一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法，該方法的步驟如下：1.煙草幼苗培育準備；2.接種菌絲體的準備；3.煙草幼苗接種前處置；4.接種立枯病菌；5.接種后處置。本發(fā)明的優(yōu)點是：1）接種技術(shù)體系微型化，使用微小的幼苗，在很小的空間內(nèi)接種發(fā)病，耗用很短的試驗周期。2）實施過程簡單，操作方便效率高。3）全程在普通實驗室內(nèi)完成，發(fā)病局部條件容易控制，受干擾小，容易實現(xiàn)技術(shù)方法標準化。
【專利說明】一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)和生物技術(shù)。具體是一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]由病原真菌Rhizoctonia solani侵染引起的煙草立枯病是煙草生產(chǎn)的重要病害之一，主要在苗期發(fā)病，引起死苗，嚴重時造成一些田塊大量缺苗，近年在煙草成株期也常見發(fā)生，特別是一些高產(chǎn)栽培區(qū)，往往出現(xiàn)較高的發(fā)病率，由于在成株期該病害主要引起煙草植株的莖基部壞死，從而導(dǎo)致整株受害，造成較大的損失，這已成了生產(chǎn)上面臨的重要問題，要解決這個問題，仍然有賴于加強煙草立枯病的基礎(chǔ)研究，而人工發(fā)病又是該病害有關(guān)研究的基礎(chǔ)手段之一。由于長期以來對該病害的研究薄弱，至今還未形成規(guī)范和成熟的人工發(fā)病方法。雖然該病害主要危害煙株莖基部，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，立枯病菌也可以侵染煙草上部葉片引起清晰的壞死病斑，這個致病特性可在人工接種發(fā)病中加以利用，而至今未發(fā)現(xiàn)將煙草立枯病菌能侵染葉片致病的有利特性，在人工發(fā)病實踐中加以應(yīng)用并建立配套技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法，在短期內(nèi)完成人工發(fā)病工作。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
[0005]一種煙草立枯病人工 發(fā)病的快捷方法是利用立枯病菌可侵染煙草葉片引起組織壞死的特性，在培養(yǎng)皿內(nèi)接種幼小煙苗，導(dǎo)致煙苗葉片快速發(fā)病，表現(xiàn)清晰癥狀。人工發(fā)病方法的步驟如下:
[0006]1.煙草幼苗培育準備:
[0007]用普通的淺盤盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規(guī)方法在室內(nèi)培育煙苗，長至3~4片小葉片后備用。
[0008]2.接種菌絲體的準備:
[0009]將立枯病菌移植到PSA普通真菌培養(yǎng)基平板中心，PSA培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18克，水1000mL,在28°C條件下培養(yǎng)至長出較大菌落，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作接種體。
[0010]3.煙草幼苗接種前處置:
[0011]取步驟I育好的適用幼苗，接種前先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗。取出干凈的培養(yǎng)皿置于普通淺方盤內(nèi)，并往培養(yǎng)皿內(nèi)加入薄層清水；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉(zhuǎn)到其它容器盛裝的清水中，輕輕晃動洗脫幼苗根系上的土壤，將幼苗轉(zhuǎn)到上述備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，把小葉片架放于培養(yǎng)皿的皿緣上，根系靠在皿底上，使幼苗呈豎立狀態(tài)，并且使清水浸沒根系。
[0012]4.接種立枯病菌:[0013]挑取步驟2準備的菌絲塊，輕輕貼放于步驟3處置完畢的幼苗的心葉上或心芽上。
[0014]5.接種后處置:
[0015]步驟4操作完備后，將盛裝接種幼苗的培養(yǎng)皿放在淺方盤內(nèi)，并將有機玻璃罩罩在淺方盤上,往淺方盤內(nèi)注入薄層清水,使有機玻璃罩內(nèi)部封閉并形成罩內(nèi)穩(wěn)定的高濕狀態(tài)；然后將整套裝置放于具備日常散射光的普通室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在25~30°C。注意避開直射陽光照曬。
[0016]接種結(jié)果導(dǎo)致幼苗葉片出現(xiàn)水潰狀壞死，最后整個幼苗全部壞死腐爛。通常情況下，接種I天后可見明顯壞死表現(xiàn)，3~4天后全株腐爛。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0018]I)接種技術(shù)體系微型化，主要表現(xiàn)在用微小的幼苗，在很小的空間內(nèi)接種發(fā)病，耗用很短的試驗周期。
[0019]2)實施過程簡單，操作方便效率高。
[0020]3 )全程在普通實驗室內(nèi)完成，發(fā)病局部條件容易控制，受干擾小，容易實現(xiàn)技術(shù)方法標準化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明在普通實驗室內(nèi)培育的煙草幼苗示意圖。
[0022]圖中，A是用普通搪瓷方盤培育；B是用培養(yǎng)皿培育。
[0023]圖2是本發(fā)明的架放在培養(yǎng)皿皿緣上的幼苗及其接種菌絲塊后的示意圖。
[0024]圖3是本發(fā)明用有機玻璃罩將接種后的幼苗罩在淺方盤內(nèi)的示意圖。
[0025]圖4是本發(fā)明接種2天后的發(fā)病表現(xiàn)。
[0026]圖中，A~E是不同幼苗接種病菌的表現(xiàn)；F部是空白接種對照。
[0027]圖5是本發(fā)明接種3天后的發(fā)病表現(xiàn)。
[0028]圖中，A~E是接種病菌的發(fā)病表現(xiàn)，其中A示意多株幼苗的病情，B~E示意單株苗的表現(xiàn)；F是空白接種對照。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0030]本發(fā)明的煙苗培育和接種發(fā)病全程均在普通實驗室內(nèi)實施，實驗室只需要具備窗口向南，透光良好，并配備普通空調(diào)即行。按常規(guī)方法在室內(nèi)近窗口旁培育煙苗，本發(fā)明設(shè)計主要是采用較大的育苗盤統(tǒng)一大量育苗，如圖1的A所示，這可使得育苗護理(主要是澆水護理)相對簡單；幼苗大小適合使用之后，將幼苗移轉(zhuǎn)到另外的器具上實施接種操作；采用此方式育苗還有個好處，就是一般培育的煙苗生長通常是大小參差不齊，移苗到另處接種操作可以選擇大小一致的幼苗進行試驗；另外，移苗操作可以獲得無土狀態(tài)的幼苗，對于一些需要排除土壤干擾的試驗有利。實際應(yīng)用也可采用培養(yǎng)皿等器具育苗，如圖1的B所示；
[0031]接種所采用的是生長至3~4片小葉片的微小煙苗，如圖1的B部所示，通常只需要培育3~4周。接種操作是在普通培養(yǎng)皿內(nèi)實施，在幼苗輪生狀的小葉片中心接種病菌，如圖2所示。[0032]煙草立枯病菌侵染煙草發(fā)病的關(guān)鍵條件是需要環(huán)境處于高濕狀態(tài)，本發(fā)明采用自制玻璃罩罩住幼苗的方式，如圖3所示，提供穩(wěn)定的高濕條件，同時還便于發(fā)病過程觀察。
[0033]發(fā)病通常在接種點開始，表現(xiàn)為水潰狀壞死，如圖4所示，隨菌絲的蔓延，壞死斑快速向周圍擴展，最后整個幼苗都壞死腐爛，如圖5所示。通常情況下，接種I天后可見壞死斑出現(xiàn)，3~4天后全株壞死腐爛。
[0034]接種導(dǎo)致病情發(fā)展的快慢或輕重，與立枯病菌接種菌絲體菌齡狀態(tài)有關(guān)，也與接種后的培養(yǎng)溫度有關(guān)，病情輕重可以用壞死的最前沿點與接種點的距離、或壞死病斑面積、或株發(fā)病率等指標來衡量。
[0035]實施例1
[0036]一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草立枯病菌菌株Rs-1，按如下步驟操作:
[0037]1.煙草幼苗培育準備:用普通的搪瓷方盤內(nèi)盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規(guī)方法在室內(nèi)培育煙苗，長至如圖1的B所示的3~4片小葉片后備用。
[0038]2.接種菌絲體的準備:將立枯病菌移植到PSA培養(yǎng)基平板中心，PSA培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18克，水1000mL，28°C下培養(yǎng)48小時長出較大菌落，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作接種體。
[0039]3.煙草幼苗接種前處置:取步驟I育好的適用幼苗，接種前0.5~I小時先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗。取出干凈的9cm培養(yǎng)皿置于普通淺方盤內(nèi)，并往培養(yǎng)皿內(nèi)加入20ml清水；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉(zhuǎn)到其它容器盛裝的清水中，輕輕晃動洗脫幼苗根系上的土壤，將幼苗轉(zhuǎn)到上述備好的9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，把小葉片架放于培養(yǎng)皿的皿緣上，根系靠在皿底上，使幼苗呈豎立狀態(tài)，并且皿內(nèi)清水浸沒根系。
[0040]4.接種立枯病菌:挑取步驟2準備的菌絲塊，輕輕貼放于步驟3處置完畢的幼苗的心葉上或心芽上，完備后如圖2所示。
[0041]5.接種后處置:步驟4操作完備后，取自制有機玻璃罩將盛裝接種幼苗的培養(yǎng)皿罩在淺方盤上，往淺方盤內(nèi)注入薄層清水，使玻璃罩內(nèi)部封閉并形成罩內(nèi)穩(wěn)定的高濕狀態(tài)，如圖3所示；然后將整套裝置放于具備日常散射光的普通室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在25~27V。注意避開直射陽光照曬。
[0042]結(jié)果表現(xiàn)出如圖3和圖4 一樣清晰的葉片壞死癥狀；接種48小時后壞死的最前沿點與接種點的距離2.1cm0
[0043]實施例2
[0044]—種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草立枯病菌菌株Rs-Ι，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。其中在步驟5的操作的與實施例I步驟5的操作有變化，實施例1的步驟5)接種后培養(yǎng)溫度維持在25~27°C，而本實施例的步驟5)接種后培養(yǎng)溫度維持在19~20°C。結(jié)果也表現(xiàn)出如圖3和圖4 一樣清晰的葉片壞死癥狀；接種48小時后壞死的最前沿點與接種點的距離0.6cm。
[0045]實施例3
[0046]—種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法，在煙草品種云煙87微小幼苗上接種煙草立枯病菌菌株Rs-Ι，按實施例1的步驟I至步驟5操作實施。其中在步驟2)的操作的與實施例I步驟2)的操作有變化，實施例1的步驟2)接種體菌絲的培養(yǎng)時長為48小時，本實施例的步驟2)接種體菌絲的培養(yǎng)時長為96小時。結(jié)果同樣表現(xiàn)出如圖3~圖5 —樣清晰的葉片壞死癥狀，但病斑擴大速 度比實施例1的速度慢，接種48小時后壞死的最前沿點與接種點的距離0.8cm。
【權(quán)利要求】
1.一種煙草立枯病人工發(fā)病的快捷方法，其特征在于，利用立枯病菌可侵染煙草葉片引起組織壞死的特性，在培養(yǎng)皿內(nèi)接種幼小煙苗，導(dǎo)致煙苗葉片快速發(fā)病，表現(xiàn)清晰癥狀； 方法的步驟如下: 1)煙草幼苗培育準備: 用普通的淺盤盛裝肥力較好且疏松的土壤，用常規(guī)方法在室內(nèi)培育煙苗，長至3~4片小葉片后備用； 2)接種菌絲體的準備: 將立枯病菌移植到PSA普通真菌培養(yǎng)基平板中心，PSA培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200克，蔗糖20克，瓊脂18克，水1000mL,在28°C條件下培養(yǎng)至長出較大菌落，取直徑為6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌絲瓊脂圓塊，以此菌絲塊作接種體； 3)煙草幼苗接種前處置: 取步驟I)育好的適用幼苗，接種前先澆水濕潤軟化育苗土壤，以便于拔苗，取出干凈的培養(yǎng)皿置于普通淺方盤內(nèi)，并往培養(yǎng)皿內(nèi)加入薄層清水；選取有3~4片小葉片的幼苗，用手輕輕拔起并轉(zhuǎn)到其它容器盛裝的清水中，輕輕晃動洗脫幼苗根系上的土壤，將幼苗轉(zhuǎn)到上述備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，把小葉片架放于培養(yǎng)皿的皿緣上，根系靠在皿底上，使幼苗呈豎立狀態(tài)，并且使清水浸沒根系； 4)接種立枯病菌: 挑取步驟2)準備的菌絲塊，輕輕貼放于步驟3)處置完畢的幼苗的心葉上或心芽上； 5)接種后處置: 步驟4)操作完備后，將盛裝接種幼苗的培養(yǎng)皿放在淺方盤內(nèi)，并將有機玻璃罩罩在淺方盤上,往淺方盤內(nèi)注入薄層清水,使有機玻璃罩內(nèi)部封閉并形成罩內(nèi)穩(wěn)定的高濕狀態(tài)；然后將整套裝置放于具備日常散射光的普通室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在25~30°C，注意避開直射陽光照曬； 接種結(jié)果導(dǎo)致幼苗葉片出現(xiàn)水潰狀壞死，最后整個幼苗全部壞死腐爛。通常情況下，接種I天后可見明顯壞死表現(xiàn)，3~4天后全株腐爛。
【文檔編號】A01G7/06GK103782816SQ201410006422
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】張君成, 熊英, 黃柳, 譚金樂, 陳江凝 申請人:廣西大學(xué)