表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡rna的dna分子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應用。本發(fā)明所提供的DNA分子的結(jié)構(gòu)為SEQ正向-X-SEQ反向，所述SEQ正向的序列為序列1的第1-345位；所述SEQ反向的序列與所述SEQ正向的序列反向互補；所述X是所述SEQ正向與所述SEQ反向之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補。實驗證明，將所述DNA分子轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因株系，進行蚜蟲飼喂試驗，麥長管蚜食用轉(zhuǎn)基因葉片后，羧酸酯酶基因表達量和酶活性顯著降低、繁殖率下降，且其對辛硫磷溶劑的耐受性降低20-30%?？梢姡景l(fā)明對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上害蟲的防治具有重要意義。
【專利說明】表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及一種表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應用。
【背景技術】
[0002]蚜蟲是小麥生產(chǎn)中的主要害蟲，主要有麥無網(wǎng)長管蚜(Metopolophiumdirhodum),麥二叉姆(Schizaphis graminum),禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi )和麥長管蟲牙(Sitobion avenae),分布極廣,幾乎遍及世界各產(chǎn)麥國。姆蟲以成蟲、若蟲吸取小麥汁液危害小麥，排到葉片上的蜜露降低光合作用，并傳播多種病毒病，包括大麥黃矮病毒，導致小麥產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降。
[0003]目前，防治小麥蚜蟲或者其他害蟲主要還是依靠化學殺蟲劑，雖然在一定程度上能夠減少蟲害所帶來的產(chǎn)量下降，但是長期的使用化學殺蟲劑不但費用較高而且容易使蚜蟲產(chǎn)生相應的抗性，同時導致蚜蟲天敵殺傷嚴重，環(huán)境污染加劇。
[0004]近年來，隨著蚜蟲抗藥性的增強，化學殺蟲劑的使用濃度和藥用量也呈現(xiàn)增長的趨勢。
[0005]植物介導的dsRNA確可以長效的抑制目標基因的表達，達到生產(chǎn)上控制害蟲的目的，這種利用植物表達與昆蟲特定基因匹配的雙鏈RNA分子，當昆蟲取食這類植物后，其靶基因的表達被明顯降低，這種技術不僅為昆蟲的功能基因組研究提供了便捷的方法，也為農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供了特異性更強且環(huán)境安全的新思路、新技術。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0006]本發(fā)明的目的是提供一種表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應用。
[0007]本發(fā)明所提供的DNA分子具體為如式(I)所示的DNA片段:
[0008]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0009]所述序列為序列表中序列I的第1-345位；
[0010]所述SEQ_的序列與所述序列反向互補(序列I的第1513-1857位)；
[0011]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補。
[0012]在本發(fā)明中，式(I)中所述X為FAD2內(nèi)含子序列,具體如序列表中序列2所示。
[0013]更加具體的，式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0014]含有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0015]所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0016]在本發(fā)明中，所述重組表達載體中啟動所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為rbcS啟動子。
[0017]進一步,所述rbcS啟動子的序列如序列表中序列3所示。
[0018]在本發(fā)明的一個實施例中，所述重組表達載體具體為在pBAC-rbcs-sNTL載體的酶切位點插入序列I所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒；所述酶切位點具體為Kpn I和BamH
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[0019]由以上式(I)所示DNA片段編碼得到的RNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020]以上式(I)所示DNA片段，或所述重組表達載體、表達盒或重組菌，或所述RNA分子在如下al)_a6)任一中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
[0021 ] al)抑制麥長管蚜羧酸酯酶表達；
[0022]a2)降低麥長管蚜羧酸酯酶活性；
[0023]a3)降低麥長管蚜的耐藥性；
[0024]a4)降低麥長管蚜的 繁殖率；
[0025]a5)防治麥長管蚜；
[0026]a6)培育抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物。
[0027]本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0028]本發(fā)明所提供的培育抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:將以上式(I)所示DNA片段導入目的植物中，得到抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物；
[0029]所述抗麥長管蚜具體體現(xiàn)在如下bl) _b4)中的至少一種:
[0030]bl)抑制麥長管蚜的羧酸酯酶表達；
[0031]b2)降低麥長管蚜的羧酸酯酶活性；
[0032]b3)降低麥長管蚜的耐藥性；
[0033]b4)降低麥長管蚜的繁殖率。
[0034]進一步，在本發(fā)明的一個實施例中，al)和bI)中所述抑制麥長管蚜的羧酸酯酶表達具體為使麥長管蚜的羧酸酯酶編碼基因在RNA水平的表達量降低。
[0035]在本發(fā)明中，a3)和b3)中所述耐藥性中的“藥”具體為辛硫磷溶劑。所述辛硫磷溶劑的化學名稱為0，0- 二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式為C12H15N2O3PS,分子量為 298.18。
[0036]在以上所述的應用或方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物；在本發(fā)明中，所述植物為單子葉植物小麥，具體為小麥品種遼春10號。在本發(fā)明的一個實施例中，所述麥長管蚜具體為一齡麥長管蚜。
[0037]本發(fā)明通過RT-PCR方法克隆了麥長管蚜羧酸酯酶基因(SaCbE E4)片段，進一步構(gòu)建了此基因片段的發(fā)夾RNAi構(gòu)件。將該構(gòu)件轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織，獲得了轉(zhuǎn)基因株系。蚜蟲飼喂試驗表明，麥長管蚜食用轉(zhuǎn)基因葉片后，羧酸酯酶基因表達量和酶活性顯著降低、繁殖率下降，且其對辛硫磷溶劑的耐受性降低20-30%。可見，本發(fā)明對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上害蟲的防治具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為麥長管蚜總RNA的電泳檢測結(jié)果。其中，泳道I和2為兩個重復，均為麥長管蚜總RNA。[0039]圖2為RT-PCR獲得SaCbE E4基因片段(約0.35kb)。其中，泳道M為DAN分子量標準2000bp DNA Ladder ;泳道I為利用第一對引物(Pl_sR和Pl_sF)PCR擴增所得添加了BamH I和Hind III酶切位點的SaCbE E4基因片段，命名為CbE E4-1。泳道2為利用第二對引物(Pl-asR和Pl_asF)PCR擴增所得添加了 Kpn I和Sac I酶切位點的SaCbE E4基因片段，命名為CbE E4-2。
[0040]圖3為pHurricane載體的質(zhì)粒圖譜。
[0041]圖4為重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-CbE E4的酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道Ml為DAN分子量標準IKb DNA Ladder ;泳道M2為DAN分子量標準2000bp DNA Ladder ;泳道I為pTE-CbEE4-1的Hind III和BamH I酶切結(jié)果；泳道2為pHurricane載體的Hind III和BamH I酶切結(jié)果；泳道3為重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-CbE E4的Hind III和BamHI酶切結(jié)果。
[0042]圖5為重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4R的酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道Ml為DAN分子量標準IKb DNA Ladder ;泳道 M2 為 DAN 分子量標準 2000bp DNA Ladder ;泳道 I 為 pTE-CbE E4-2的Kpn I和Sac I酶切結(jié)果；泳道2為pBSK_FAD2Il_CbE E4的Kpn I和Sac I酶切結(jié)果；泳道3為重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4R的Kpn I和Sac I酶切結(jié)果。
[0043]圖6為pBAC-rbcs-sNTL載體的質(zhì)粒圖譜。
[0044]圖7為重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-CbE E4的酶切鑒定結(jié)果。其中，泳道M為DAN分子量標準IKb DNA Ladder ;泳道I為pBAC-rbcs-sNTL的Kpn I和BamH I酶切結(jié)果；泳道2為pBSK-CbE E4R的Kpn I和BamH I酶切結(jié)果；泳道3為重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-CbE E4的KpnI和BamH I酶切結(jié)果。
[0045]圖8為重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4的質(zhì)粒圖譜。其中，位于BamH I和KpnI之間的“CbE-1ntron-CbE”即為序列3所示的RNAi構(gòu)件。
[0046]圖9為SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的PCR鑒定。其中，A為T3代轉(zhuǎn)基因植株用針對RNAi構(gòu)件的引物對P4-F/P4-R進行PCR擴增的結(jié)果(箭頭處為約0.35kb目的條帶);B為T3代轉(zhuǎn)基因植株用針對FAD2IntronI的引物對P6-R/P6-F進行PCR擴增的結(jié)果(箭頭處為約Ikb目的條帶)。A和B中，泳道M均為DNA分子量標準DL2000Marker ;泳道+均為陽性對照pBAC-rbcs-CbE E4質(zhì)粒；泳道-均為陰性對照未轉(zhuǎn)基因小麥；泳道1_9均為轉(zhuǎn)基因植株，在兩次擴增中均出現(xiàn)目的條帶(即A和B中均出現(xiàn)目的條帶)的為陽性植株。
[0047]圖10為SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶基因表達量干擾效果分析結(jié)果。其中，A為麥長管蚜取食轉(zhuǎn)基因小麥葉片I天后的檢測結(jié)果出為麥長管蚜取食轉(zhuǎn)基因小麥葉片3天后的檢測結(jié)果；C為麥長管蚜取食轉(zhuǎn)基因小麥葉片5天后的檢測結(jié)果。*表示差異顯著(p〈0.05) ;**表示差異極顯著(p〈0.01)。
[0048]圖11為SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶活性影響分析結(jié)果。*表不差異顯著(P〈CL 05) ;**表不差異極顯著(p〈0.01)。
[0049]圖12為SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜耐藥性干擾效果分析結(jié)果。
[0050]圖13為SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜繁殖率的影響分析結(jié)果。**表不差異極顯著(p〈0.0Do
【具體實施方式】
[0051 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0052]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053]麥長管姆(Sitobion avenae):從中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站小麥試驗田獲得,按照“王春芝，3種小麥蚜蟲的形態(tài)識別與防治技術，農(nóng)技服務，2008，25 (3):50，58” 一文記載的方法，鑒定證實確為麥長管姆(Sitobion avenae)。其形態(tài)學特征如下:無翅孤雌姆體長
3.1_，寬1.4_，長卵形，草綠色至橙紅色，有時頭部帶紅色或褐色，腹部兩側(cè)有不明顯的灰綠至灰黑色斑。觸角黑色，第3節(jié)有8 —12個感覺圈排成一行。腹部第6— 8節(jié)及腹面具橫網(wǎng)紋，無緣瘤。喙粗大，黑色，長度超過中足基節(jié)。腹管長圓筒形，黑色，長為體長的1/4，在端部有十幾行網(wǎng)紋。有翅孤雌蚜體長3.0mm，橢圓形，綠色。喙不達中足基節(jié)。腹管長圓筒形，黑色，端部具15~16行橫行網(wǎng)紋，尾片長圓錐狀，有8~9根毛。若蚜體綠色，有時粉紅色，復眼紅色，一般體較短。
[0054]pHurricane載體:記載于“張付蕓，陳偉霞,劉子渲,李保云,梁榮奇.小麥SS I1-A基因片段的克隆及其RNAi表達載體的構(gòu)建.中國農(nóng)學通報，2011，27 (7):50_54”一文中的“H質(zhì)粒”。
[0055]pBAC35SIH3載體:記載于“隋曉燕，趙琰，王樹彬等.無載體框架結(jié)構(gòu)的大豆鐵蛋白線性表達盒提高小麥籽粒鐵含量的研究.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2012，20(7):766~773”一文中，用于基因槍遺傳轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織的篩選。
[0056]小麥(Triticum aestivum L.)品種遼春10號:由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院用雜交方法選育的強筋小麥新品種，1998年通過全國農(nóng)作物品種審定委員會審定。參見“劉振元.強筋麥新品種遼春10號高產(chǎn)栽培技術.中國種業(yè)，2001年第6期”一文。公眾可從商業(yè)途徑獲得，也可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得，以重復本申請實驗。
[0057]實施例1、表達抑制麥長管蚜羧酸酯酶的發(fā)卡RNA的DNA分子的獲得
[0058]一、麥長管蚜羧酸酯`酶基因SaCbE E4目的片段獲得
[0059]設計如下2 對引物 Pl-sF/Pl-sR 和 Pl-asF/Pl-asR:
[0060]Pl-sF:5，-GGATCCAAGTATTGCGCAAGATGAGGGTC-3，(下劃線處為 Bam H I 酶切位點，其后的序列為序列I的第1-23位)；
[0061]Pl-sR:5，-AAGCTT GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’(下劃線處為 Hind III 酶切位點，其后的序列為序列I的第324-345位的反向互補序列)。
[0062]Pl-asF:5，_GGTACC AAGTAITGCGCAAGATGAGGGTC-3’(下劃線處為 Kpn I 酶切位點，其后的序列為序列I的第1-23位)；
[0063]Pl-asR:5’ -GAGCTC GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’(下劃線處為 Sac I 酶切位點，其后的序列為序列I的第324-345位的反向互補序列)。
[0064]2對引物的擴增片段長度均為345bp (不包括額外添加的酶切位點)。
[0065]取麥長管蚜成蟲，按照美萊博RNA提取試劑盒提取總RNA(圖1)。圖中，28S、18S都很清晰，說明提取的總RNA可以用于RT-PCR。以該總RNA為模板、分別以第一對引物(Pl_sR和Pl-sF)和第二對引物(Pl-asR和Pl-asF)進行RT-PCR，均得到0.35Kb左右的麥長管蚜羧酸酯酶基因SaCbE E4目的片段(圖2)，分別將目的片斷從瓊脂糖膠回收后連到pGEM-Teasy載體(promega公司)上,熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株,經(jīng)藍白斑篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒，并進行酶切鑒定及測序。
[0066]將經(jīng)測序表明在pGEM-Teasy載體上連入大小約為0.35Kb的DNA片段I (命名為DNA片段CbE E4-1) “GGATCC+序列I的第1-345位+AAGCTT，，的重組質(zhì)粒命名為pTE_CbEE4-1 ;將經(jīng)測序表明在pGEM-Teasy載體上連入大小約為0.35Kb的DNA片段2 (命名為DNA片段CbE E4-2)“GGTACC+序列I的第1-345位+GAGCTC”的重纟目質(zhì)粒命名為DTE-CbE E4-2。
[0067]二、重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4的構(gòu)建及鑒定
[0068]1、目的片段反向插入FAD2Intronl的下游
[0069]用BamH I和Hind III同時酶切步驟一構(gòu)建的pTE-CbE E4-1以及pHurricane載體(質(zhì)粒圖譜如圖3所示)，電泳后分別回收前者約0.35Kb片段和后者的大片段，連接這兩個片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a菌株，涂板，挑斑，搖菌，提取重組質(zhì)粒，將其命名為pBSK-FAD2Il-CbE E4。
[0070]用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III對pTE-CbE E4-1、pHurricane載體，以及重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-CbE E4分別進行雙酶切。結(jié)果如圖4所示，酶切pTE_CbE E4-1得到約
0.35Kb的目的片段(泳道I )，酶切pHurricane載體得到約4.0kb的片段(泳道2)，而酶切重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-CbE E4得到一條約4.0kb的片段和一條約0.35kb的片段(泳道3)，其中大片段同pHurricane載體大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pTE_CbE E4-1切下的0.35kb的目的片段已經(jīng)反向連接到pHurricane載體上。
[0071]進一步，對所述重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-CbE E4進行序列測定，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pBSK-FAD2Il-CbE E4為在pHurricane載體上位于FAD2Intronl下游的酶切位點BamH I和Hind III之間反向插入序列I的第1-345位后得到的重組質(zhì)粒。
[0072]2、目的片段正向插入FAD2Intronl的上游
[0073]用Kpn I 和 Sac I 同時酶切步驟一構(gòu)建的 pTE-CbE E4-2 以及 pBSK_FAD2Il_CbEE4載體，電泳后分別回收前者約0.35Kb片段和后者的大片段，連接這兩個片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)，涂板，挑斑，搖菌，提取重組質(zhì)粒，將其命名為pBSK-CbEE4-1R。
[0074]用限制性內(nèi)切酶KpnI 和 Sac I 對pTE-CbE E4-2、pBSK_FAD2Il_CbE E4，以及重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4-1R分別進行雙酶切。結(jié)果如圖5所示，酶切pTE-CbE E4-2得到約0.35kb的目的片段(泳道I )，酶切pBSK-FAD2I1-CbE E4得到約4.35kb的片段(泳道2)，而酶切重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4-1R得到一條約4.35kb的片段和一條約0.35kb的片段(泳道3)，其中大片段同pBSK-FAD2Il-CbE E4大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pTE_CbE E4-2上切下的0.35kb的目的片段已經(jīng)連接到pBSK-FAD2Il-CbE E4上。
[0075]進一步，對所述重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4-1R進行序列測定，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4-1R 為在 pBSK-FAD2I1-CbE E4 載體上位于 FAD2Intronl 上游的酶切位點 KpnI和Sac I之間正向插入序列I的第1-345位后得到的重組質(zhì)粒。
[0076]在重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4-1R中，位于酶切位點Kpn I和BamH I之間的序列即為RNAi構(gòu)件。所述RNAi構(gòu)件的序列為序列表中序列I所示。
[0077]3、將RNAi構(gòu)件置于rbcS啟動子下游
[0078]用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I同時雙酶切pBAC-rbcs-sNTL載體(質(zhì)粒圖譜如圖6所示，構(gòu)建過程見下文)和以上構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBSK-CbE E4-1R，電泳后分別回收前者大小約為4kb的片段和后者大小約為1.88kb的片段，連接這兩個片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂板，挑斑，搖菌 ，提取重組質(zhì)粒，將其命名為pBAC-rbcs-CbE E4。
[0079]用限制性內(nèi)切酶Kpn I 和 BamH I 對 pBSK-CbE E4-1R、pBAC-rbcs_sNTL，以及重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-CbE E4分別進行雙酶切。結(jié)果如圖7所示，酶切pBAC-rbcs-sNTL可得到一條大小約為4kb的骨架片段(泳道I )，酶切pBSK-CbE E4R可得到一條大小約為1.88kb的目的片段(泳道2)，而酶切重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-CbE E4則得到一條約4kb的片段和一條約為1.88kb的片段(泳道3)，其中大片段同pBAC-rbcs-sNTL酶切后的骨架片段大小相符，小片段同目的片段大小相符，證明從pBSK-CbE E4R上切下的約1.Skb的目的片段已經(jīng)連接到pBAC-rbcs-sNTL 的 Kpn I 和 BamH I 位點之間。
[0080]進一步,對所述重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-CbE E4進行序列測定，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pBAC-rbcs-CbE E4為在pBAC-rbcs-sNTL載體的rbcS啟動子下游的酶切位點Kpn I和BamHI之間插入序列表中序列I后得到的重組質(zhì)粒。
[0081]重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4的質(zhì)粒示意圖如圖8所示。在重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4中，啟動所述序列I所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子為rbcS啟動子,其核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列I由1857個核苷酸組成。其中，第1-345位為SaCbE E4基因片段的正向序列；第378-1495位為FAD2內(nèi)含子核苷酸序列(序列2);第1513-1857位為所述SaCbE E4基因片段的反向序列。正向序列和反向序列之間由一段內(nèi)含子(intixm)序列隔開以維持載體的穩(wěn)定性；該系統(tǒng)在植物細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)的dsRNA，引發(fā)RNAi，從而可用于抑制目的基因的表達。
[0082]其中，pBAC-rbcs-sNTL載體的構(gòu)建方法及后續(xù)的篩選鑒定過程參見文獻uSambrook J,Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning - A laboratory Mauual, 2nded., New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.”。具體方法如下:
[0083]I)將載體PBAC202 (參考文獻“高澤發(fā)，陳旭清，楊鳳萍，梁榮奇，張立全，張曉東.人工合成gna基因在小麥中的表達 及其抗蚜蟲效果研究，農(nóng)業(yè)生物技術學報，2006，14(4): 559-564”)用 BamH I 和 Kpn I 酶切，回收 3.8Kb 載體片段。
[0084]2)由上海捷瑞生物工程有限公司人工化學合成sNTL基因全長(5’端加上BamH I酶切位點，3’端加上Kpn I酶切位點)，經(jīng)過DNA測序證明正確。sNTL基因⑶S全長為序列表中序列4。
[0085]3)BamH I和Kpn I雙酶切上一步獲得的sNTL基因片段和用BamH I和Kpn I酶切載體pBAC202得到的3.8kb載體片段連接后，選擇sNTL方向和rbcs啟動子方向一致的重組載體，命名為pBAC-rbcs-sNTL。重組載體pBAC-rbcs-sNTL的結(jié)構(gòu)描述為:在載體pBAC202的酶切位點BamH I和Kpn I之間插入了序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組載體。
[0086]實施例2、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的獲得及鑒定
[0087]一、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的獲得
[0088]選取開花后12-15天的小麥品種遼春10號的幼穗，將其種子消毒后剝?nèi)∮着撸芷蛏现糜谟着呓臃N培養(yǎng)基(配方:MS基本培養(yǎng)基+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉7g/L，pH5.8。各濃度為相應組分在培養(yǎng)基中的終濃度)上，25土TC暗培養(yǎng)3-5天誘導出小麥愈傷組織。選擇生長狀態(tài)良好的愈傷組織塊進行基因槍共轉(zhuǎn)化(將pBAC-rbcs-CbE E4和pBAC35SIH3按照3:1摩爾比混合，其中pBAC35SIH3質(zhì)粒帶有除草劑Basta的抗性基因bar)，轉(zhuǎn)化后的愈傷25土 TC暗培養(yǎng)2_3天后移至篩選培養(yǎng)基(配方:幼胚接種培養(yǎng)基+Basta2-25mg/L。各濃度為相應組分在培養(yǎng)基中的終濃度)上進行除草劑抗性篩選；觀察篩選1-2周之后，將生長狀態(tài)良好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(配方:MS基本培養(yǎng)基+玉米素lOmg/L+Basta0.5mg/L, pH5.8。各濃度為相應組分在培養(yǎng)基中的終濃度)上使其分化，大約4-5周后可分化出幼苗，將其轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基(配方:MS培養(yǎng)基+IAA10mg/L，PH5.8。各濃度為相應組分在培養(yǎng)基中的終濃度)中進行生根壯苗；煉苗2-3天后移栽至土壤中可長成Ttl代轉(zhuǎn)基因植株。
[0089]同時設置向小麥品種遼春10號中轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的對照。
[0090]二、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的鑒定
[0091]用針對RNAi構(gòu)件的引物對P4-F/P4-R，以及針對FAD2Intronl的引物對P6-R/P6-F對步驟一獲得具有Basta抗性的SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥的Ttl-T4代植株進行PCR鑒定。以重組表達載體pBAC-rbcs-CbE E4作為陽性對照，未轉(zhuǎn)基因的小麥品種遼春10號為陰性對照，同時設置向小麥中轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL的空載體對照。實驗重復3次。
[0092]針對RNAi構(gòu)件的引物:
[0093]P4-F:5’ -AAGTAITGCGCAAGATGAGGGTC-3’(序列 I 的第 1-23 位)；
[0094]P4-R:5’-GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’ (序列 I 的第 324-345 位的反向互補序列)。
[0095]針對FAD2Intronl 的引物:
[0096]P6-F:5’ -GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3，(序列 2 的第 79-101 位)。
[0097]P6-R:5’-CCGCTCACGATAGATCTGCT-3’(序列 2 的第 1004-1023 位的反向互補序列)；
[0098]結(jié)果如圖9所示，作為陽性對照的pBAC-rbcs-CbE E4質(zhì)粒擴增出大小約為0.35kb和Ikb的兩個目標帶，而作為陰性對照 的未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL的空載體的植株均沒有擴出目標片段；而SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可同時擴增出0.35kb和Ikb左右的兩個目標片段的為陽性植株。從陽性植株中隨機選取兩株，分別命名為SadsCbEl-5和SadsCbE2-2。
[0099]實施例3、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜防治效果研究
[0100]麥長管蚜種群，室內(nèi)飼養(yǎng)蚜蟲三代，期間從未施用過任何殺蟲劑。室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為21±1°C，相對濕度為50-60%，光周期為L:D=16h:8h。蚜蟲飼養(yǎng)在感蚜小麥品種京411上，兩周更換一次新鮮的幼苗用于蚜蟲。
[0101]一、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶基因表達量干擾效果分析
[0102]以處于一齡若蟲時期的麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代處于兩葉一心幼苗期的SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2_2上I天、3天、5天(用紗網(wǎng)單株隔離)。利用qRT-PCR技術分析麥長管蚜體內(nèi)羧酸酯酶基因的表達量。具體操作如下:
[0103]利用Primer5.0軟件設計羧酸酯酶基因SaCbE E4的擴增引物對P2-F/P2-R (擴增片段大小為343bp)，設計內(nèi)參基因P-actin的擴增引物對P3-F/P3-R (擴增片段大小為238bp)。
[0104]羧酸酯酶基因SaCbE E4的擴增引物:
[0105]P2-F:5，-TGGTTGGGAGTGTGGAAC-3，；
[0106]P2-R: 5，-AGCAAATCCTAATACGCCC-3，。
[0107]內(nèi)參基因P -actin的擴增引物:
[0108]P3-F:5， -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3，；
[0109]P3-R: 5，-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3，。
[0110]取分別飼喂在T3代處于兩葉一心幼苗期的SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上I天、3天、5天的麥長管蚜，按照美萊博RNA提取試劑盒提取總RNA0取500ng的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,稀釋10°、IO1UO2UO3' 104、IO5倍，作為熒光定量PCR的模板，檢測以上設計的兩對引物的特異性。
[0111]擴增體系:引物(IOiimol ? OOJiiLJXTrans Start TM Green qPCRSuperMixlO U L、Passive Reference Dye0.4 U L、模板 cDNA2 U L, ddH20 補充至 20 U L。
[0112]PCR 循環(huán)程序:95°C 35s ；95°C 5s，60°C 35s，72°C 10s，35 個循環(huán)；每個樣本 3 個重復。
[0113]最終結(jié)果的計算采用2_AAct法(Ct表示循環(huán)數(shù))進行計算，使用EXcel2003軟件進行統(tǒng)計學分析，具體參見 “Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the2 AAct method.Methods25 (4):402~408.”一文,使用Excel2003軟件進行統(tǒng)計學分析,計算每種處理的平均值與方差，并進行顯著性差異的分析(t-test，n=3, P < 0.01或0.05)。
[0114]實驗重復3次，結(jié)果取平均值。
[0115]同時設置以未轉(zhuǎn)基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0116]結(jié)果如圖10所示，從圖中可以看出，麥長管蚜取食SadsCbEl-5葉片1-3天后，其體內(nèi)羧酸酯酶基因表達量較對照(CK)降低，在第5天時達到極顯著水平(p〈0.01);麥長管蚜取食轉(zhuǎn)基因株系SadsCbE2-2葉片1_3天后，麥長管蚜羧酸酯酶基因表達量較對照(CK)顯著降低(p〈0.05),在第5天時達到極顯著水平(p〈0.01)。而對于用轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?CK)基本一致，無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果表明，SaC·bE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可有效降低麥長管蚜體內(nèi)羧酸酯酶的表達量。
[0117]二、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜羧酸酯酶活性影響分析
[0118]以處于一齡時期的麥長管蚜麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因株系SadsCbE1-5和SadsCbE2-2上3天、5天(用紗網(wǎng)單株隔離)。用蒸餾水沖洗麥長管蚜，然后放在濾紙上吸干，放入玻璃勻漿器中，分別加入濃度為0.04mol/L的pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)冰浴勻漿，勻漿液在4°C下，8000r/min離心IOmin (離心半徑為Ilcm),取上清液作為羧酸酯酶酶源。按照van Asperene方法(參見“Van Asperen KA.studyof housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method.Journal ofInsect Physiology, 1962,8(4):401~414” 一文)測定姆蟲體內(nèi)羧酸酯酶的活性,具體如下:將酶源用濃度0.04mol/L PH7.0PBS溶液適當稀釋后取lml，加入濃度為3X10_4mol/L的底物a -乙酸萘酯(a -NA, Sigma公司生產(chǎn)，目錄號R9461)的水溶液1.0ml和濃度為l(T4mol/L的毒扁豆堿(Sigma公司，目錄號E8375_250mg)的水溶液0.01ml,混勻后于37°C恒溫水浴中反應10min,然后加入0.5ml顯色液,搖勻后靜置15min,于590nm處比色測定，以PBS取代酶液作為對照。其中，顯色液的配方如下:1%固藍B鹽溶液:5%SDS溶液=體積比2: 5，現(xiàn)用現(xiàn)配。其中，1%固藍8鹽(分子式(:141112(:12財02*2%12，分子量475.46，深綠色粉末，溶于水)溶液的配方如下:稱取0.4g固藍B鹽加ddH2025ml，即得1%固藍B鹽溶液。5%SDS (十二烷基苯磺酸鈉)溶液的配方如下:稱取1.0gSDS加ddH2020mL，即得5%SDS溶液。[0119]以上方法測定羧酸酯酶的活性的原理:底物a -乙酸萘酯(a -NA)在羧酸酯酶的作用下發(fā)生水解生成a-萘酚，a-萘酚與固藍B鹽作用，生成深藍色或深紅色物質(zhì)，在590nm處比色測定其吸光度。羧酸酯酶的活性越強，生成a _萘酚的量越大，進而生成的深藍色或深紅色物質(zhì)越多，致使所測得的0D590值越大。在37°C和pH7.0條件下，反應前后每毫升酶液每分鐘使吸光度上升(或下降)1.00，定義為I個酶活單位(U/mLXmin)。
[0120]實驗重復3次，結(jié)果取平均值。
[0121]同時設置以未轉(zhuǎn)基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0122]結(jié)果如圖11所示，從圖中可以看出，麥長管蚜取食SadsCbEl-5葉片3天或5天后，麥長管蚜體內(nèi)羧酸酯酶的活性較對照(CK)均顯著降低(p〈0.05);麥長管蚜取食轉(zhuǎn)基因株系SadsCbE2-2葉片3天或5天后，麥長管蚜體內(nèi)羧酸酯酶的活性較對照(CK)均極顯著降低(p〈0.01)。而對于用轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?CK)基本一致，無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果表明，SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可有效降低麥長管蚜體內(nèi)羧酸酯酶的活性。
[0123]三、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜耐藥性干擾效果分析
[0124]以處于一齡時期的麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上5天(用紗網(wǎng)單株隔離)。
[0125]辛硫磷溶劑:0，0_ 二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式:C12H15N203PS，分子量:298.18。
[0126]辛硫磷溶劑能夠水解a_萘酚，羧酸酯酶能夠酶解辛硫磷溶劑，因此，通過用分光光度計測定a-萘酚的濃度 來估算辛硫磷溶劑，進而估算羧酸酯酶的活性(參考文獻:Devonshire AL.The properties of a carboxylesterase from the peachpotatoaphid, Myzus persicae(Sulz.), and its role in conferring insecticide resistance.Biochem.J., 1977, 167:675 ~683 ；Lan WS, Jian C, Jiang H, et al.Expression andcharacterization of carboxylesterase E4gene from peach-potato aphid(Myzuspersicae)for degradation of Carbaryl and Malathion) ?Biotechno logyLetters, 2005，27:1141-1146)。具體操作如下:
[0127]1、分別取食喂5天的麥長管蚜，用蒸餾水沖洗，然后放在濾紙上吸干，放入玻璃勻漿器中，分別加入0.04mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液(PBS)冰浴勻漿，勻漿液于4°C，8000r/min離心IOmin,取上清液作為羧酸酯酶酶源。
[0128]2、將4mL酶液(對照為0.04mol/L pH=7.0的PBS緩沖液)和ImLlOO u M辛硫磷溶液加入到 15mL10mM KH2P04/K0H 緩沖液(pH=7.5)(配方:將 1.36g 無水 KH2PO4 溶于 1000mL蒸餾水中，用KOH顆粒調(diào)節(jié)pH值至7.5)中，反應體系20mL。37°C溫育。每隔5min取一次樣(2mL)。
[0129]3、中步驟2的2mL溶液中加入濃度為3X 10_4mol/L的底物a -乙酸萘酯(a -NA,Sigma公司生產(chǎn)，目錄號R9461)的水溶液1.0ml和濃度為l(T4mol/L的毒扁豆堿(Sigma公司，目錄號E8375-250mg)的水溶液0.01ml，混勻后于37°C恒溫水浴中反應lOmin，再加入
0.5ml的DBLS，混合均勻后于590nm處比色測定OD值，從而估算羧酸酯酶活性。在37°C和PH7.0條件下，反應前后每毫升酶液每分鐘使吸光度上升(或下降)100，定義為I個酶活單位(U/mLXmin)。其中 DBLS 由 45mg 固藍 B 鹽、4.5mL H2OU0.5mL5%SDS 配制而成。5%SDS(十二烷基苯磺酸鈉)溶液的配方如下:稱取1.0gSDS加ddH2020mL，即得5%SDS溶液。
[0130]實驗重復3次，結(jié)果取平均值。
[0131]同時設置以未轉(zhuǎn)基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0132]結(jié)果如圖12所示，從圖中可以看出，SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因株系上飼喂的麥長管蚜的羧酸酯酶活性降低，對辛硫磷溶劑的水解速度較對照(CK)變慢。而對于用轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?CK)基本一致，無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果表明，SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可有效降低麥長管蚜的耐藥性，使其對藥物更加敏感。
[0133]四、SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥對麥長管蚜繁殖率的影響
[0134]以處于一齡時期的麥長管蚜為實驗材料，分別飼喂在T3代SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上15天(用紗網(wǎng)單株隔離)。飼喂在兩種轉(zhuǎn)基因株系上的麥長管蚜的初始數(shù)量均為10頭。飼喂15天后，統(tǒng)計各轉(zhuǎn)基因株系上麥長管蚜的數(shù)目。
[0135]實驗重復3次，結(jié)果取平均值。
[0136]同時設置以未轉(zhuǎn)基因的小麥品種遼春10號(CK)和轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照。
[0137]結(jié)果如圖13所示，從圖中可以看出，轉(zhuǎn)基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2_2上的蟲牙蟲數(shù)目均較對照(CK)極顯著 降低(p〈0.01)。而對于用轉(zhuǎn)入pBAC-rbcs-sNTL空載體的小麥植株飼喂麥長管蚜的對照組，其結(jié)果與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?CK)基本一致，無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果表明，SaCbE E4的RNAi轉(zhuǎn)基因小麥可有效降低麥長管蚜的繁殖率。
【權利要求】
1.如式(I)所示的DNA片段: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述SEQM的序列為序列I的第1-345位； 所述SEQ的序列與所述序列反向互補； 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互補。
2.根據(jù)權利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述X的序列如序列表中序列2所示。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列I所示。
4.含有權利要求1-3中任一所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體； 所述重組表達載體中啟動所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為rbcS啟動子。
6.權利要求1-3中任一所述的DNA片段編碼得到的RNA分子。
7.權利要求1-3中任一所述的DNA片段，或權利要求4或5所述的重組表達載體、表達盒或重組菌，或權利要求6所述的RNA分子在如下al) -a6)任一中的應用: al)抑制麥長管蚜羧酸酯酶表達； a2)降低麥長管蚜羧酸酯酶活性； a3)降低麥長管蚜的耐藥性； a4)降低麥長管蚜的繁殖率； a5)防治麥長管蚜； a6)培育抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物。
8.一種培育抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將權利要求1-3中任一所述的DNA片段導入目的植物中，得到抗麥長管蚜的轉(zhuǎn)基因植物； 所述抗麥長管蚜具體體現(xiàn)在如下bl) -b4)中的至少一種: bl)抑制麥長管蚜的羧酸酯酶表達； b2)降低麥長管蚜的羧酸酯酶活性； b3)降低麥長管蚜的耐藥性； b4)降低麥長管蚜的繁殖率。
9.根據(jù)權利要求7所述的應用，或權利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用方法，其特征在于:所述單子葉植物具體為小麥。
【文檔編號】A01N57/16GK103589728SQ201310552870
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權日:2013年11月8日
【發(fā)明者】梁榮奇, 倪中福, 許蘭杰, 段曉亮, 呂延華, 尤明山, 解超杰, 李保云, 彭惠茹, 姚穎垠, 杜金昆, 劉志勇, 胡兆榮, 孫其信 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學