一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其處理方法是將選取的外植體經(jīng)消毒處理后，將外植體傷口處因消毒變色的部分切下，再切成1-1.5cm長，帶一個腋芽的莖段，將莖段接種在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每瓶接種1-2個莖段，接種后置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明利用氨芐青霉素和硫酸鏈霉素組合，能夠降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體的污染率，提高成活率。
【專利說明】一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于茶樹組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茶餓{Camellia sinensis L.Kuntze.)屬山茶科，山茶屬，是一種多年生的木本、常綠植物。茶樹組織培養(yǎng)開始于上個世紀(jì)60年代。目前，茶樹組織培養(yǎng)已經(jīng)通過對茶樹的種子、莖段、腋芽、花藥等進(jìn)行培養(yǎng)獲得了完整的再生植株。茶樹是自身攜帶內(nèi)生菌較多的一種植物，因此，在進(jìn)行組織培養(yǎng)過程中外植體污染嚴(yán)重，嚴(yán)重制約著茶樹組織培養(yǎng)的發(fā)展。因此，研究一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法成為本領(lǐng)域目前迫切需要解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，該方法能夠降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體發(fā)生的污染，提高成活率。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于:具體步驟如下:
(1)取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；
(2)將外植體剪成小段 ，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒20-25s，無菌水沖洗2遍；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍；再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗3-5遍；
(3)將外植體切口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長，帶一個腋芽的莖
段；
(4)將上述莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種1-2個莖段，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0005]所述培養(yǎng)基為:MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 瓊脂粉 6.5g，pH 值調(diào)至5.6-5.8，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min。
[0006]培養(yǎng)基中加入抗生素的組成成分及濃度如下:
氨芐青霉素:200mg/L ；
硫酸鏈霉素:150mg/L。
[0007]所述含抗生素的培養(yǎng)基是將抗生素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌后，加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中。
[0008]培養(yǎng)條件為:溫度23-25 V，光照強度1500-20001x，光照時間12h/d，培養(yǎng)30d-35d。
[0009]本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于:
(I)本發(fā)明能有效降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體的污染，提高組織培養(yǎng)的成功率。[0010](2)本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和硫酸鏈霉素，能達(dá)到較好的抑菌效果，使外植體的污染率降低35%-37 %，萌芽率達(dá)42%-44%。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其具體步驟如下:
(1)取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；
(2)將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒20s，無菌水沖洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗5遍；
(3)將外植體傷口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長，帶一個腋芽的莖段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 瓊脂粉 6.5g 配制培養(yǎng)基，將 pH 值調(diào)至5.6，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min ；
(5)將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌，按每升培養(yǎng)基加入200mg氨芐青霉素和150mg硫酸鏈霉素的比例，分別將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中；
(6)將處理后的莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種2個莖段，共接種30個，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度23 °C，光照強度15001x，光照時間12h/d,培養(yǎng)30d后，污染率35.91%,萌芽率42.63%。
`[0012]實施例2
一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其具體步驟如下:
(1)取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；
(2)將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒23s，無菌水沖洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗4遍；
(3)將外植體傷口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長、帶一個腋芽的莖段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 瓊脂粉 6.5g 配制培養(yǎng)基，將 pH 值調(diào)至5.7，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min ；
(5)將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌，按每升培養(yǎng)基加入200mg氨芐青霉素和150mg硫酸鏈霉素的比例，分別將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中；
(6)將處理后的莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種I個莖段，共接種30個，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度24 °C，光照強度18001x，光照時間12h/d,培養(yǎng)33d后，污染率36.64%,萌芽率43.29%。
[0013]實施例3
一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其具體步驟如下:
(I)取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；(2)將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒25s，無菌水沖洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗3遍；
(3)將外植體傷口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長、帶一個腋芽的莖段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 瓊脂粉 6.5g 配制培養(yǎng)基，將 pH 值調(diào)至5.8，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min ；
(5)將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌，按每升培養(yǎng)基加入200mg氨芐青霉素和150mg硫酸鏈霉素的比例，分別將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中；
(6)將處理后的莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種2個莖段，共接種30個，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25 °C，光照強度20001x，光照時間12h/d,培養(yǎng)35d后，污染率36.87%,萌芽率43.96%。
[0014]實施例4不同濃度氨芐青霉素和硫酸鏈霉素對內(nèi)生菌的抑制效果 一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其具體步驟如下:
(1)取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體；
(2)將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒25s，無菌水沖洗2遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗5遍；
(3)將外植體傷口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長、帶一個腋芽的莖段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 瓊脂粉 6.5g 配制培養(yǎng)基，將 pH 值調(diào)至5.6，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min ；
(5)將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌，按所需濃度將氨芐青霉素和硫酸鏈霉素加入培養(yǎng)基中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中；
(6)將處理后的莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種2個莖段，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度25 °C，光照強度15001x，光照時間12h/d，培養(yǎng)30d。
【權(quán)利要求】
1.一種降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)取春季生長健壯的、帶飽滿腋芽的茶樹莖段為外植體； (2)將外植體剪成小段，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒20-25s，無菌水沖洗2遍；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒4min，無菌水沖洗2遍；再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的升汞消毒5min，無菌水沖洗3-5遍； (3)將外植體切口處因消毒變色的部分切下，然后切成1-1.5cm長，帶一個腋芽的莖段； (4)將上述莖段接在含有抗生素的培養(yǎng)基上，每個瓶子接種1-2個莖段，接種后放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基為:MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+蔗糖30g+瓊脂粉6.5g，pH值調(diào)至5.6-5.8，配制好的培養(yǎng)基分裝在500mL的廣口三角瓶中，高溫滅菌20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于:培養(yǎng)基中加入抗生素的組成成分及濃度如下: 氨芐青霉素:200mg/L ； 硫酸鏈霉素:150mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于:所述含抗生素的培養(yǎng)基是將抗生素經(jīng)微孔過濾器抽濾滅菌后，加入到裝有培養(yǎng)基的廣口三角瓶中，搖勻后再分裝到培養(yǎng)瓶中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降低茶樹組織培養(yǎng)過程中外植體污染的方法，其特征在于:培養(yǎng)條件為:溫度23-25 °C，光照強度1500-20001x，光照時間12h/d，培養(yǎng)30d_35d。
【文檔編號】A01H4/00GK103609454SQ201310639348
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】孫威江, 吳婉婉 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)