具有高種子生產(chǎn)力的環(huán)境應(yīng)激抗性植物及生成該植物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有對環(huán)境應(yīng)激的高抗性和高種子生產(chǎn)力的植物，更具體地，涉及一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其被遺傳修飾為過表達(dá)多腺苷酸結(jié)合蛋白(PABN)基因且具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性和增強(qiáng)的種子生產(chǎn)力。
【專利說明】具有高種子生產(chǎn)力的環(huán)境應(yīng)激抗性植物及生成該植物的方 法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有高環(huán)境應(yīng)激抗性和高種子生產(chǎn)力的植物，以及生成該植物的 方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 干旱或鹽引起的環(huán)境應(yīng)激顯著影響植物生長。還有，冷凍應(yīng)激導(dǎo)致植物中的嚴(yán)重 細(xì)胞損傷。結(jié)果，這類環(huán)境應(yīng)激顯著影響著作物生產(chǎn)力（productivity)。因此，已進(jìn)行了多 種類型的致力于賦予作物以環(huán)境應(yīng)激抗性的研究和開發(fā)。
[0004] 最近數(shù)年來，經(jīng)由植物轉(zhuǎn)化技術(shù)生成了其中導(dǎo)入多種基因的轉(zhuǎn)基因植物。例如，報(bào) 道了其中導(dǎo)入合成氨基酸脯氨酸的酶基因的植物變得對干旱或鹽應(yīng)激耐受，這是因?yàn)橛筛?氨酸提供的滲透調(diào)節(jié)功能（非專利文獻(xiàn)1)。還報(bào)道了通過導(dǎo)入調(diào)節(jié)應(yīng)激應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子。 還報(bào)道了通過導(dǎo)入調(diào)節(jié)應(yīng)激應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子基因可以激活應(yīng)激應(yīng)答，而且可對植物賦予干 旱、鹽和低溫應(yīng)激抗性（非專利文獻(xiàn)2)。披露了通過過表達(dá)編碼RNA結(jié)合蛋白的基因，可以 進(jìn)一步生成具有低溫應(yīng)激抗性的轉(zhuǎn)基因植物（專利文獻(xiàn)1)。
[0005] 然而，轉(zhuǎn)錄因子基因的過表達(dá)導(dǎo)致由該轉(zhuǎn)錄因子基因誘導(dǎo)的所有基因的過表達(dá)。 結(jié)果，即使所得植物獲得環(huán)境應(yīng)激抗性，有時(shí)也會(huì)觀察到對生長的不利影響（例如植物矮 ?。ǚ菍＠墨I(xiàn)3)。因此，期待發(fā)現(xiàn)賦予環(huán)境應(yīng)激抗性且不因其過表達(dá)而導(dǎo)致不利影響的 新基因以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)技術(shù)中的改進(jìn)。
[0006] 世界范圍內(nèi)的許多人以谷物作為主食，改進(jìn)其生產(chǎn)力是一項(xiàng)至關(guān)重要的目的。已 進(jìn)行了對谷物植物賦予環(huán)境應(yīng)激抗性的嘗試，但還期望開發(fā)出除了環(huán)境應(yīng)激抗性以外還具 有高生產(chǎn)力的谷物植物。
[0007] 引用列表
[0008] 專利文獻(xiàn)
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[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明要解決的問題
[0016] 本發(fā)明的根本問題是提供具有高環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力的植物。
[0017] 用于解決問題的手段
[0018] 發(fā)明人進(jìn)行了大量研究以解決上述問題。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)了通過將PABN基因?qū)?植物中能有效地增強(qiáng)環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力兩者。這導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
[0019] 具體地，本發(fā)明包括以下項(xiàng)。
[0020] [1] 一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性和增強(qiáng)的種子生產(chǎn)力，該植物被 遺傳修飾為過表達(dá)多腺苷酸結(jié)合蛋白（polyadenylate-binding protein, PABN)基因。
[0021] [2]依照[1]的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其中已經(jīng)導(dǎo)入以下PABN基因（a)至（f)的至少一種：
[0022] (a)包含如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列的基因；
[0023] (b)包含在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列組成的DNA 雜交的DNA且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因；
[0024] (c)編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸 序列；
[0025] (d)編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含自如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基 酸序列通過缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活 性；
[0026] (e)包含與如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列有85%或更高同一性的核 苷酸序列且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因；和
[0027] (f)編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含與如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基 酸序列有90%或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性。
[0028] [3]依照[1]或[2]的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其中所述環(huán)境應(yīng)激抗性是鹽應(yīng)激抗性、干旱 應(yīng)激抗性、和/或冷凍應(yīng)激抗性。
[0029] [4].依照[1]至[3]中任一項(xiàng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其為谷物植物或含油種子植物。
[0030] [5] -種用于增強(qiáng)植物的環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力兩者的方法，包括將多腺苷 酸結(jié)合蛋白（PABN)基因?qū)胫参锛?xì)胞中并選擇其中環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力得到增強(qiáng) 的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。
[0031] 6.依照[5]的方法，其中所示PABN基因是以下（a)至（f)的至少一種：
[0032] (a)包含如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列的基因；
[0033] (b)包含在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列組成的DNA 雜交的DNA且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因；
[0034] (c)編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸 序列；
[0035] (d)編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含自如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基 酸序列通過缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活 性；
[0036] (e)包含與如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列有85%或更高同一性的核 苷酸序列且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因；和
[0037] (f)編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含與如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基 酸序列有90%或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性。
[0038] [7]依照[5]或[6]的方法，其中所述環(huán)境應(yīng)激抗性是鹽應(yīng)激抗性、干旱應(yīng)激抗性、 和/或冷凍應(yīng)激抗性。
[0039] [8].依照[5]至[7]中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物為谷物植物或含油種子植物。
[0040] 本說明書包括在日本專利申請No. 2012-052018中披露的內(nèi)容，本申請要求對其 的優(yōu)先權(quán)。
[0041] 本發(fā)明的效果
[0042] 本發(fā)明能提供具有商環(huán)境應(yīng)激抗性和商種子生廣力的植物。
[0043] 附圖簡述
[0044] 圖1顯示了在高鹽濃度生長的導(dǎo)入AtPABN的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥（Arabidopsis thaliana)(即PABN過表達(dá)植物）和野生型株的關(guān)于鹽應(yīng)激抗性的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖IA顯示 野生型株的結(jié)果而圖IB顯示PABN過表達(dá)植物的結(jié)果。
[0045] 圖2顯示了在干旱條件下生長的導(dǎo)入AtPABN的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥（即PABN過表達(dá)植 物）和野生型株的關(guān)于干旱應(yīng)激抗性的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2A顯示野生型株的結(jié)果而圖2B顯 示PABN過表達(dá)植物的結(jié)果。
[0046] 圖3顯示了在冷凍條件下生長的導(dǎo)入AtPABN的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥（即PABN過表達(dá)植 物）和野生型株的關(guān)于冷凍應(yīng)激抗性的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖3A顯示野生型株的結(jié)果而圖3B顯 示PABN過表達(dá)植物的結(jié)果。
[0047] 圖4顯示的圖指示從導(dǎo)入AtPABN的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥（即PABN過表達(dá)植物）和野生 型株獲得的每個(gè)植物的種子數(shù)（種子生產(chǎn)力）。左邊條顯示野生型株的結(jié)果而右邊條顯示 PABN過表達(dá)植物的結(jié)果。
[0048] 圖5顯示的照片顯示了導(dǎo)入AtPABN的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥植物（即PABN過表達(dá)植物） 和野生型株的外觀。
[0049] 圖6顯示用于土壤桿菌（Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的載體的結(jié)構(gòu)，該載體包含小麥 PABN 基因 （TaPABNl 或 TaPABN2 基因）。
[0050] 圖7顯示的圖指示導(dǎo)入TaPABN-過表達(dá)植物（1\代）中的基因的表達(dá)分析 (RT-PCR)的結(jié)果。
[0051] 圖8顯示的圖指示TaPABN-過表達(dá)植物（T1代）的關(guān)于鹽應(yīng)激抗性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0052] 發(fā)明詳述
[0053] 用于實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案
[0054] 下文詳細(xì)描述了本發(fā)明。
[0055] 1.本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物及其生成
[0056] 本發(fā)明涉及一種經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其被遺傳修飾為過表達(dá)PABN基因。依照本發(fā)明的經(jīng) 轉(zhuǎn)化植物具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力。
[0057] 依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物可以包含導(dǎo)入植物中的PABN基因。這類經(jīng)轉(zhuǎn)化植物 亦稱為轉(zhuǎn)基因植物。
[0058] DPABN基因及其產(chǎn)生
[0059] PABN基因編碼多腺苷酸結(jié)合蛋白（PABN)。在本發(fā)明中，PABN基因可以是擬南芥 PABN基因（AtPABN基因；亦稱為"AtPABNl")，或者它可以編碼來自另一植物物種的PABN 且對應(yīng)于AtPABN基因的基因。例如，PABN基因可以來自小麥。在本發(fā)明中，PABN基因還 可以是那些基因中任一個(gè)的變體。本發(fā)明中使用的PABN基因可以自多種生物來源的任一 種分離，所述生物包括植物、動(dòng)物、細(xì)菌和真菌。例如，PABN基因優(yōu)選來自谷物植物（grain plant)或產(chǎn)油種子植物。
[0060] 一個(gè)來自擬南芥的PABN基因（即AtPABN基因）的例子是包含如SEQ ID NO: 1中 所示核苷酸序列的基因。如SEQ ID NO: 1中所示核苷酸序列編碼包含如SEQ ID N0:2中所 示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0061] 一個(gè)來自小麥的PABN基因的例子是包含如SEQ ID N0:3或5中所示核苷酸序列 的基因。如SEQ ID N0:3中所示核苷酸序列編碼包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的 蛋白質(zhì)，而如SEQ ID N0:5中所示核苷酸序列編碼包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列 的蛋白質(zhì)。
[0062] 進(jìn)一步地，依照本發(fā)明的PABN基因可以是包含在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 1，3 或5中所示的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的 基因。
[0063] 依照本發(fā)明的PABN基因可以是編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸序列?；蛘?，該基因可以是編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì) 包含自如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸序列通過缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)（2至 9,優(yōu)選2至5)氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性。
[0064] 或者，依照本發(fā)明的PABN基因可以是包含與如SEQ ID N0:l，3或5中所示的核 苷酸序列有85 %或更高，優(yōu)選90 %或更高，更優(yōu)選95 %或更高，且特別優(yōu)選98 %或更高 (例如99%或更高）同一性的核苷酸序列且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因。 還有，依照本發(fā)明的PABN基因可以是編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含與如SEQ ID NO: 2,4或6中所示的氨基酸序列有至少90%或更高，優(yōu)選95 %或更高，更優(yōu)選97 %或更 高，且進(jìn)一步優(yōu)選98%或更高（例如99%或更高）同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié) 合活性。
[0065] 依照本發(fā)明，術(shù)語"嚴(yán)格條件"指以下條件，在該條件下彼此具有至少85%或更高， 優(yōu)選90%或更高，更優(yōu)選95%或更高，且特別優(yōu)選98%或更高（例如99%或更高）序列 同一性的兩個(gè)核酸之間形成特異性核酸雜交體，而具有比上述水平低的水平的同一性的核 酸之間不形成雜交。更具體地，例如在嚴(yán)格條件下，反應(yīng)條件包括15至750mM，優(yōu)選50至 750mM，且更優(yōu)選300至750mM的鈉鹽濃度；25°C至70°C，且更優(yōu)選55°C至65°C的溫度；和 甲酰胺濃度為〇 %至50%，且更優(yōu)選35 %至45%。在嚴(yán)格條件下，在雜交后，優(yōu)選以15至 600mM，優(yōu)選50至600mM，且更優(yōu)選300至600mM的鈉鹽濃度；和在50°C至70°C，優(yōu)選55°C 至70°C，更優(yōu)選60°C至65°C的溫度清洗濾紙（filter)。
[0066] 術(shù)語"基因"用于本文可以指DNA或RNA。DNA的例子包括基因組DNA和cDNA，而 RNA涵蓋mRNA等。依照本發(fā)明的PABN基因除了 PABN基因的開放閱讀框的序列以外，還可 以包含不翻譯區(qū)（UTR)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的序列。
[0067] 依照本發(fā)明的PABN基因是否編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)可通過將包含 其中摻入的這類基因的表達(dá)載體在合適的宿主中表達(dá)并檢查所表達(dá)蛋白質(zhì)的多腺苷酸結(jié) 合活性來確定。可依照常規(guī)技術(shù)來檢查蛋白質(zhì)的多腺苷酸結(jié)合活性。一個(gè)具體的例子是 用于檢測RI標(biāo)記的多核苷酸的結(jié)合的技術(shù)（Sachs, A.B.和R.D. Kornberg, 1985, Nuclear Polyadenylate-Binding Protein, Mol. Cell. Biol. , 5:1993-1996)〇
[0068] 依照常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序 列或已知的PABN基因序列從自細(xì)胞提取的基因組DNA或RNA (包括mRNA)獲得依照本發(fā)明 的PABN基因。
[0069] 例如，將通過常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)從mRNA (依照常規(guī)技術(shù)從生物體的組織或細(xì)胞（例 如植物葉）提?。┖铣傻腸DNA用作模板，使用基于已知PABN基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引 物實(shí)施PCR擴(kuò)增。如此，可以獲得包含PABN基因的DNA片段。
[0070] 可以經(jīng)由例如定點(diǎn)誘變修飾包含PABN基因的所得DNA片段的核苷酸序列?？梢?通過已知技術(shù)，如Kunkel方法或Gapped雙鏈體方法，或與其等同的技術(shù)將突變引入DNA。 誘變可使用定點(diǎn)誘變試劑盒，如Mutaif-Super Express試劑盒（TAKARA BIO INC.)或LA PCR? in vitro Mutagenesis Series 試劑盒（TAKARA BIO INC.)實(shí)施。
[0071] 可依照常規(guī)技術(shù)將如上文描述地獲得的包含PABN基因的DNA片段克隆到載體中。 當(dāng)將PABN基因通過土壤桿菌方法導(dǎo)入植物中時(shí)，優(yōu)選將PABN基因克隆到基于土壤桿菌衍 生的質(zhì)粒的載體（例如二元載體）中，該載體能經(jīng)由土壤桿菌將靶基因?qū)胫参?。?yōu)選使 用的載體的例子包括基于pBI、pPZP和pSM的載體。尤其優(yōu)選使用基于pBI的二元載體 或中間載體，且例子包括PBI121、pBIIOUpBI 101. 2和pBI 101. 3載體。二元載體是能在大 腸桿菌（Escherichia coli)和土壤桿菌中復(fù)制的穿梭載體。通過用攜帶二元載體的土壤 桿菌細(xì)菌來感染植物，可將夾在載體的LB序列和RB序列（邊界序列）之間的DNA區(qū)（即 T-DNA)納入植物基因組（EMBO Journal, 10 (3) ,697-704, 1991)。當(dāng)使用二元載體質(zhì)粒時(shí)， 可將PABN基因插入_兀載體的LB序列和RB序列之間的位點(diǎn)中?；蛘撸蓪ABN基因慘 入基于PUC的載體如pUC18、pUC19或pUC9載體中以直接將靶基因?qū)胫参?。還可以使用 植物病毒載體，如花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus) (CaMV)、菜豆金黃花葉病 毒（Bean golden mosaic virus) (BGMV)、或煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus) (TMV)。
[0072] 為了將PABN基因插入載體中，例如首先將純化的DNA用適宜的限制酶切割，并插 入適宜的載體DNA的限制酶位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)中，與該載體連接。需要PABN基因以使得該 基因在靶植物中過表達(dá)的方式納入載體中。為此，優(yōu)選將PABN基因在載體中啟動(dòng)子或增強(qiáng) 子的下游摻入。
[0073] 對于"啟動(dòng)子"，可以使用任何具有調(diào)控其下游基因在植物細(xì)胞中表達(dá)的功能的啟 動(dòng)子。例如，啟動(dòng)子可以以特異于植物的特定組織或特定發(fā)育階段的方式誘導(dǎo)表達(dá)（即組 織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子），它可以恒定地誘導(dǎo)在任何植物組織中在任意 發(fā)育階段的表達(dá)（即組成型啟動(dòng)子），或者它可以在特定誘導(dǎo)物的存在下誘導(dǎo)表達(dá)（即誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子）。啟動(dòng)子可以源自或不源自植物。特定的例子包括花椰菜花葉病毒（CaMV)35S 啟動(dòng)子、胭脂堿合酶基因啟動(dòng)子（Pnos)、玉米來源的遍在蛋白啟動(dòng)子、稻來源的肌動(dòng)蛋白啟 動(dòng)子、和煙草來源的PR蛋白啟動(dòng)子。增強(qiáng)子的一個(gè)例子是用于改進(jìn)靶基因的表達(dá)效率的增 強(qiáng)子區(qū)且包含CaMV35S啟動(dòng)子中的上游序列。
[0074] 除了 PABN基因以外，載體還優(yōu)選包含終止子、多A添加信號、5'-UTR序列、標(biāo)志基 因等?？梢允褂媒K止子，其為終止由啟動(dòng)子誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的序列。其例子包括胭脂堿合 酶（NOS)基因終止子、章魚堿合酶（OCS)基因終止子、和CaMV 35S RNA基因終止子。標(biāo)志 基因的例子包括卡那霉素抗性基因、艮他霉素抗性基因、萬古霉素抗性基因、新霉素抗性基 因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、zeocin抗性基因、殺稻瘟素抗性基因、二氫葉酸還 原酶基因和氨芐青霉素抗性基因。
[0075] 2)生成被遺傳修飾為過表達(dá)PABN基因的植物
[0076] 在本發(fā)明中，可通過將上文獲得的PABN基因?qū)胫参镆援a(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化植物來生成 被遺傳修飾為過表達(dá)PABN基因的植物?；蛘撸诒景l(fā)明中，可將增強(qiáng)內(nèi)源性PABN基因在植 物中表達(dá)的突變引入植物的基因組中。例如，可將會(huì)誘導(dǎo)更高水平表達(dá)的突變引入植物中 內(nèi)源性PABN基因的啟動(dòng)子中。
[0077] 在本發(fā)明中，其中要過表達(dá)PABN基因的植物可以是單子葉或雙子葉植物。單子 葉植物的例子包括但不限于，屬于禾本科（Gramineae)的植物如稻、大麥、小麥、玉米、甘 鹿、結(jié)縷草、高梁、小米（Setaria italica)、和紫穗稗（Echinochloa esculenta);百合 科（Liliaceae)如蘆輿（Asparagus officinalis)、百合屬植物（Lilium)、洋蔥（Allium cepa)、Mk菜（Allium tuberosum)和 Etythronium japonicum ;和姜科（Zingiberaceae) 如生姜（Zingiber officinale)、囊荷（Zingiber mioga)和姜黃（Curcuma longa)。雙 子葉植物的例子包括但不限于，屬于十字花科（Brassicaceae)的植物如擬南芥、甘藍(lán) (Brassica oleracea)、油菜（rapeseed)、花挪菜（cauliflower)、挪菜（broccoli)和 日本蘿卜（Japanese radish);爺科（Solanaceae)如番爺、爺子、馬鈴薯和煙草；豆科 (Leguminosae)如大豆、豌豆、菜豆（bean)和苜猜（alfalfa);葫蘆科（Cucurbitaceae) 如黃瓜、西瓜（melon)和南瓜；傘形科（Umbelliferae)如胡蘿卜、療菜和鴨兒療 (Cryptotaenia japonica);菊科（Compositae)如萵苣；錦葵科（Malvaceae)如棉花和秋 葵；藜科（Chenopodiaceae)如甜菜和菠菜；桃金娘科（Myrtaceae)如桉樹和丁香；以及楊 柳科（Salicaceae)如楊樹。由于依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物具有改進(jìn)的種子生產(chǎn)力，本發(fā)明 中另外還優(yōu)選使用谷物植物或含油種子植物作為其中要過表達(dá)PABN基因的植物。在本發(fā) 明中，術(shù)語"谷物植物"指產(chǎn)生可食用種子的植物，且這類植物通常屬于禾本科。谷物植物 的例子包括小麥、大麥、黑麥等，以及稻和玉米。術(shù)語"含油種子植物"指產(chǎn)生含油種子，即 具有高油和脂肪含量且用作生產(chǎn)油的起始材料的種子的植物。含油種子植物的例子包括油 菜、芝麻、大豆、花生、紅花和棉花。
[0078] 可通過通用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)將PABN基因?qū)胫参镏?，所述技術(shù)包括土壤桿菌方 法、顆粒槍方法（particle gun method)、電穿孔、聚乙二醇（PEG)方法、微注射和原生質(zhì) 體融合方法。這些植物轉(zhuǎn)化技術(shù)詳細(xì)記載于普通教科書，如"New Edition, Experimental Protocols for Model Plants,Genetic Techniques to Genomic Analysis"(在 Isao Shimamoto 和 Kiyotaka Okada 的監(jiān)督下，2001Shujunsha Co. ,Ltd.)和文獻(xiàn) 如 Hiei Y.等，''Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. ''Plant J. ,1994,6,271-282,以及 Hayashimoto, A.等，"A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.，"Plant Physiol.，1990, 93, 857-863。
[0079] 在使用土壤桿菌方法的情況中，可將PABN基因摻入適用于土壤桿菌方法的載體 中，可依照常規(guī)技術(shù)（例如凍融）將所得植物表達(dá)載體導(dǎo)入適宜的土壤桿菌菌株（例如根 癌土壤桿菌（agrobacterium tumefaciens))，并且可將所得細(xì)菌菌株接種到植物中用于感 染。如此，可將PABN基因摻入植物細(xì)胞基因組中。
[0080] 土壤桿菌方法的例子包括多種技術(shù)，如將土壤桿菌細(xì)菌接種到原生質(zhì)體中，其接 種到組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中，或其直接接種到植物中（即植物內(nèi)（in planta)方法）。當(dāng)使用 原生質(zhì)體時(shí)，可通過以下方法將原生質(zhì)體用土壤桿菌感染，該方法牽涉與包含Ti質(zhì)粒的土 壤桿菌細(xì)菌共培養(yǎng)或該方法牽涉與原生質(zhì)球土壤桿菌細(xì)菌的融合（即原生質(zhì)球方法）。當(dāng) 使用組織或細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，可將靶植物的無菌培養(yǎng)的葉切片（葉盤）或愈傷組織用土壤桿 菌感染。依照植物內(nèi)方法，可將土壤桿菌直接接種到植物的種子或部分（例如芽）中以感 染植物。
[0081] 生長用土壤桿菌感染的植物（在感染愈傷組織等的情況中，通過常規(guī)技術(shù)來再生 植物）以產(chǎn)生種子，收集所得種子，并對從其獲得的植物進(jìn)行兩次或更多次自交。然后，通 過選擇純合形式的攜帶PABN基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，可以獲得包含其中導(dǎo)入的PABN基因的經(jīng) 轉(zhuǎn)化植物。
[0082] 或者，當(dāng)通過顆粒槍方法將基因?qū)胫参镏袝r(shí)，例如依照制造商指示使用基因轉(zhuǎn) 移裝置（例如roS-1000, BI0-RAD)以將用包含PABN基因的DNA片段包被的金屬顆粒轟擊 到樣品中，由此將該基因?qū)胫参锛?xì)胞中以獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的目的細(xì)胞。一般地，轟擊優(yōu)選以約 450psi至2, OOOpsi的壓強(qiáng)，在離靶物約4cm至12cm的距離實(shí)施。依照常規(guī)植物組織培養(yǎng) 技術(shù)在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)其中已導(dǎo)入PABN基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在再分化培養(yǎng)基（含有植物 激素，如生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯或蕓苔素，以適宜的濃度）中培養(yǎng)存活 的細(xì)胞。如此，可以再生其中已導(dǎo)入PABN基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。
[0083] 優(yōu)選將導(dǎo)入的PABN基因摻入依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的植物基因組中?；蛘撸?述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物可以攜帶PABN基因，例如以包含其的表達(dá)載體。
[0084] 還優(yōu)選確認(rèn)導(dǎo)入的PABN基因在一般條件（例如在25°C )下在所得經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中 表達(dá)。
[0085] 在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"經(jīng)轉(zhuǎn)化植物"涵蓋"?；代"，其為通過用土壤桿菌感染經(jīng) 由轉(zhuǎn)化處理獲得的剛再分化的植物，而且還涵蓋"?\代"，其為從T tl代植物的種子生長的子 代；"Τ2代"和其進(jìn)一步的后代植物。
[0086] 依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物可以包含以雜合形式或優(yōu)選以純合形式導(dǎo)入其基因組 中的PABN基因。依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物還涵蓋其中PABN基因?qū)胫参锏膬H一些細(xì)胞中 的植物（即嵌合植物）。然而，更優(yōu)選經(jīng)轉(zhuǎn)化植物在所有植物細(xì)胞中均攜帶導(dǎo)入的PABN基 因。
[0087] 本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物指以下任一種：全植物、植物器官（如根、莖、葉、花瓣、種子 或果實(shí)）、植物組織（如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部或維管束）、和培養(yǎng)的植物細(xì)胞（如 愈傷組織）。
[0088] 在如上文描述地已導(dǎo)入PABN基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中，所述PABN基因是過表達(dá)的。術(shù) 語"ΡΑΒΝ基因的過表達(dá)"用于本文意指PABN基因表達(dá)水平被檢測為顯著超過相應(yīng)植物的野 生型株中的內(nèi)源性PABN基因的表達(dá)水平。例如，當(dāng)在來自經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的生物樣品的蛋白質(zhì) 提取物中測量的多腺苷酸結(jié)合活性顯著高于在來自未經(jīng)轉(zhuǎn)化植物生物樣品的蛋白質(zhì)提取 物中的多腺苷酸結(jié)合活性時(shí)，確定PABN基因是過表達(dá)的。
[0089] 如上文描述所獲得的被遺傳修飾為過表達(dá)PABN基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物（通常為其中 導(dǎo)入PABN基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物）具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性和增強(qiáng)的種子生產(chǎn)力。
[0090] 2.評估環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力
[0091] 依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性。具體地，依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn) 化植物優(yōu)選具有以下至少一種：鹽應(yīng)激抗性、干旱應(yīng)激抗性和冷凍應(yīng)激抗性。
[0092] 鹽應(yīng)激抗性是使得植物甚至在高鹽濃度能以更高生存力生長的能力。鹽應(yīng)激抗性 可通過，例如以高濃度（例如，在未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物不能生存或其將以低于5%的生存率存活 的高鹽濃度）向培養(yǎng)基中添加鹽，使植物生長達(dá)給定的時(shí)間段，然后測定植物的生存率來 評估。例如，可將植物在用NaCl (200mM)補(bǔ)充的MS培養(yǎng)基中生長一周，然后測定其生存率。 依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物在鹽應(yīng)激條件下能以比未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物優(yōu)選高5%或更高，更優(yōu) 選高10 %或更高，進(jìn)一步優(yōu)選高30 %或更高，仍進(jìn)一步優(yōu)選高50 %或更高（例如60 %或更 高）的生存率存活，盡管生存率不限于上述水平。
[0093] 干旱應(yīng)激抗性是使得植物甚至在低水分含量的情況下能以更高生存力生長的能 力。干旱應(yīng)激抗性可通過，例如降低培養(yǎng)基中的水分含量（例如，通過將水分含量降低至未 經(jīng)轉(zhuǎn)化植物不能生存或其將以低于5%的生存率存活的水平），使植物生長達(dá)給定的時(shí)間 段，然后測定植物的生存率來評估。依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物在干旱應(yīng)激條件下能以比未 經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物優(yōu)選高5 %或更高，更優(yōu)選高10 %或更高，進(jìn)一步優(yōu)選高30 %或更高，仍進(jìn)一 步優(yōu)選高50%或更高（例如70%或更高）的生存率存活，盡管生存率不限于上述水平。
[0094] 冷凍應(yīng)激抗性是使得植物甚至在冷凍溫度也能以更高生存力生長的能力。冷凍應(yīng) 激抗性可通過，例如降低培養(yǎng)溫度至低于〇°C (例如，通過將培養(yǎng)溫度降低至未經(jīng)轉(zhuǎn)化植物 不能生存或其將以低于5%的生存率存活的溫度），使植物生長達(dá)給定的時(shí)間段，然后測定 所得生存率來評估。依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物在冷凍應(yīng)激條件下能以比未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物優(yōu) 選高5%或更高，更優(yōu)選高10%或更高，進(jìn)一步優(yōu)選高30%或更高的生存率存活，盡管生存 率不限于上述水平。
[0095] 可依照例如下文實(shí)施例中描述的方法來評估這些環(huán)境應(yīng)激抗性。環(huán)境應(yīng)激抗性由 PABN基因過表達(dá)引起（例如，由PABN基因?qū)胍鸬脑黾拥谋磉_(dá)水平）。
[0096] 依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物具有增強(qiáng)的種子生產(chǎn)力。不管是否對其施加環(huán)境應(yīng)激， 依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物均能以高產(chǎn)率產(chǎn)生種子。依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物能以比未經(jīng)轉(zhuǎn) 化植物增加10 %或更高，優(yōu)選20 %或更高，更優(yōu)選30 %或更高，進(jìn)一步優(yōu)選40 %或更高的 種子數(shù)來產(chǎn)生種子。
[0097] 可依照例如下文實(shí)施例中描述的方法來評估種子生產(chǎn)力。依照本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化植 物的高種子生產(chǎn)力由PABN基因過表達(dá)引起（例如，由PABN基因?qū)胍鸬脑黾拥谋磉_(dá)水 平）。
[0098] 因此，本發(fā)明涉及一種用于生成如上文描述的具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性和增強(qiáng)的 種子生產(chǎn)力兩者的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的方法，和一種用于增強(qiáng)植物的環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力 的方法，特征在于PABN基因過表達(dá)（例如，通過將PABN基因?qū)胫参铮?。更具體地，本發(fā)明 提供一種用于增強(qiáng)植物的環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力的方法，其包括例如將PABN基因?qū)?入植物細(xì)胞中，在需要時(shí)再生植物，并選出其中環(huán)境應(yīng)激抗性和生產(chǎn)力得到增強(qiáng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化 植物。
[0099] 依照本發(fā)明的方法，可通過PABN基因過表達(dá)在植物中增強(qiáng)環(huán)境應(yīng)激抗性（如鹽 應(yīng)激抗性、干旱應(yīng)激抗性和冷凍應(yīng)激抗性）和種子生產(chǎn)力兩者，而不形成不利的性狀，如矮 小。如此，本發(fā)明的方法是非常有利的。 實(shí)施例
[0100] 下文中參照以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，不過本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這 些實(shí)施例。
[0101] 實(shí)施例1 :產(chǎn)生導(dǎo)入PABN的經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥
[0102] LcDNA 合成
[0103] 使用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen)自擬南芥（Columbia-O)的蓮座葉提取總RNA。 使用獲得的 RNA，用 PCR Core 試劑盒（Applied Biosystems)合成 cDNA。
[0104] 2.從cDNA分離AtPABN基因區(qū)段
[0105] 使用上文合成的cDNA作為模板，用下面顯示的正向和反向引物實(shí)施PCR。
[0106] 正向引物：5'-AAACCTTCCCTTCTTTCCCG-3'（SEQ ID N0:7)
[0107] 反向引物：5'-TCAGTACGGTCTGTAGCGCA-3'（SEQ ID N0:8)
[0108] 這些正向和反向引物設(shè)計(jì)為擴(kuò)增AtPABN基因 （AtPABNl ;At5G51120)的已知核苷 酸序列（GenBank登錄號NM_001203582)的從5'UTR到終止密碼子的區(qū)域。PCR在50μ1反 應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行。PCR反應(yīng)溶液通過混合0. 2 μ 1的Ex Taq DNA聚合酶（5單位/ μ 1，TAKARA BIO INC.)、5yl 的 IOx 聚合酶緩沖液（含有 MgCl2)、2.5yl 的2.5mM dNTP 溶液、0· Ιμ? 的 每種引物（lOpmol/yl)、和上文合成的2μ1 cDNA(約lyg/μ?)來制備，且將反應(yīng)溶液的 總量用Milli-Q水調(diào)整為50 μ 1。PCR條件和反應(yīng)循環(huán)數(shù)在下表1中匯總。
[0109] 表 1
[0110]
【權(quán)利要求】
1. 一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，具有增強(qiáng)的環(huán)境應(yīng)激抗性和增強(qiáng)的種子生產(chǎn)力，該植物被遺傳 修飾為過表達(dá)多腺苷酸結(jié)合蛋白（PABN)基因。
2. 依照權(quán)利要求1的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其中已經(jīng)導(dǎo)入以下PABN基因（a)至（f)的至少一 種： (a) 包含如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列的基因； (b) 包含在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列組成的DNA雜交 的DNA且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因； (c) 編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸序 列； (d) 編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含自如SEQ ID N0:2,4或6中所不的氣基酸序 列通過缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性； (e) 包含與如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列有85%或更高同一性的核苷酸 序列且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因；和 (f) 編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含與如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸序 列有90%或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性。
3. 依照權(quán)利要求1或2的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其中所述環(huán)境應(yīng)激抗性是鹽應(yīng)激抗性、干旱應(yīng) 激抗性、和/或冷凍應(yīng)激抗性。
4. 依照權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其為谷物植物或含油種子植物。
5. -種用于增強(qiáng)植物的環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力兩者的方法，包括將多腺苷酸結(jié)合 蛋白（PABN)基因?qū)胫参锛?xì)胞中并選出其中環(huán)境應(yīng)激抗性和種子生產(chǎn)力得到增強(qiáng)的經(jīng)轉(zhuǎn) 化的植物。
6. 依照權(quán)利要求5的方法，其中所述PABN基因是以下（a)至（f)的至少一種： (a) 包含如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列的基因； (b) 包含在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列組成的DNA雜交 的DNA且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因； (c) 編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸序 列； (d) 編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含自如SEQ ID N0:2,4或6中所不的氣基酸序 列通過缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性； (e) 包含與如SEQ ID NO: 1，3或5中所示的核苷酸序列有85%或更高同一性的核苷酸 序列且編碼具有多腺苷酸結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的基因；和 (f) 編碼以下蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)包含與如SEQ ID N0:2,4或6中所示的氨基酸序 列有90%或更高同一性的氨基酸序列且具有多腺苷酸結(jié)合活性。
7. 依照權(quán)利要求5或6的方法，其中所述環(huán)境應(yīng)激抗性是鹽應(yīng)激抗性、干旱應(yīng)激抗性、 和/或冷凍應(yīng)激抗性。
8. 依照權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物為谷物植物或含油種子植物。
【文檔編號】A01H1/00GK104349665SQ201380021136
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月8日
【發(fā)明者】今井亮三, 金明姬, 柳樂洋三, 田岡直明 申請人:株式會(huì)社鐘化