花葉病的病原菌為小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus)；
[0013]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。
[0014]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0015]本發(fā)明提供的方法，為將編碼蛋白P2的DNA分子導入目的植物中，得到轉基因植物；所述轉基因植物抗病性高于所述目的植物；
[0016]所述蛋白P2的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0017]上述方法中，所述病為小麥黃花葉病,所述小麥黃花葉病的病原菌為小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus)；
[0018]所述編碼蛋白P2的DNA分子通過重組載體導入所述目的植物中；
[0019]所述編碼蛋白P2的 DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0020]上述方法中，所述重組載體為將所述編碼蛋白P2的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白P2的重組載體；在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pActl.cas，重組載體為將序列I所示的核苷酸插入載體pActl.cas的Sma I位點得到的重組載體。
[0021]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。
[0022]本發(fā)明的第三個目的是提供一種重組載體。
[0023]本發(fā)明提供的重組載體，為將編碼蛋白P2的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白P2的重組載體；在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pActl.cas，重組載體為將序列I所示的核苷酸插入載體pActl.cas的Sma I位點得到的重組載體。
[0024]所述蛋白P2的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0025]上述重組載體中，所述編碼蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0026]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明將編碼P2蛋白的DNA分子導入小麥中，得到轉基因小麥，該轉基因小麥的抗小麥黃花葉病大于非轉基因小麥，且同時獲得了對病毒病具有較強抗性的轉基因小麥新品系，說明該蛋白抗小麥黃花葉病，從而對于減少病毒病危害，保障小麥穩(wěn)產具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為植物表達載體p34的構建
[0028]圖2為植物表達載體p34酶切鑒定
[0029]圖3為轉化各階段植物狀態(tài)及田間表型
[0030]A:小麥幼胚從未成熟胚中挑出置于培養(yǎng)基上；B:基因槍轟擊前在高滲培養(yǎng)基上處理愈傷；C:基因槍轟擊后恢復培養(yǎng)；D:抗性愈傷分化出小苗；E和F:小苗移到三角瓶生根；G:移栽到小盆中；H:子代在田間的表型，左為對照，右為轉基因品系。
[0031]圖4為轉P2小麥植株TO代基因組PCR檢測結果
[0032]圖5為轉P2小麥植株Tll代基因組PCR檢測結果
[0033]圖6為轉P2小麥植株的PCR-Southern檢測
[0034]圖7為2004-2013年兩個轉P2小麥品系在病圃的病情指數線狀圖
【具體實施方式】
[0035]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037]實施例1、轉P2小麥的培育
[0038]一、重組載體p34和質粒pAM2001獲得
[0039]1、重組載體p34的制備
[0040]WY-8:5 ' -CTCAACCATATGGTCGGCTCAGCTGAGG-3'，與 WYMV RNA2 的 904 ~93Int(P2蛋白基因片段的I~28nt)對應，[0041 ] WY-9:5' -ATGCGGATCCCTAATGGCCCGG-3'，與 WYMV RNA2 的 2881 ~2860nt(P2 蛋白基因片段的1978~1957nt)互補。人工合成序列I所示的DNA分子為模板，用引物WY-8和WY-9進行PCR擴增，得到1978bp的PCR產物。
[0042]經過測序，該PCR產物具有序列表中序列I所示的核苷酸(編碼區(qū)為序列表中序列I自5'末端第10-1968位核苷酸)，為P2蛋白全長基因P2，該基因編碼的蛋白為P2，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0043]將上述PCR產物用Sma I切平，與經過Sma I酶切的載體pActl.cas(CAMBIA, TG0063)連接，得到重組載體p34，載體構建策略見圖1。該載體為將序列表中序列I所示的核苷酸插入載體pActl.cas的Sma I位點得到的重組載體。
[0044]分別用Hind III和Pst I對重組載體p34進行單酶切鑒定，結果如圖2所示，p34用Hind III酶切(p34/H)后可以得到6.2kb和0.5kb兩條帶，p34用Pst I酶切(p34/p)后可以得到6.2kb、0.5kb和0.1kb的三條帶(見圖2)。說明載體構建正確。
[0045]2、ρΑΜ2001 質粒
[0046]pAM2001質粒，公眾可從中國農業(yè)大學獲得,記載在如下文獻中:董槿,抗小麥黃花葉病毒轉基因小麥的研究，中國農業(yè)大學，博士學位論文，2004。
[0047]二、用于基因槍轟擊的小麥愈傷及基因槍微彈的準備
[0048]1、幼胚準備
[0049]由于小麥的品種，及天氣如溫度、光照的影響，小麥開花后籽粒發(fā)育到適合轉化的時間的不同，應當注意觀察籽粒的灌漿情況。
[0050]I)揚麥11(記載在如下文獻中:高德榮等，《安徽農業(yè)科學》，2000，28(6):759-760,公眾可從中國農業(yè)大學獲得；以下也成為野生型小麥)開花后，15d左右的幼胚最適合做轉化。將正合適的麥穗剪下，剝出飽滿籽粒，置于滅過菌的三角瓶中，待消毒，此后的操作在超凈工作臺內完成；
[0051]2)先用70%乙醇表面消毒2min，用滅過菌的蒸餾水漂洗一次；
[0052]3)加入適量的次氯酸鈉溶液(I體積次氯酸鈉原液:I體積滅菌蒸餾水)，加一滴Tween20，置于搖床，室溫下慢速振蕩20min ；
[0053]4)再用滅菌蒸餾水洗5次，將多余的水分控出，便可用于挑胚；
[0054]5)用解剖針挑出籽粒尖端的幼胚，盾片面向上，置于含有2mg/L2，4_D的MSD2誘導培養(yǎng)基上，27°C暗培養(yǎng)7d，盾片周圍有愈傷出現，得到幼胚愈傷組織，即可用于轉化(圖3-A)。
[0055]2、基因槍微彈的制備
[0056]稱取金粉8mg (供射擊50次使用)，放入一只滅菌的1.5mL離心管中，加入1.5mL無水乙醇,在鏇潤混合器上劇烈振蕩IOmin,靜置5min, 12, OOOrpm離心Imin,用移液器小心
吸棄上清，重復上述步驟三次；
[0057]加入1.5mL滅菌的蒸餾水，高強度振蕩重新懸浮，靜置lmin，12，OOOrpm離心lmin，
用移液器小心吸棄上清，重復上述步驟三次；
[0058]加入1.0mL滅菌的50%甘油，重新懸浮，品均分配到20支0.5mL的離心管中(每管50 μ L，可供射擊4次使用)，可在-20°c存放；
[0059]轟擊用微彈制備方法如下:按照1.0 μ g質粒DNA/轟擊(質粒DNA為由質粒PAMM2001和上述I制備的重組載體p34等體積混合的質粒DNA)、80 μ g金粉/轟擊的比例，加入十倍于DNA體積的2.5M CaC12，加入四倍于DNA體積的亞精胺，震蕩5min，12，OOOrpm離心lmin,吸棄上清后,加入1.5mL70%乙醇,振蕩懸浮，12，OOOrpm離心lmin,吸棄上清后，加入1.5mL70% 乙醇,振蕩懸浮，12，OOOrpm離心lmin,吸棄上清,反復洗三次。按照10 μ L/轟擊的比例，加入無水乙醇，振蕩懸浮備用。
[0060]3、基因槍轟擊轉化獲得轉ρ2小麥
[0061]I)試劑制備
[0062](I)、基因槍耗材
[0063]金粉、阻攔網(可多次使用)、微彈載體(一次性使用)、易裂片(1100PSI，一次性使用)等均購自美國Bio-Rad公司。
[0064](2)、試劑的配制
[0065]2.5mol/L CaC12,過濾滅菌,分裝在1.5mL離心管中，_20°C保存；
[0066]0.lmol/L亞精胺，過濾滅菌，分裝在1.5mL離心管中，_20°C保存；
[0067]50%的甘油溶液，高壓滅菌，_20°C保存；
[0068]無水乙醇，原液；異丙醇，原液；滅菌的蒸餾水。
[0069](3)、培養(yǎng)基的配制
[0070]表1為MS基本培養(yǎng)基
[0071]組分母液
大量營養(yǎng)成分(20x)50 ml/L
微量營養(yǎng)成分(400χ)2.5 ml/L
有機物(400x)2.5 ml/L
Fe 鹽溶液(200x)5 ml/L
抗壞血酸0.1 g/L
蔗糖30 g/L pH 5.8
[0072]高壓滅菌115°C, 15min。
[0073]MS高滲培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基，其中C源為12%的蔗糖；
[0074]MS低滲培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基，其中C源為6%的蔗糖；
[0075]2)、基因槍轟擊
[0076]轟擊前將上述I獲得的幼胚愈傷組織集中置于含12%蔗糖的MS高滲培養(yǎng)基上，進行高滲處理12h (見圖3-B)，操作步驟如下:
[0077](I)打開超凈工作臺，用70%乙醇擦拭超凈工作臺和基因槍表面及內部，打開紫外燈，滅菌30min ；
[0078](2)將微彈載體、阻攔網等置于70%乙醇中l(wèi)min，放在濾紙片上吹干；
[0079](3)用移液器吸取10 μ L制備好的轟擊用微彈，均勻地涂在微彈載體的內圈，在超凈工作臺內吹干；
[0080](4)打開氦氣瓶閥門，調節(jié)壓力至1300psi ；
[0081](5)將易裂片置于異丙醇中浸泡，再放入相應的裝置內，安裝固定在基因槍內室的頂部；
[0082](6)阻攔網、微彈載體放入對應的裝置內，安裝固定好；
[0083](7)把培養(yǎng)皿放在托盤上，使幼胚愈傷組織集中對應于托盤中間的圓圈內，將托盤插入到數第一檔，打開皿蓋，管好倉門；
[0084](8)打開基因槍電源，打開真空泵，按下真空鍵(Vac)，當真空表讀數達到28mm Hg時，將按鍵置于Hold檔，按下射擊按鈕(Fire)直到射擊結束為止；
[0085](9)按下放氣鍵，待真空表讀數回零后，打開倉門，蓋上皿蓋，取出皿，旋開裝載易裂片的裝置，取出易裂片，旋開裝載微彈載體的裝置，取出微彈載體與阻攔網；
[0086](10)重復上述步驟((5)- (9))轟擊其它幼胚愈傷組織，直至完成所有材料。關閉基因槍、真空泵、氦氣瓶閥門，整理好儀器和材料，得到轟擊過的小麥胚愈傷組織。
[0087]3)轉基因后愈傷的再分化及再生苗的結實
[0088](I)、基因槍轉化后的恢復處理
[0089]基因槍轟擊結束之后，將轟擊過的小麥胚愈傷組織轉接到MS含6%的蔗糖的低滲培養(yǎng)基上，25°C光照16h，22°C黑暗8h恢復培養(yǎng)一周(見圖3C)。
[0090](2)、再分化和再生苗的結實[0091]a) —周后小麥胚愈傷組織轉接到MSNa5Ka5G25促進愈傷組織再分化，篩選陽性轉化體(見圖3-D)；
[0092]b) 一至兩周后，將長出綠色芽的愈傷組織，轉移到MSNa3G25培養(yǎng)基上25°C光照16h，22°C黑暗8h培養(yǎng)，促進外植體生根(見圖3E)；
[0093]c)當小苗長高后，轉移到含1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中生長，繼續(xù)促進生根壯苗(見圖 3F)；
[0094]d)小苗在培養(yǎng)瓶中根長得較長，苗長得較壯時，可將小苗移至含有滅菌的細沙與滅菌土 1:1混合的小花盆中生長，移苗前注意洗凈培養(yǎng)基和未分化的愈傷塊，移苗后注意保持高濕度，控制溫度在25°c以下(見圖3G)；
[0095]當小苗在小花盆中生長良好，可將小苗移至大的花盆或大田中生長(圖3H)，注意水肥管理，防治蚜蟲、小麥條銹、小麥葉銹等有害生物；小麥抽穗、開花，收獲種子，得到4株TO代轉P2小麥。
[0096]4、轉P2小麥的分子檢測
[0097]1) PCR 鑒定
[0098]CTAB法提取TO代轉P2小麥的葉片的基因組DNA為模板(50ng/μ 1)，以WY-50/WY-50為引物進行PCR檢測。
[0099]WY-50:5/ -TGACCACTGGATTACAAGCAGG-3'，與 Ρ2 蛋白基因片段的 63_84nt (RNA2的 966-987nt)對應，
[0100]WY-51:5 ' -ATCAGCAGTAGCGTTTCTGGCT-3 '，與 P2 蛋白基因片段的489-5IOnt (RNA2 的 1413_1392nt)互補。
[0101]結果如圖4所示，泳道2-8為TO代轉P2小麥，可以看到，得到448bp的PCR產物為陽性TO代轉P2小麥。
[0102]將該PCR產物經Pst I酶切，得到預期長度相符的長為408bp和40bp的兩條帶。
[0103]經過上述PCR和酶切鑒定，得到的4株TO代轉P2小麥均為PCR鑒定陽性TO代轉P2小麥。
[0104]將PCR鑒定陽性TO代轉P2小麥播種、培育，傳代，分別得到Tl-Tll代轉P2小麥。
[0105]從Tl代-11代，均按照上述方法進行PCR鑒定，結果得到448bp的PCR產物的均為陽性。Tll代轉P2小麥的PCR鑒定結果如圖5所示，I和2為空白對照，3_17為Tll代轉P2小麥，可以看到，得到 448bp的PCR產物為PCR鑒定陽性Tll代轉P2小麥。
[0106]2)、Southern blotting
[0107]1)轉印方法及裝置
[0108]本實驗使用真空轉印的方法，使用785真空轉印裝置(BIO-RAD，USA)完成。真空轉移是利用真空作用造成的經過凝膠的液流，凝膠中的DNA片段跟隨液流沉積在膜上。785真空轉印裝置能夠在低壓真空狀態(tài)下迅速的將DNA從瓊脂糖凝膠上轉印到尼龍膜上。
[0109]2)真空轉印
[0110]在裝有0.25N HCl的托盤中使膠脫嘌呤15min。使溶液沒過膠面并輕搖；去除鹽酸溶液，用去離子水沖洗兩次；0.5N NaOH溶液中使膠變性30min，使溶液沒過膠面并輕搖；通過堿轉法將膠轉移至堿性溶液中(0.5N NaOH, 1.5M NaCl),裁減好合適尺寸的轉移用膜和濾紙，按照真空轉印裝置說明裝置凝膠和XL膜(GE，USA)，保持5英寸汞柱的壓力，處理膠90min，結束后，尼龍膜晾干保存，繼而進入雜交步驟。
[0111]3)制備雜交用探針
[0112]以WY50/51為引物，用p34為模板，進行PCR擴增，得到448bp的片段為探針。取適量PCR鑒定陽性的Tll代轉P2小麥葉片的基因組DNA作為模板(25_50ng)，加入一定量的ddH20，混勻，于95-100°C加熱5-10min，冰上迅速冷卻；然后按下表2依次加入:
[0113]表2為雜交用探針所需體系
【權利要求】
1.如下1)-3)中任一種物質在調控植物抗病性中的應用: O蛋白P2 ； 2)編碼蛋白P2的DNA分子； 3)含有編碼蛋白P2的DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 所述蛋白P2的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述編碼蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 所述含有編碼蛋白P2的DNA分子的重組載體為將所述編碼蛋白P2的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白P2的重組載體。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述調控植物抗病性為提高植物抗病性。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于:所述病為小麥黃花葉病，所述小麥黃花葉病的病原菌為小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus)； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。
5.一種培育轉基因植物的方法，為將編碼蛋白P2的DNA分子導入目的植物中，得到轉基因植物；所述轉基因植物抗病性高于所述目的植物； 所述蛋白P2的氨基酸序列為`序列表中的序列2。
6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于:所述病為小麥黃花葉病,所述小麥黃花葉病的病原菌為小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus)； 所述編碼蛋白P2的DNA分子通過重組載體導入所述目的植物中； 所述編碼蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于: 所述重組載體為將所述編碼蛋白P2的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白P2的重組載體； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為小麥。
8.一種重組載體，為將編碼蛋白P2的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白P2的重組載體； 所述蛋白P2的氨基酸序列為序列表中的序列2。
9.根據權利要求8所述的重組載體，其特征在于:所述編碼蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I。
【文檔編號】A01H5/00GK103725708SQ201410014455
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權日:2014年1月13日
【發(fā)明者】于嘉林, 陳秀蘭, 何震天, 韓成貴, 李大偉, 張宗英, 董槿, 安家爽, 鄧新, 孫倩, 張容, 王建華, 王錦榮, 張永亮, 王穎, 王獻兵 申請人:中國農業(yè)大學