一株抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis?strain?WB1）菌株，該菌株通過發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵產(chǎn)物可用于防治核桃潰瘍?。˙otryosphaeria?dothidea）、核桃腐爛?。╒alsa?sp.)、楊樹潰瘍?。˙.dothidea）和七葉樹潰瘍?。˙.dothidea）等多種林木病害。該菌株已于2013年11月6號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.8439。該菌株的獲得，有望為核桃潰瘍病等的防治提供一個安全、環(huán)保、有效的途徑，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株抗核桃潰痛病的核桃內(nèi)生菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一株對核桃潰瘍病菌有拮抗作用的內(nèi)生菌及其在防治核桃潰瘍病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物內(nèi)生菌是指生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物。內(nèi)生菌因溶磷、固氮、產(chǎn)生植物激素、誘導(dǎo)抗蟲抗病、抗逆等強大生理和生態(tài)功能而倍受關(guān)注。近年來發(fā)現(xiàn)，許多植物內(nèi)生菌還能夠產(chǎn)生具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，引起了人們巨大的興趣。從微生物中尋找發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物，是新農(nóng)藥研制的重要途徑。由于內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境條件的影響，可以在植物體內(nèi)繁殖和傳遞，使之成為生物防治中極具潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌。
[0003]中國核桃產(chǎn)業(yè)近年來發(fā)展迅猛，但由于大規(guī)模集中連片的栽培方式，加之樹體高大、林內(nèi)郁閉、通風(fēng)條件差，使得以核桃潰瘍病(Botryosphaeria dothidea)等為代表的樹干部病蟲害迅速蔓延、發(fā)生面積大。其危害造成樹勢迅速衰弱、死亡。核桃潰瘍病是核桃樹干上的一種常見病害，早在上世紀(jì)的1915年，美國加利福尼亞州即已發(fā)現(xiàn)此病，在國內(nèi)如陜西、河北、河南、山東、江蘇、安徽等省均有其分布。病株率一般為20%-40%，重病區(qū)可達70%以上，不僅影響當(dāng)年的產(chǎn)量，而且削弱樹勢，導(dǎo)致過早衰亡。本病除為害核桃外，還發(fā)生于垂柳、刺槐、楓楊、中槐、蘋果及多種楊樹。
[0004]對于核桃潰瘍病的防治，目前生產(chǎn)上主要依靠林業(yè)栽培管理措施和化學(xué)農(nóng)藥進行防治。但由于該病發(fā)病初期隱藏潛伏于樹皮下危害，侵染初期樹皮表面危害癥狀不明顯，果農(nóng)易忽視其存在，又因其具有較長的潛伏期、較長的發(fā)病周期和多點危害的特點，在防治中需要一個生長周期多次處理、多次施用化學(xué)農(nóng)藥，才能較好的控制其危害。存在防治成本高、耗時長、污染環(huán)境等問題。尋求新的經(jīng)濟高效、綠色環(huán)保的防治技術(shù)與途徑已成為當(dāng)前核桃潰瘍病防治中迫切解決的問題。關(guān)于利用具有生防作用的內(nèi)生菌來進行植物病害的防治生產(chǎn)上已有成功的案例，研究開發(fā)針對核桃潰瘍病防治的內(nèi)生菌是治療該病的一條值得期待的新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供一種抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株(Bacillussubtilis strain WBl)及其應(yīng)用，并通過試驗證明該菌株WBl能夠用于防治核桃潰瘍病。
[0006]為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案:
[0007]一種抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株，其特征在于，該抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis strain WBl)菌株，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.8439。
[0008]經(jīng)測定，該枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis strain WBl)菌株的16SrDNA序列如下所示:
【權(quán)利要求】
1.一種抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株,其特征在于,該抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis strain WBl)菌株,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.8439。
2.如權(quán)利要求1所述的抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株，其特征在于，該枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis strain WBl)菌株的 16SrDNA 序列如下所不:
I gcctgagggg gctgacttac gtgcgagtcg agcggacaga tagggtagct tgctccctga 。 61 tgttagcggc ggacgaggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact
。121 ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg
。181 tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 。 241 gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga
。301 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt
。361 ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag
。421 ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac
。481 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 。 541 tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 。 601 ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 。 661 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 。 721 tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 。 781 ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 。 841 aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga
。901 cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 。 961 ccaggtcttg aca tcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg
。1021 acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 。 1081 gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg.1141 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct
.1201 acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc
.1261 acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc . 1321 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc
..1381 gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagt taacctccta ggagccagcc
.1441 tctagagcct cacccccc。
3.如權(quán)利要求1所述的抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株，其特征在于，該枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis strain WBl)菌株的抗菌素TasA基因序列如下所不:
I ggagaaaaag aaattgagtt taggagttgc ttctgcagca ctaggattag ttttagttgg . 61 aggaggaaca tgggcagcat ttaacgacat taaatcaaag gatgctactt ttgcatcagg . 121 tacgcttgat ttatctgcta aagagaattc agagagtgtg aacttatcaa atctaaagcc . 181 gggagataag ttgacaaagg atttccaatt tgaaaataac ggatcacttg cgatcaaaga .. 241 agttttaatg gcgcttaatt atggagattt taaagcaaac ggcggcagca atacatctcc . 301 agaagatttc ctcagccagt ttgaagtgac attgttgaca gttggaaaag agggcggcaa
.361 tggttacccg aaaaacatta ttttagatga tgcgaacctt aaagacttgt atttgatgtc` 421 tgctaaaaat gatgcagcgg ctgctgaaaa aatcaaaaaa caaatagacc ctaaattctt ` 481 aaatgcaagc ggtaaagtca atgtagcaac aattgacggt aaaaccgctc ctgaatatga ` 541 tggtgttcca aaaacaccaa ctgacttcga tcaggttcaa atggaaatcc aattcaaaga ` 601 tgataaaaca aaagatgaaa acgggcttat ggttcaaaat aaatatcaag gcaactccat ` 661 taagcttcaa ttctcgttcg aagctacaca gtggaacggc ttgacaatca aaaaggacca ` 721 tactgataaa gacggttatg tgaaagaaaa tgaaaaagcg cacagcgagg taataa。
4.權(quán)利要求1所述的抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株的室內(nèi)培養(yǎng)方法，其特征在于，選擇PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該PDA培養(yǎng)基的pH值為7.0-8.5，培養(yǎng)溫度25°C~30°C，黑暗條件。
5.權(quán)利要求1至3其中之一所述的抗核桃潰瘍病的核桃內(nèi)生菌菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液用于制備防治核桃潰瘍病的生防制劑應(yīng)用。
6.如權(quán)利5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:LB液體培養(yǎng)基，pH值`7.0-8.0,轉(zhuǎn)速 80-150rpm，`25-3(TC。
【文檔編號】A01N63/02GK103725628SQ201310628960
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】唐光輝, 余仲東, 王嬌莉, 王敦, 馮紀(jì)年 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)