雙孢菇液體菌種及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種雙孢菇液體菌種及其制備方法，雙孢菇液體菌種由斜面、搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)三級(jí)擴(kuò)繁制得，斜面與搖瓶培養(yǎng)基組份：馬鈴薯100～200g，牛糞50～150g，葡萄糖10～30g，磷酸二氫鉀1～2.5g，硫酸鎂0.5～2g，蛋白胨1～4g；發(fā)酵罐培養(yǎng)基每50升水中各組份：馬鈴薯2～4kg，牛糞1～3kg，麩皮0.5～1kg，玉米粉0.2～0.4kg，蔗糖0.5～1kg，磷酸二氫鉀30～60g，硫酸鎂20～30g，維生素B120～50毫克，消泡劑40～50g。本發(fā)明解決了菌絲生長(zhǎng)中易出現(xiàn)老化退變的問題，液體菌種為小球狀菌絲體，菌齡整齊一致，菌絲活力強(qiáng)，萌發(fā)快，接種于固體培養(yǎng)料中，形成多發(fā)菌中心，出菇整齊；制種成本為固體菌種的1/10；發(fā)酵罐菌種生長(zhǎng)周期7～9天，能在短期內(nèi)培育大批量菌種。
【專利說明】雙孢菇液體菌種及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食用菌液體菌種【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及食用菌中的雙孢菇液體菌種及其該液體菌種的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在雙孢菇的生產(chǎn)過程中所用的菌種有固體菌種和液體菌種。目前食用菌雙孢菇通常采用傳統(tǒng)的固體菌種栽培模式，培育雙孢菇菌種多以麥粒為原料，是將一級(jí)PDA試管斜面母種接到麥粒培養(yǎng)基中制成二級(jí)固體菌種，再將二級(jí)種擴(kuò)繁制成三級(jí)固體菌種，在實(shí)際生產(chǎn)中存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，制作成本高；污染率高，菌齡長(zhǎng)，出菇不整齊，不一致等缺點(diǎn)。固體菌種從接種到菌絲長(zhǎng)滿瓶，一般需要35-40天，固體菌種往往是瓶底的菌絲剛萌動(dòng)，其表層菌絲就已老化，因此出菇不齊。采用液體菌種具有生產(chǎn)周期短，流動(dòng)性好，生命力旺盛，發(fā)菌快、生物轉(zhuǎn)化率高、菌種純度高等優(yōu)勢(shì)，有利于機(jī)械化操作等優(yōu)點(diǎn)，是規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展的重要方向之一。但目前雙孢菇液體菌種培養(yǎng)基仍然存在著制備成功率低、菌絲生長(zhǎng)不適應(yīng)，在培養(yǎng)后期容易出現(xiàn)菌絲老化退變等問題，且操作專業(yè)技術(shù)要求高，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，會(huì)直接影響雙孢菇的培育質(zhì)量與產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的諸多缺陷，提供一種雙孢菇液體菌種及其該液體菌種的制備方法。
[0004]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題提出如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種雙孢菇液體菌種，是由各固體組份與液體組份組成，其特征在于:一種雙孢菇液體菌種，是由各固體組份與液體組份組成，其特征在于:該雙孢菇液體菌種是由斜面培養(yǎng)基、搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)三級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)制得，所述的擴(kuò)繁培`養(yǎng)中各級(jí)培養(yǎng)基的重量組成是:
[0005]I)斜面培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為:
[0006]馬鈴薯100~200g,牛糞50~150g,葡萄糖10~30g,磷酸二氫鉀I~2.5g,硫酸鎂0.5~2g,蛋白胨I~4g,瓊脂15~25g, pH自然；
[0007]2)搖瓶培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為:
[0008]馬鈴薯100~200g,牛糞50~150g,玉米粉5~20g,麩皮5~20g,葡萄糖10~30g,磷酸二氫鉀I~2.5g,硫酸鎂0.5~2g,蛋白胨I~4g,維生素B110~30毫克，pH自然；
[0009]3)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成:每50升水中所添加各組份的重量份為:馬鈴薯2~4kg，牛糞I~3kg,麩皮0.5~Ikg,玉米粉0.2~0.4kg,鹿糖0.5~Ikg,磷酸二氫鉀30~60g,硫酸鎂20~30g，維生素B120~50毫克，消泡劑40~50g，pH自然。
[0010]本發(fā)明優(yōu)選各級(jí)培養(yǎng)基的重量組成是:
[0011]I)斜面培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為:
[0012]馬鈴薯200g，牛糞150g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，蛋白胨2g，瓊脂20g，pH 自然；
[0013]2)搖瓶培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為:
[0014]馬鈴薯200g，牛糞150g，玉米粉10g，麩皮10g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，蛋白胨2g,維生素B120毫克，pH自然;
[0015]3)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成:每50升水中所添加各組份的重量份為:馬鈴薯2.5kg，牛糞Ikg,麩皮0.5kg,玉米粉0.25kg,鹿糖0.5kg,磷酸二氫鉀50g,硫酸鎂25g,維生素B130毫克，消泡劑50g，pH自然。
[0016]本發(fā)明制備雙孢菇液體菌種的方法包括如下步驟:
[0017]I)活化菌種:將雙孢菇原母種接入斜面培養(yǎng)基中，于23~28°C培養(yǎng)5~7天，制得斜面母種菌種片；
[0018]2)搖瓶液體菌種培養(yǎng):裝入瓶容量3/5的搖瓶培養(yǎng)基，于120±2°C滅菌30分鐘，冷卻后在接種箱接入0.4~0.5厘米斜面母種菌種片5~6片，使菌種片漂浮在液面上，于23~28°C在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)60~72小時(shí)，然后于23~28°C，200r/min震蕩培養(yǎng)5~8天，得到搖瓶液體菌種，其標(biāo)準(zhǔn)是:搖瓶搖動(dòng)后有菌絲掛壁，檢測(cè)培養(yǎng)液菌絲球單位密度達(dá)到指標(biāo)的80%以上即可使用；
[0019]3)發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng):a)培養(yǎng)基的滅菌:在發(fā)酵罐中置入罐容量4/5的發(fā)酵罐培養(yǎng)基液體，然后進(jìn)行升溫，當(dāng)壓力表上升至0.05MPa時(shí)打開排氣閥，排氣至零后關(guān)閉，再次升至0.05MPa,再打開排氣閥微排，I~2分鐘后關(guān)閉排氣閥，于121~125°C，壓力0.12~0.14MPa下滅菌30~50分鐘；滅菌后微開排料口，排料1.5~2升對(duì)閥門消毒；b)冷卻:采用夾層冷卻方式，冷卻使發(fā)酵罐的排出壓力降至0.05~0.08MPa，打開氣泵及放氣閥，調(diào)節(jié)罐壓至0.02MPa，將溫度降至26~28°C ；c)接種培養(yǎng):待發(fā)酵罐溫度降至26~28°C時(shí)，開啟罐體接種口并用火焰圈加以保護(hù)，通過火焰圈將搖瓶液體菌種按照5~8%的接種量投入罐內(nèi)，立即蓋上接種口蓋，打開排氣閥并移走火焰圈，使罐壓保持在0.0IMPa,控制培養(yǎng)溫度25~28°C，接種培養(yǎng)48小時(shí)后對(duì)菌種質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格于25~28°C溫度下繼續(xù)培養(yǎng)5~7天，檢測(cè)培養(yǎng)液菌絲球單位密度達(dá)到指標(biāo)的80%以上，即制得雙孢菇三級(jí)液體菌種。
[0020]本發(fā)明解決了菌絲生長(zhǎng)中易出現(xiàn)老化退變的問題，由于液體菌種為小球狀菌絲體，在菌液中還具有許多菌液碎片，分散度大，流動(dòng)性好，生命力旺盛，萌發(fā)快，接種于固體培養(yǎng)料中，可隨培養(yǎng)液的下滲到固體培養(yǎng)料的深層部位，形成許多發(fā)菌中心；而且液體菌種是在立體培養(yǎng)狀態(tài)下進(jìn)行繁殖的，菌齡整齊一致，且大多處于旺盛生長(zhǎng)期，接種后菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)快；接種方便快捷，接種后能迅速恢復(fù)生長(zhǎng)，采用專用接種槍，把菌液注入菌袋內(nèi)，免去接種穴口貼封工序，提高功效4~5倍；菌絲活力強(qiáng)，所以出菇整齊；制種成本低，液體菌種制種成本僅為固體菌種的1/10左右；采用液體菌種具有生產(chǎn)周期短，發(fā)酵罐菌種生長(zhǎng)周期僅7~9天，能在短期內(nèi)培育出大批量的菌種，滿足食用菌產(chǎn)業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]1、供試菌株:山東壽光雙孢菇母種2796 ;[0024]2、培養(yǎng)基配方
[0025]a)斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，牛糞150g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，蛋白胨2g，瓊脂20g，PH自然，水1000毫升。
[0026]b)搖瓶培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，牛糞150g，玉米粉10g，麩皮10g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，蛋白胨2g，維生素BfO毫克，PH自然，水1000毫升。
[0027]c)發(fā)酵罐培養(yǎng)基(按50升配制):馬鈴薯2.5kg,牛糞Ikg,麩皮0.5kg,玉米粉0.25kg,鹿糖0.5kg,磷酸二氫鉀50g,硫酸鎂25g,維生素B130毫克，消泡劑50g,pH自然,水50升。
[0028]牛糞處理:牛糞晾干粉碎處理后過篩，于陽(yáng)光下曝曬晾干備用。
[0029]3、活化菌種:將雙孢菇母鐘接入斜面培養(yǎng)基中，于25~26°C下培養(yǎng)6天，制得斜面母種菌種片；
[0030]4、搖瓶液體菌種的培養(yǎng):用1000毫升三角瓶，裝入搖瓶培養(yǎng)基600毫升，于120±2°C滅菌30分鐘，冷卻后在接種箱接入約0.5厘米斜面母種菌種片5~6片，使菌種片漂浮在液面上，于26°C在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72小時(shí)，再于25~26°C，200r/min震蕩培養(yǎng)6-7天，得到搖瓶液體菌種，該液體菌種的標(biāo)準(zhǔn)是:搖動(dòng)搖瓶后有菌絲掛壁，檢測(cè)培養(yǎng)液菌絲球單位密度(每升發(fā)酵液中的菌絲球個(gè)數(shù))為238~252/600ml。
[0031]5、發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng):
[0032]a)培養(yǎng)基的滅菌:采用50升全自動(dòng)發(fā)酵罐，在發(fā)酵罐中置入發(fā)酵罐培養(yǎng)基液體40升，然后進(jìn)行滅菌升溫，當(dāng)壓力表上升至0.05MPa時(shí)打開排氣閥，排氣至零后關(guān)閉，再次升至0.05MPa，再打開排氣`閥微排，I~2分鐘后關(guān)閉；溫度上升到121~125°C，壓力在0.12~0.14MPa時(shí)，保持滅菌50分鐘，滅菌結(jié)束后，微開排料口，排料1.5~2升進(jìn)行閥門消毒，關(guān)閉閥門冷卻；
[0033]b)冷卻:采用夾層冷卻方式，將自來水管接到冷卻水進(jìn)口，冷卻將發(fā)酵罐內(nèi)的排出壓力降至0.05~0.08MPa時(shí)，打開氣泵及放氣閥，調(diào)節(jié)罐壓至0.02MPa,將溫度降至26~28 °C時(shí)準(zhǔn)備接種；
[0034]c)接種培養(yǎng):待發(fā)酵罐溫度降至26~28°C時(shí)，開啟罐體接種口，并用火焰圈保護(hù)接種口，是將95%酒精浸泡的棉條纏繞在發(fā)酵罐體的接種口上，點(diǎn)燃棉條的同時(shí)打開接種口，通過火焰圈將搖瓶液體菌種投入罐內(nèi)，接種量(重量)為5%，然后立即蓋上接種口，打開排氣閥并移走火焰圈，使罐壓保持在0.01MPa，控制培養(yǎng)溫度25~26°C，接種培養(yǎng)48小時(shí)后對(duì)菌種進(jìn)行抽檢，檢測(cè)合格于25~26°C溫度下繼續(xù)培養(yǎng)5~6天，即制得雙孢菇三級(jí)液體菌種，檢測(cè)培養(yǎng)液菌絲球單位密度(每升發(fā)酵液中的菌絲球個(gè)數(shù))為384~402。
[0035]雙孢菇液體菌種發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明:發(fā)酵過程中還原糖含量相對(duì)較穩(wěn)定，pH值在2天左右變化不大，但隨后pH則明顯下降；當(dāng)發(fā)酵至6~7天時(shí)雙孢菇菌絲球的生物量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的80 %以上，至第8~9天時(shí)發(fā)酵罐中的菌絲球生物量達(dá)到最大值，隨后菌絲球的生物量保持相對(duì)穩(wěn)定并開始逐步下降。通過對(duì)發(fā)酵過程中PH值與菌絲球生物量等指標(biāo)分析，可以將第9天確定為發(fā)酵終點(diǎn)，而在生產(chǎn)中，可以選擇發(fā)酵第8~9天作為液體菌種發(fā)酵終點(diǎn)，此時(shí)的菌絲球生物量及活性最高。
[0036]以下還給出不同培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)菌絲球生物量影響的檢測(cè)數(shù)據(jù)(由搖瓶種接入發(fā)酵罐)，其中菌絲球單位數(shù)量即密度(為每升發(fā)酵液中的菌絲球個(gè)數(shù))。[0037]表1培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵罐雙孢菇菌絲生物量的影響
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種雙孢菇液體菌種，是由各固體組份與液體組份組成，其特征在于:該雙孢菇液體菌種是由斜面培養(yǎng)基、搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)三級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)制得，所述的擴(kuò)繁培養(yǎng)中各級(jí)培養(yǎng)基的重量組成是: . 1)斜面培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為: 馬鈴薯100~200g，牛糞50~150g，葡萄糖10~30g，磷酸二氫鉀I~2.5g，硫酸鎂.0.5~2g,蛋白胨I~4g,瓊脂15~25g, pH自然； 2)搖瓶培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為: 馬鈴薯100~200g，牛糞50~150g，玉米粉5~20g，麩皮5~20g，葡萄糖10~30g，磷酸二氫鉀I~2.5g,硫酸鎂0.5~2g,蛋白胨I~4g,維生素B110~30毫克，pH自然； 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成:每50升水中所添加各組份的重量份為:馬鈴薯2~4kg，牛糞I~3kg,麩皮0.5~Ikg,玉米粉0.2~0.4kg,鹿糖0.5~Ikg,磷酸二氫鉀30~60g,硫酸鎂20~30g，維生素B120~50毫克，消泡劑40~50g，pH自然。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢菇液體菌種，其特征在于:優(yōu)選的各級(jí)培養(yǎng)基的重量組成是: .1)斜面培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為: 馬鈴薯200g，牛糞150g ，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，蛋白胨2g，瓊脂20g，pH自然； . 2)搖瓶培養(yǎng)基的組成:每1000毫升水中所添加各組份的重量為: 馬鈴薯200g，牛糞150g，玉米粉10g，麩皮10g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂lg，蛋白胨2g,維生素B120毫克，pH自然； .3)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的組成:每50升水中所添加各組份的重量份為:馬鈴薯2.5kg，牛糞Ikg,麩皮0.5kg，玉米粉0.25kg，蔗糖0.5kg，磷酸二氫鉀50g，硫酸鎂25g，維生素B130毫克，消泡劑50g，pH自然。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢菇液體菌種的制備方法，其特征在于:利用該培養(yǎng)基制備雙孢菇液體菌種的方法包括如下步驟: .1)活化菌種:將雙孢菇原母種接入斜面培養(yǎng)基中，于23~28°C培養(yǎng)5~7天，制得斜面母種菌種片； . 2)搖瓶液體菌種培養(yǎng):裝入瓶容量3/5的搖瓶培養(yǎng)基，于120±2°C滅菌30分鐘，冷卻后在接種箱接入0.4~0.5厘米斜面母種菌種片5~6片，使菌種片漂浮在液面上，于23~.28°C在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)60~72小時(shí)，然后于23~28°C，200r/min震蕩培養(yǎng)5~8天，得到搖瓶液體菌種，其標(biāo)準(zhǔn)是；搖瓶搖動(dòng)后有菌絲掛壁，檢測(cè)培養(yǎng)液菌絲球單位密度達(dá)到指標(biāo)的80%以上即可使用； .3)發(fā)酵罐液體菌種培養(yǎng):a)培養(yǎng)基的滅菌:在發(fā)酵罐中置入罐容量4/5的發(fā)酵罐培養(yǎng)基液體，然后進(jìn)行升溫，當(dāng)壓力表上升至0.05MPa時(shí)打開排氣閥，排氣至零后關(guān)閉，再次升至0.05MPa，再打開排氣閥微排，I~2分鐘后關(guān)閉排氣閥，于121~125°C，壓力0.12~.0.14MPa下滅菌30~50分鐘；滅菌后微開排料口，排料1.5~2升對(duì)閥門消毒；b)冷卻:采用夾層冷卻方式，冷卻使發(fā)酵罐的排出壓力降至0.05~0.08MPa，打開氣泵及放氣閥，調(diào)節(jié)罐壓至0.02MPa，將溫度降至26~28°C ；c)接種培養(yǎng):待發(fā)酵罐溫度降至26~28°C時(shí)，開啟罐體接種口并用火焰圈加以保護(hù)，通過火焰圈將搖瓶液體菌種按照5~8%的接種量投入罐內(nèi)，立即蓋上接種口蓋，打開排氣閥并移走火焰圈，使罐壓保持在0.0IMPa,控制培養(yǎng)溫度25~28°C，接種培養(yǎng)48小時(shí)后對(duì)菌種質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格于25~28°C溫度下繼續(xù)培養(yǎng)5~7天，檢測(cè)培養(yǎng)液菌絲球單位密度達(dá)到指標(biāo)的80%以上，即制得雙孢菇三級(jí)液體菌種。
【文檔編號(hào)】A01G1/04GK103782801SQ201310755235
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】于海超, 辛子軍, 徐曉東, 張福艷, 王妍, 曲明福, 許國(guó)興, 劉建國(guó), 張慧穎, 徐箭, 李英杰, 鞠植珍, 于虎元, 闞秋芳 申請(qǐng)人:朝陽(yáng)鑫源農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)有限公司