一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑的制作方法
【專利摘要】一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，由短短芽孢桿菌B-011（保藏號(hào)為CGMCCNo.7466）發(fā)酵液、滑石粉、木質(zhì)素磺酸鈣、DBS、CMC-Na、糊精及白炭黑按一定比例組成。制備的短短芽孢桿菌B-011可濕性粉劑在25℃室溫下芽孢含量為1.8×1010cfu/g、pH6.8、懸浮率76%、潤濕時(shí)間52s、細(xì)度通過率98%、粉劑（4±2）℃貯藏100d存活率達(dá)90%，對(duì)番茄早疫病具有防治作用，能有效降低化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的使用率，減少農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及有害生物綜合防治(IPM)的要求。
【專利說明】—種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥領(lǐng)域，具體涉及一種由內(nèi)生細(xì)菌短短芽孢桿菌B-Oll制成的可濕性粉劑。
【背景技術(shù)】
[0002]我國每年使用大量的化學(xué)農(nóng)藥制劑，極易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，生物富集，不僅污染生態(tài)環(huán)境，還影響人類的健康。而生物農(nóng)藥副作用小、對(duì)人無害，是一種具有廣闊前景的綠色農(nóng)藥，日益成為全球農(nóng)藥發(fā)展的一種趨勢。
[0003]近年來研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)許多植物病原生物具有良好的抑制作用，內(nèi)生細(xì)菌的研究已成為植物病害生物防治的一個(gè)研究熱點(diǎn)，尤其是開發(fā)活體微生物可濕性粉劑在現(xiàn)代農(nóng)藥制劑中有廣泛的適用范圍。
[0004]可濕性粉劑不僅提高了經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，又能保護(hù)生態(tài)環(huán)境。本文中的短短芽孢桿菌B-Oll對(duì)多種植物病原菌具有很好的抑菌效果，制備的內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll可濕性粉劑迄今文獻(xiàn)中未見研究報(bào)道，為開發(fā)短短芽孢桿菌可濕性粉劑的配方篩選奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，其能 有效降低化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的使用率，減少農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，所述可濕性粉劑由下列重量百分比的組分組成:短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液67-75%、滑石粉 9-11%、木質(zhì)素磺酸鈣 6-8%、DBS 1-3%, CMC-Na 1_3%、糊精 0.05-0.15% 及白炭黑 7.6-8.0%。
[0007]最佳的，所述可濕性粉劑由下列重量百分比的組分組成:短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液70%、滑石粉10%、木質(zhì)素磺酸鈣7%、DBS 3%、CMC-Na 2%、糊精0.1%及白炭黑7.9%。
[0008]上述提及的短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液是將短短芽孢桿菌CGMCC N0.7466的種子液(種子液的制備為現(xiàn)有常規(guī)技術(shù))以0.5-1.5%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麩皮15g.L-1、豆柏IOg.L—1、酵母膏3g.L—1、及氯化鈉7g.L-1)中，初始ρΗ5.5、28-34°C、120-180r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)48-60h得到；發(fā)酵液中的芽孢含量≥4.0 X 1011，芽孢率≥90%。
[0009]本發(fā)明的可濕性粉劑是將內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液與滑石粉按上述比例混合制成母液，鼓風(fēng)干燥(溫度設(shè)定60-80°C、時(shí)間為72h-80h)，研磨成母粉。在母粉中按比例添加木質(zhì)素磺酸鈣、DBS、CMC-Na、糊精及白炭黑，經(jīng)噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度170_175°C，出風(fēng)溫度55-60°C)制成。
[0010]本發(fā)明對(duì)從煙草植物組織中分離得到的內(nèi)生抗菌細(xì)菌-短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis) B-Oll 菌株(該菌株 B-011 已于申請(qǐng)?zhí)枮?201310194100.8、名稱為高效液相色譜法分離純化植物內(nèi)生細(xì)菌菌株抗菌肽的方法的申請(qǐng)中公開，保藏號(hào)為CGMCCN0.7466)進(jìn)行研究。通過對(duì)載體(如膨潤土、滑石粉、高嶺土、硅藻土及白炭黑)、助劑(潤濕劑和分散劑)(十二烷基苯磺酸鈉(DBS)、聚乙二醇(PEG8000)、吐溫-60、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣、及羧甲基纖維素鈉(CMC-Na))、穩(wěn)定劑(碳酸鈣、磷酸氫二鉀、及羧甲基纖維素鈉(CMC-Na))、保護(hù)劑(抗壞血酸(VC)、糊精及十二烷基苯磺酸鈉(SDS))的篩選，確定了內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll可濕性粉劑最佳配方。
[0011]按照中華人民共和國農(nóng)藥相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，制備的短短芽孢桿菌B-Oll可濕性粉劑在25°C室溫下芽孢含量為1.8X 101Qcfu/g、pH6.8、懸浮率76%、潤濕時(shí)間52s、細(xì)度通過率98%、粉劑(4±2) °C貯藏IOOd存活率達(dá)90%。本發(fā)明的可濕性粉劑對(duì)番茄早疫病菌菌絲及孢子均有致畸作用，對(duì)番茄早疫病具有防治作用，能有效降低化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的使用率，減少農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及有害生物綜合防治(IPM)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明可濕性粉劑貯藏期芽孢變化圖。
[0013]圖2是本發(fā)明的可濕性粉劑對(duì)番茄早疫病菌孢子萌發(fā)(40X )的影響圖。
[0014]其中:A表示經(jīng)本發(fā)明的可濕性粉劑處理的，B為對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液的制備
種子液制備:用接種環(huán)挑取斜面保存的B-Oll菌株，接入BPY液體培養(yǎng)基中，裝液量100ml/250ml，初始 pH6.8，30°C，搖床 180r/min 振蕩培養(yǎng) 24h。
[0016]發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以1% (V/V)接種量接入裝液量100mL/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)60h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。測得發(fā)酵液中，芽孢含量> 4.0X 1011，芽孢率
≥ 90%ο
[0017]實(shí)施例2
取67kg內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液與Ilkg滑石粉混合制成母液，60°C鼓風(fēng)干燥80h,研磨成粉,制成母粉，于該母粉中添加8kg木質(zhì)素磺酸韓、2.85kgDBS、3kgCMC-Na、0.15kg糊精及白炭黑8.0kg，經(jīng)噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度170°C，出風(fēng)溫度55°C)即得本發(fā)明的可濕性粉劑。
[0018]實(shí)施例3
取70kg內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液與IOkg滑石粉混合制成母液，70°C鼓風(fēng)干燥76h,研磨成粉,制成母粉,于該母粉中添加7kg木質(zhì)素磺酸H3kgDBS、2kgCMC-Na、0.1kg糊精及白炭黑7.9kg，經(jīng)噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度172°C，出風(fēng)溫度58°C)即得本發(fā)明的可濕性粉劑。
[0019]實(shí)施例4
取75kg內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液與9.2kg滑石粉混合制成母液，80°C鼓風(fēng)干燥72h,研磨成粉,制成母粉，于該母粉中添加6.1kg木質(zhì)素磺酸HlkgDBS、lkgCMC-Na、
0.05kg糊精及白炭黑7.65kg，經(jīng)噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度175°C，出風(fēng)溫度60°C)即得本發(fā)明的可濕性粉劑。
[0020]實(shí)施例5短短芽孢桿菌B-011可濕性粉劑穩(wěn)定性的測定
取100g將實(shí)施例3制得的內(nèi)生短短芽孢桿菌B-Oll可濕性粉劑置于(4±2)°C和室溫(25°C)條件下貯存，每IOd測定樣品的芽孢含量，測定11次，確定制劑貯存期間芽孢含量的變化。
[0021]本發(fā)明的可濕性粉劑在25°C室溫、(4±2) °C下貯存IOOd的芽孢含量變化見圖1。由圖1可知，本發(fā)明的制劑在室溫25°C下貯藏時(shí)的芽孢存活率明顯低于(4±2) °C時(shí)。本發(fā)明的制劑在(4±2) °C貯藏100d，其芽孢存活率可達(dá)90%，而在室溫貯藏100d，其芽孢存活率下降速度快，僅為70%。
[0022]實(shí)施例6本發(fā)明的可濕性粉劑對(duì)番茄早疫病菌孢子萌發(fā)的影響 番茄早疫病菌由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。
[0023]番茄早疫病菌孢子懸浮液的制備:將長滿番茄早疫病菌的PDA平板加入無菌水，將孢子洗下，血球板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，稀釋濃度為4.8X107cfu/mL備用。
[0024]I).取番茄早疫病菌孢子懸浮液加入等體積本發(fā)明的可濕性粉劑(10_2濃度)混勻，以加無菌水為對(duì)照，取1(^1^商加于玻片上，281:無菌保濕1211后觀察。取玻片中間及四周5個(gè)視野觀察孢子形態(tài)，并記錄孢子總數(shù)及萌發(fā)數(shù)。
[0025]孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù)X 100%。
[0026]由圖2可知，40X顯微鏡觀察，圖2B對(duì)照?qǐng)D中孢子菌長處細(xì)長，而經(jīng)本發(fā)明的可濕性粉劑處理后，番茄早疫病菌孢子萌發(fā)完全受到抑制，其萌發(fā)率為O。
[0027]2).取Ig本發(fā)明的可濕性粉劑，十倍稀釋法將該可濕性粉劑稀釋為不同濃度(10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8)。加入等體積番茄早疫病菌孢子懸浮液，取玻片中間及四周5個(gè)視野觀察孢子萌發(fā)情況，每處理3次重復(fù)。結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度本發(fā)明的可濕性粉劑處理后，番茄早疫病菌孢子萌發(fā)均有不同程度的受到抑制。當(dāng)濃度在大于10_3時(shí)，孢子完全被抑制，本發(fā)明可濕性粉劑對(duì)番茄早疫病菌孢子萌發(fā)MIC為10_3。當(dāng)濃度小于10_5時(shí)，孢子全部萌發(fā)。
[0028]由上可知，本發(fā)明的可濕性粉劑對(duì)番茄早疫病菌具有抑制作用，即對(duì)番茄早疫病具有防治作用。
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述可濕性粉劑由下列重量百分比的組分組成:短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液67-75%、滑石粉9-11%、木質(zhì)素磺酸鈣6_8%、DBS1-3%、CMC-Na 1_3%、糊精 0.05-0.15% 及白炭黑 7.6-8.0%。
2.如權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述可濕性粉劑由下列重量百分比的組分組成:短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液70%、滑石粉10%、木質(zhì)素磺酸鈣 7%、DBS 3%、CMC-Na 2%、糊精 0.1% 及白炭黑 7.9%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液中的芽孢含量≥4.0X IO110
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑，其特征在于，所述短短芽孢桿菌B-Oll發(fā)酵液制備時(shí)所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麩皮15g.L_\豆柏IOg.L_\酵母膏3g.L'及氯化鈉7g.L'
5.權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)生短短芽孢桿菌可濕性粉劑在制備防治番茄早疫病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK103704273SQ201410013801
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】易有金, 田 健, 李舒雯 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)