一種微生物復(fù)合肥料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物復(fù)合肥料，涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)中的肥料；所述微生物復(fù)合肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、枯草芽孢桿菌菌劑組成，微生物復(fù)合肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物20-50份、枯草芽孢桿菌菌劑20-35份；實驗表明使用本品可提高糧食產(chǎn)量8-30%，提高蔬菜產(chǎn)量10-40%，還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風(fēng)味。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-100克，是目前國內(nèi)外使用量較少的微生物復(fù)合肥料之一。
【專利說明】一種微生物復(fù)合肥料
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)中的肥料，涉及一種新型的微生物復(fù)合肥料。
【背景技術(shù)】:
[0002]現(xiàn)有的生物肥料大多是單一性的生物肥料。如:固氮菌肥，主要由具有固氮作用的細(xì)菌和真菌組成；又如:磷細(xì)菌，其功能是分解土壤中的有機磷，使之變?yōu)橐子诒恢参镂盏牧姿兀辉偃?細(xì)菌，其功能是分解土壤中的鉀化合物，使之成為能被植物吸收利用的速效鉀。這些肥料在單獨使用時均能發(fā)揮各自作用，部分滿足植物對氮，磷，鉀三要素的需要。它們不會產(chǎn)生長期使用化肥所造成的土壤板結(jié)現(xiàn)象。但其不足在于:單獨使用上述三類生物肥料只能解決植物所需營養(yǎng)的一個方面，且成本較高，用量大，同時，將三者配合使用，又因難于做到比例適當(dāng)而造成施肥量的不足或浪費。長期使用單一的或復(fù)合的生物肥料的實踐證明，它們只能替代化肥的30%以下。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0003]本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種能針對我國土壤肥力的基本情況，開發(fā)一種微生物復(fù)合肥料。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
[0005]一種微生物復(fù)合肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、枯草芽孢桿菌菌劑組成，微生物復(fù)合肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物20-50份、枯草芽孢桿菌菌劑20-35份；
[0006]一種生產(chǎn)微生物復(fù)合肥料的方法，將特選的黑曲霉培養(yǎng)物、枯草芽孢桿菌分別進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，然后將發(fā)酵產(chǎn)物按比例組合為微生物復(fù)合肥料。
[0007]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，采用常見固體發(fā)酵培養(yǎng)方法:孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0008]有益效果:
[0009]實驗表明，使用本品可提聞糧食廣量8-30%,提聞蔬采廣量10-40%,還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風(fēng)味。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為60-100克，是目前國內(nèi)外使用量較少的微生物復(fù)合肥料之一。
[0010]每畝使用量為80-200克。在本發(fā)明微生物復(fù)合肥料中加入120倍的自來水和6倍的尿素，在22°C以上45°C以下的水溫中活化28小時，然后連同化肥(按照上年使用量的50%)灑入土壤中。最好作基肥,每年使用1-3次。
【具體實施方式】:
[0011 ] 下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。1、囷劑培養(yǎng)制備:
[0012]枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備:枯草芽孢桿菌菌劑制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢離心分離獲得濕菌體和發(fā)酵液；發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的40-50%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.7:1，載體組成為:CaC0320-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0013]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-35 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；
[0014]本發(fā)明提供的產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為 CGMCCN0.7926。
[0015]所述菌株特點如下:
[0016]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗成陽性。
[0017]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)L1-2013-02由一株保藏于本實驗室的產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿菌L1-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下:
[0018](I)菌懸液的制備
[0019]將在平板劃線分離后長出的L1-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培養(yǎng)12h后,取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸與9mL生理鹽水中。
[0020](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0021]將菌懸液置于無菌平板中，`在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。
[0022](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0023]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03
[0024](4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0025]將獲得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。
[0026](5)酶活測定
[0027]酶活單位的定義:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即為I個酶活力單位，以U/mL表示。
[0028]經(jīng)測定，菌株L1-2013-02，為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0029]所述氯化鋰平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2SO40.4%, K2HPO40.8%, CaCl20.2%，氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0030]所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5 %，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0031]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0032]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10%(V/V)，100r/min、40°C 發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0033]由菌株L1-2013-02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α -淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0034](I)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在105_115°C之間，且在110°C以下保存的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C以上保存長時間溫度穩(wěn)定性較差。
[0035](2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0_7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定。
[0036](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的突變株L1-2013-02，制備的耐高溫α -淀粉酶酶活力為 30000-35000U/ml。
[0037]1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高溫α -淀粉酶的枯草芽孢桿 菌L1-2013-02，該菌株具有強耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點。
[0038]2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α-淀粉酶酶活力高達(dá)30000-35000u/ml，；適用溫度范圍為25-115°C，最適反應(yīng)溫度110°C，在110°C酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH值范圍為
3.0-7.0，在pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α -淀粉酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0039]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03是由實驗室保藏的一株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，然后對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03o
[0040]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.7927。
[0041]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟:
[0042]I)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li_2010劃線接種斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2~3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下:12°Brix 麥芽汁 1000mL, pH 值自然，121°C滅菌 20min ；
[0043]2)孢子懸液制備(以下步驟均在無菌條件下操作):向試管斜面加入15mL無菌水，把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0044]3)亞硝基胍(NTG )誘變
[0045]A.用無菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成IO6-1O7個/mL。
[0046]B.取IOmL菌懸液轉(zhuǎn)移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG,配制成終濃度為IOmg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0047]C.在30°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min, 5000rpm離心IOmin收集菌體,用無菌生理
鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0048]D.適當(dāng)稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為IO3個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株200支。(所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅
0.2g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL, pH 值 5-6，121°C滅菌 20min)。
[0049]E.復(fù)篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵，接種量10%( v/v)，30°C、100r/min培養(yǎng)96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。(所述復(fù)篩培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進(jìn)行放大實驗。
[0050]4)遺傳穩(wěn)定性試驗
[0051]將L1-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標(biāo)都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0052]5)放大試驗
[0053]①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger L1-2013-03接入500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養(yǎng)72_96h。
[0054]③種子罐培養(yǎng):將種子液以10% (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的IOL發(fā)酵罐中，控制pH值恒定為6.0±0.2，培養(yǎng)溫度30±0.1°C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(v/v)1:0.8-1.2，培養(yǎng)時間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0.lg、自來水定容lOOOmL，pH值5-6，121°C滅菌20mino
[0055]發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進(jìn)行酶活力檢測經(jīng)測定，菌株Aspergillusniger L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達(dá)到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分別比出發(fā)菌株 Aspergillus nigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0056]實施例1
[0057]—種微生物復(fù)合肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌菌劑組成，微生物復(fù)合肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物40份、枯草芽孢桿菌菌劑20份；
[0058]本發(fā)明產(chǎn)品的具體生產(chǎn)方法步驟如下:
[0059]菌劑培養(yǎng)制備:
[0060]枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備:枯草芽孢桿菌菌劑制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢離心分離獲得濕菌體和發(fā)酵液；發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓 真空濃縮到原體積的50%，得到菌濃縮液。添加載體:向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.6:1，載體組成為:CaC0330份，糊精15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0061]黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，30°C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床45°C干燥，粉碎干燥物；
[0062]采用的菌種如下:
[0063]枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis subsp) CGMCC7926
[0064]上述菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；郵編:100101。
[0065]黑曲霉培養(yǎng)物的制備方法:
[0066]技術(shù)方案如下:
[0067]斜面菌種活化培養(yǎng):將黑曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27°C培養(yǎng)3天。
[0068]固體一級種子培養(yǎng):挑取黑曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3天即可。
[0069]固體二級種子培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克培養(yǎng)基的5000毫升三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30°C培養(yǎng)3天即可。
[0070]固體發(fā)酵培養(yǎng):將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在26-35°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養(yǎng)時間5-7天；固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù)；待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)基預(yù)先經(jīng)高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時間I小時。
[0071]干燥粉碎:發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料`在流化床或其他干燥設(shè)備上進(jìn)行干燥，干燥溫度控制在60°C，干燥到水分含量在10%`以下，然后將固體培養(yǎng)料進(jìn)行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以上。
[0072]培養(yǎng)基組成:固體原料:麩皮70%，粉碎的作物秸桿15%，豆餅粉5%，玉米淀粉10%，添加等量自來水；初始pH自然。
[0073]枯草芽孢桿菌的制備方法:
[0074]1.發(fā)酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴(kuò)培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
[0075](I) 一級種子培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0076](2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0077](3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0078](4) 一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V) 1:0.5,罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間24小時；
[0079](5)發(fā)酵培養(yǎng):將一級種子罐菌種以10%接種量接入總?cè)莘e為1.5噸二級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量I噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V) 1:0.5，罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間24小時。
[0080]培養(yǎng)基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaC031%, pH6.8。
[0081]試驗地的選擇與試驗設(shè)計:試驗于2012年3月27日一9月30日在寧夏鹽池縣花馬池鎮(zhèn)八堡村進(jìn)行。
[0082]試驗田達(dá)到田種植玉米10畝，分別在種植時使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.1公斤，出苗I個月左右通過鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.7公斤，對照組使用常規(guī)肥料。
[0083]發(fā)明產(chǎn)品使用玉 米地玉米產(chǎn)量達(dá)到650公斤，對照組達(dá)到520公斤；該地塊在第2年種植春小麥，春小麥產(chǎn)量達(dá)到了 410公斤，比對照組單產(chǎn)提高了 20%。且試驗田土壤結(jié)構(gòu)良好，無大塊和板結(jié)。
【權(quán)利要求】
1.一種微生物復(fù)合肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌菌劑組成，微生物復(fù)合肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物20-50份、枯草芽孢桿菌菌劑20-35份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物復(fù)合肥料，其特征在于，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02 保藏號為 CGMCC N0.7926。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物復(fù)合肥料，其特征在于，黑曲霉(Aspergillusniger)保藏號為 CGMCC N0.7927。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物復(fù)合肥料，其特征在于，微生物復(fù)合肥料由黑曲霉培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌菌劑組成， 微生物復(fù)合肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物40份、枯草芽孢桿菌菌劑20份。
【文檔編號】C05F11/08GK103739316SQ201310743070
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】邵素英, 孔日祥 申請人:邵素英