混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑及其制法和用途
【專(zhuān)利摘要】混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑及其制法和用途，針對(duì)海參的生理習(xí)性和養(yǎng)殖特點(diǎn)，應(yīng)用海洋微生物技術(shù)，由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選的彎曲芽孢桿菌CGMCC?No.5115、枯草芽孢桿菌CGMCC?No.5116和蠟狀芽孢桿菌CGMCC?No.5117所組成，以玉米粉和豆粕粉為主要培養(yǎng)原料，28-37℃發(fā)酵24-48h，再以沸石、硅藻土和稻殼作為吸附和懸浮復(fù)合載體，加工制得混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑。本產(chǎn)品對(duì)水體環(huán)境耐受性強(qiáng)，漂浮性、懸浮性以及沉浮可控性好，有利于海水養(yǎng)殖水體三維立體的凈化效果，避免水體酸化和臭底，有效抑制病原微生物，預(yù)防海參病害的發(fā)生，提高海參養(yǎng)殖的產(chǎn)量和質(zhì)量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑及其制法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明于水產(chǎn)養(yǎng)殖及海洋微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑及其制法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]海水是海參等海珍品賴(lài)以生存的基本環(huán)境條件，俗話說(shuō):“三分養(yǎng)魚(yú)，七分養(yǎng)水”。水質(zhì)的好壞直接影響到海參的生長(zhǎng)狀況和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。隨著經(jīng)濟(jì)和科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)海參的需求日益增加，在天然捕撈不能滿足市場(chǎng)需求的情況下，海參養(yǎng)殖業(yè)已由傳統(tǒng)的粗放型經(jīng)營(yíng)、資源依賴(lài)型養(yǎng)殖方式轉(zhuǎn)化為現(xiàn)在的集約化和工廠化的養(yǎng)殖方式，刺參養(yǎng)殖已成為中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。然而，隨著刺參集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖迅速的發(fā)展，出現(xiàn)了一些嚴(yán)重問(wèn)題，制約了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，比如殘存餌料以及排泄物和動(dòng)物死體在水體中沉積，分解生成很多的有害物質(zhì)，惡化了水質(zhì)，病原菌大量繁殖，致使海參產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)了搖頭不食、口腫、身體收縮僵直、排臟、體表潰瘍等現(xiàn)象，最后體壁大面積腐爛而死。為了對(duì)抗海參病疫，長(zhǎng)期和大量濫用抗生素以及化學(xué)合成藥物，不僅導(dǎo)致了海參對(duì)病原微生物的易感性以及細(xì)菌病原微生物等的耐藥性，還會(huì)使抗生素檢測(cè)超標(biāo)，并造成整個(gè)生態(tài)環(huán)境的污染，嚴(yán)重影響了節(jié)約減排、食品安全和阻礙了無(wú)公害刺參養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003]沸石是天然沸石族礦物的總稱(chēng)，是一種含水的堿金屬或堿土金屬的鋁硅酸礦物。沸石具有比表面積大(440~1030m2/g)，孔徑均勻，加上特殊的分子結(jié)構(gòu)而形成較大靜電引力，使沸石具有相當(dāng)大的引力場(chǎng)，當(dāng)沸石內(nèi)部的孔穴和孔道一旦有“空缺”時(shí)，沸石就會(huì)表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸附能力，對(duì)海水養(yǎng)殖水體中S02、NH3, H2S等有害極性氣體分子具有很強(qiáng)的親合力，并可以高效物理吸附養(yǎng)殖海水中的氨氮和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)。沸石的空間結(jié)構(gòu)基本單元是由4個(gè)氧原子和I個(gè)硅或鋁原子堆砌成硅(鋁)氧四面體。在此四面體，氧原子中有的價(jià)鍵未得到中和，使整個(gè)鋁氧四面體帶有負(fù)電，為保護(hù)電中和，缺少的正電荷由附近帶正電的陽(yáng)離子來(lái)補(bǔ)償平衡，這 些平衡陽(yáng)離子和水分子極易與周?chē)芤豪锏年?yáng)離子發(fā)生交換，交換后的沸石結(jié)構(gòu)不被破壞，沸石的離子交換特性，利于吸附凈化水中Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+Xu2+等重金屬離子等有害物質(zhì)和吸附置換水體中H+，增加0H—，避免水體酸化和臭底，保證海水養(yǎng)殖過(guò)程中的水體環(huán)境質(zhì)量。
[0004]硅藻土是一種生物成因的硅質(zhì)沉積巖，主要由硅藻遺體組成，中的硅藻有許多不同的形狀，如圓盤(pán)狀、針狀、筒狀、羽狀等，其化學(xué)成份主要是SiO2，由于具有空隙率高、t匕表面大、比重小、耐磨、耐酸、吸附性強(qiáng)、熱導(dǎo)性低、隔熱阻燃、保溫隔音等優(yōu)良特性，被廣泛地應(yīng)用于飲食、建材、化工、能源、水處理等行業(yè)中。硅藻土具有比表面積大的特性，比表面積越大吸附量越大；孔徑越大，吸附量在孔內(nèi)的擴(kuò)散速率越大，則越有利于達(dá)到吸附平衡。而且硅藻土的表面及孔內(nèi)表面分布有大量的硅羥基，這些硅羥基在水溶液中離解出H+，從而使顆粒表現(xiàn)出一定的表面負(fù)電性，使得其在水處理過(guò)程中，不但能去除顆粒態(tài)和膠體態(tài)的污染物質(zhì)，還能有效地降低水體濁度和去除水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要污染物磷與氨氮，以及Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+、Cu2+等重金屬離子等有害物質(zhì)。
[0005]稻殼是稻谷外面的一層殼，由內(nèi)穎及較大的外穎組成。稻殼長(zhǎng)5_10mm、2.5_5mm、厚23-30微米，其色澤一般呈金黃色，被粉碎后，堆積密度可達(dá)384-400kg/m3，作為本產(chǎn)品的輔料，可以增加產(chǎn)品的漂浮性、懸浮性以及沉浮可控性，有利于海水養(yǎng)殖水體三維立體的凈化效果。
[0006]水產(chǎn)微生態(tài)制劑，是利用水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)或養(yǎng)殖水體中的有益微生物經(jīng)特殊加工工藝而形成的活菌制劑，具有氨氧化、硝化、反硝化、解磷、除硫和脫氮等作用，有效地降低水中的C0D、氨氮、亞硝酸氮和硫化物的濃度，從而有效地改善水質(zhì)。目前，應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生態(tài)水質(zhì)調(diào)節(jié)劑，只限于單純菌劑或載體化菌劑，前者使用中存在菌群存活繁殖適應(yīng)性差和數(shù)量減少等劣勢(shì)，后者基本是大部分是沉在池底，對(duì)中上層水體凈化率低，切池底環(huán)境溶解氧低，不利于微生態(tài)菌劑的繁殖。所以，急需一種微生態(tài)制劑既能三維立體全方位能去除海參養(yǎng)殖水體中C0D、氨氮、亞硝酸氮和硫化物，又能除去水體中重金屬離子，并抑制有害微生物的繁殖，達(dá)到同時(shí)一次完全凈化養(yǎng)殖水體的水質(zhì)修復(fù)劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明為了要解決現(xiàn)有技術(shù)中養(yǎng)殖水質(zhì)污染嚴(yán)重、病害頻發(fā)、海參高死亡率、海參體內(nèi)重金屬、化學(xué)殘留和抗生素殘留超標(biāo)等現(xiàn)狀，提供了混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑及其制法和用途。混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑主要由芽孢桿菌混合組成，由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離并篩選的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YB-l CGMCC N0.5116、蠟狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)YB-2 CGMCC N0.5117 和彎曲芽抱桿菌(Bacillus flexus)XH-1 CGMCC N0.5115，以玉米粉和豆柏粉為主要發(fā)酵培養(yǎng)基，以沸石、硅藻土和稻殼作為吸附和懸浮載體，加工成固體粉劑。本發(fā)明中涉及的微生態(tài)制劑，于2011年08月05號(hào)送到中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0008]本發(fā)明的主要方面是:混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑的制法，包括以下操作步驟:`
[0009]①制備益生菌原液
[0010]將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的枯草芽孢桿菌YB-1 CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1 CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養(yǎng)基，pH7.0~7.5，33~37°C震蕩培養(yǎng)12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液；
[0011]②液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)
[0012]向在密閉式發(fā)酵反應(yīng)器中加入發(fā)酵液，并按0.1~1%的體積比加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進(jìn)行發(fā)酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發(fā)酵24h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0013]③噴霧干燥處理
[0014]上述步驟②所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧到吸附載體，干燥處理；
[0015]其中，步驟①所說(shuō)的海水LB瓊脂培養(yǎng)基和2116E培養(yǎng)基，均為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中培養(yǎng)基配方；[0016]步驟②所說(shuō)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的
重量比組成；
[0017]步驟③所述的吸附載體的組成為:沸石粉、硅藻土粉和稻殼2:2:1的體積比混合。
[0018]在優(yōu)化條件下:上述的制備方法中，步驟①中菌懸液的菌體濃度均約為lX108cfu/ml。
[0019]在優(yōu)化條件下:上述的制備方法中，步驟③所述的吸附載體中，沸石粉和硅藻土粉為150~200目；終產(chǎn)物吸附載體和益生菌混合物，載菌含量的終濃度約為IO8~IOltlCfu/g° [0020]在優(yōu)化條件下:上述的制備方法中，向步驟③制得的產(chǎn)物中加入吸附載體的重量比為I:1~1000。
[0021]在優(yōu)化條件下:上述的制備方法中，步驟③中發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到吸附載體的方法為:發(fā)酵培養(yǎng)液與載體重量比為1:1~4,干燥時(shí)間為12~24h,產(chǎn)物水份含量不高于5%。
[0022]本發(fā)明的另外一方面在于，利用上述的方法制備混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑產(chǎn)品。
[0023]本發(fā)明的另外一方面在于，利用上述的混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑在海參養(yǎng)殖方面的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明的混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑環(huán)境耐受性強(qiáng)，漂浮性、懸浮性以及沉浮可控性好，對(duì)海參的養(yǎng)殖水體三維立體的凈化效果顯著，尤其在海參的育苗期和養(yǎng)成期定期潑灑該混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑，可以快速去除養(yǎng)殖水體中的重金屬離子和降解氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質(zhì)，避免水體酸化和臭底，有效抑制病原菌，減輕環(huán)境對(duì)海參的應(yīng)激反應(yīng)，有效預(yù)防海參病害的發(fā)生，提高海參養(yǎng)殖的質(zhì)量和產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的實(shí)施例。
[0026]實(shí)施例中所用原料均由常規(guī)方法制備或由商業(yè)途徑獲得。
[0027]LB瓊脂斜面培養(yǎng)基:其組成每升中含:胰酶解蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，海水晶33g，磷酸高鐵0.1g,瓊脂15g, 1000mL /K，pH7.6。蛋白胨和酵母膏購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司，瓊脂粉購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其他原料均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。
[0028]2216E液體培養(yǎng)基:其組成每升中含:胰酶解蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸高鐵
0.lg，陳海水lOOOmL，pH7.6。蛋白胨和酵母膏購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司，其他原料均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。
[0029]玉米粉和豆柏粉，均為100-200目，購(gòu)于山東萬(wàn)得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。
[0030]稻殼，購(gòu)于大連賽姆集團(tuán)。
[0031]沸石粉，購(gòu)于浙江省寧波市寧?？h嘉和化工有限公司，150-200目。
[0032]硅藻土粉，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)白縣青山源硅藻土有限公司，150-200目。
[0033]本發(fā)明實(shí)施例中涉及的微生態(tài)制劑包括:由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選的芽孢桿菌包括:枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is) YB-1 CGMCC N0.5116、臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus)YB-2 CGMCC N0.5117 和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-1 CGMCC N0.5115。[0034]三株菌株保藏于2011年08月05號(hào)送到中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0035]下面通過(guò)實(shí)例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0036]實(shí)施例1:
[0037]1.制備益生菌原液
[0038]將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的枯草芽孢桿菌YB-1 CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1 CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養(yǎng)基，PH7.0~7.5，37°C震蕩培養(yǎng)12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液，菌體濃度約為lX108cfu/ml。
[0039]2.液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)
[0040]向在密閉式發(fā)酵反應(yīng)器中加入發(fā)酵液，并按0.1~1%的體積比加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進(jìn)行發(fā)酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發(fā)酵24h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0041]上述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由玉米粉 :豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比組成。
[0042]3.噴霧干燥處理
[0043]復(fù)合物吸附載體由150-200目的沸石粉、硅藻土粉和稻殼按體積比為1:1:1混合配制；
[0044]上述步驟2所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到上述吸附載體中，發(fā)酵產(chǎn)物與載體重量比為1:4，干燥時(shí)間為24h，產(chǎn)物水份含量不高于5%，制得混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑。
[0045]實(shí)施例2
[0046]1.制備益生菌原液
[0047]將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的枯草芽孢桿菌YB-1 CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1 CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養(yǎng)基，PH7.0~7.5，37°C震蕩培養(yǎng)12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液，菌體濃度約為lX108cfu/ml。
[0048]2.液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)
[0049]向在密閉式發(fā)酵反應(yīng)器中加入發(fā)酵液，并按0.1~1%的體積比加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進(jìn)行發(fā)酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發(fā)酵24h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；
[0050]上述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比組成。
[0051]3.噴霧干燥處理
[0052]吸附載體由150-200目的沸石粉、硅藻土粉和稻殼按體積比為2:2:1混合配制；
[0053]上述步驟2所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到上述吸附載體中，發(fā)酵產(chǎn)物與載體重量比為1:4，干燥時(shí)間為24h，產(chǎn)物水份含量不高于5%，制得混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑。
[0054]使用效果
[0055]選取3處條件相同的海參養(yǎng)殖圈，平均水深1.5-2m，參苗規(guī)格30_50頭/500g，密度在9-10頭/m2。
[0056]I號(hào)圈為對(duì)照組(未使用混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑),2、3號(hào)圈為實(shí)驗(yàn)組(使用混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑)；實(shí)驗(yàn)組除了定期潑灑實(shí)施例1、2所述的混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑之外，飼喂方式和管理方法與對(duì)照組一樣。
[0057]實(shí)驗(yàn)周期為2013年9月到10月，大約45天，實(shí)驗(yàn)組每隔3天潑灑I次，潑灑量為5g/m3。
[0058]實(shí)驗(yàn)期間，定期檢測(cè)水質(zhì)，觀察海參攝食情況，每隔15天下水摸探，測(cè)量海參體重。鹽度為35-38%。，水溫為16-23°C, pH為7.6-8.5，溶解氧不低于4mg/L。
[0059]1.使用本實(shí)施例1、2后第45天的海參養(yǎng)殖圈的水質(zhì)指標(biāo)比較結(jié)果
[0060]
【權(quán)利要求】
1.混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑的制備方法，包括以下操作步驟: ①制備益生菌原液 將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的枯草芽孢桿菌YB-1 CGMCC N0.5116、蠟狀芽孢桿菌YB-2 CGMCC N0.5117和彎曲芽孢桿菌XH-1 CGMCC N0.5115，分別加入2116E培養(yǎng)基，PH7.0~7.5，33~37°C震蕩培養(yǎng)12~16h，再以1:1:1的體積比混合，制備成益生菌原液； ②液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 向在密閉式發(fā)酵反應(yīng)器中加入發(fā)酵液，并按0.1~1%的體積比加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再將步驟①制備的益生菌原液，按3-5%的體積比接種，進(jìn)行發(fā)酵，壓力為0.1~0.25Mpa，37°C發(fā)酵24h，制得發(fā)酵產(chǎn)物； ③噴霧干燥處理 上述步驟②所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧到吸附和懸浮復(fù)合載體，干燥處理； 其中，步驟①所說(shuō)的海水LB瓊脂培養(yǎng)基和2116E培養(yǎng)基，均為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中培養(yǎng)基配方； 步驟②所說(shuō)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由玉米粉:豆柏粉:海水按(1.5~3):(0.5-1.5):100的重量比組成； 步驟③所述的復(fù)合載體的組成為:沸石粉、硅藻土粉和稻殼按2:2:1的體積比混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟③所述的復(fù)合載體，沸石粉和硅藻土粉為150~200目。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制`備方法，其特征在于，步驟①中菌懸液的菌體濃度均為lX108cfu/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于還包括:向步驟③制得的產(chǎn)物中加入復(fù)合載體，混合并使菌含量的終濃度為約為108-10lclcfu/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，向步驟③制得的產(chǎn)物中加入復(fù)合載體的重量比為1:1~1000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，步驟③中發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到復(fù)合載體的方法為:發(fā)酵培養(yǎng)液與載體重量比為1:1~4，干燥時(shí)間為12~24h，產(chǎn)物水份含量不高于5%。
7.如權(quán)利要求1所述的方法制備的混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑。
8.如權(quán)利要求7所述的混菌發(fā)酵法制海參養(yǎng)殖水體修復(fù)劑在海參養(yǎng)殖方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01K61/00GK103739085SQ201310717946
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】徐永平, 尤建嵩, 李淑英, 李紀(jì)彬, 周俊龍, 徐牧, 馬欣, 高玉平, 劉士茹 申請(qǐng)人:大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司