Bt蛋白Cry72Aa1操縱子基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cry72Aa1操縱子基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。其所編碼的Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2可用于制備Bt殺蟲劑，可將Cry72Aa1操縱子基因轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【專利說明】Bt蛋白Cry72Aa1操縱子基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種Bt蛋白Cry72Aal操縱子基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素。為了減少這些損失，多年來，對(duì)農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學(xué)防治手段進(jìn)行防治，但由于化學(xué)農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對(duì)環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學(xué)農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時(shí)，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學(xué)防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點(diǎn)。并且避免了化學(xué)防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點(diǎn)。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。
[0003]蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌,它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時(shí)可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal crystal proteins,簡稱ICPs), ICPs是由cry基因編碼的，對(duì)敏感昆蟲有強(qiáng)烈毒性，而對(duì)高等動(dòng)物和人無毒性。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。
[0004]自1981年Schn印f從菌株HD-1中克隆了第一個(gè)能表達(dá)殺蟲活性的基因以來，已陸續(xù)分離克隆了 500 多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N,等Microbiol Mol BiolRev, 1998, 62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前已經(jīng)分離克隆了 72個(gè)類群的殺蟲蛋白。一般而言，Cry蛋白都是由單個(gè)操縱元編碼的，如Cryl、Cry2、Cry3、Cry4和Cry9等毒蛋白，這些基因編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD;cry54和cry56等基因編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為70_80kDa。隨著對(duì)Bt殺蟲基因研究的深入，一些具有兩個(gè)操縱元編碼的殺蟲基因蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，這些具有兩個(gè)編碼框的基因在第一個(gè)基因后面由一個(gè)具有相同編碼方向的orf2共同組成這個(gè)基因的操縱子。這類操縱子基因由三個(gè)部分組成，包括cry基因編碼60-80kDa Cry蛋白，由orf2編碼的50-60kDa的蛋白，以及位于這兩個(gè)蛋白之間的30_140bp的非編碼序列。目前具有兩個(gè)操縱元的殺蟲基因蛋白有Cry5Adl、CrylOAaU Cryl9Aal、Cry24Bal、Cry39Aal、Cry44Aal> Cry44Aal、Cry30Dbl和Cry30Bal。在之前的研究中，這類毒性蛋白只對(duì)蚊蟲具有很好的殺蟲活性。一些研究者認(rèn)為orf2具有穩(wěn)定cry mRNA的作用，或者其編碼的0RF2蛋白可能作為一個(gè)分子伴侶，有助于cry蛋白晶體的形成(Rosso ML, 1997.Appl EnvironMicrobiol63:4449-4455);而另一些研究者則認(rèn)為0RF2蛋白對(duì)于穩(wěn)定晶體構(gòu)型具有重要的作用(J.Eleazar Barboza-Corona, 2012.Appl Environ Microbiol78 (6): 2005-2012),這類蛋白的形成可能是在進(jìn)化過程中由于插入序列或者是點(diǎn)突變造成的。0RF2蛋白與Cryl、Cry4、OcfJ、Cry8、Cry9等大分子量Cry蛋白的C端相類似，因此一些大分子的cry基因在進(jìn)化過程中由于基因突變等因素造成完整的基因序列被分為兩部分，形成由兩個(gè)基因組成的 cry 操縱子基因(Thorne L, 1986.J Bacteriology.166:801 - 811)。
[0005]分子伴侶是細(xì)胞中一大類蛋白質(zhì)，是一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確組裝，但不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時(shí)的組份。
[0006]研究表明，Cryl、Cry2和Cry9蛋白對(duì)鱗翅目害蟲有很好的殺蟲毒性，cry I類基因已被廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎(chǔ)的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對(duì)Bt的抗性。然而，從上世紀(jì)80年中期開始，抗性問題不斷在實(shí)驗(yàn)室及田間試驗(yàn)中得到證實(shí)(McGaughey，W.H.1985.Science.229:193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應(yīng)用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報(bào)道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodiainterpunctella)在 Dipel (Bt subsp.kurstaik HD-1 的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實(shí)大田中的小菜蛾對(duì)Bt殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik，B.E，等1994.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.91:4120-4124)，上世紀(jì)90年代以來，在我國應(yīng)用Bt殺蟲劑時(shí)間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對(duì)小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.昆蟲學(xué)報(bào)，39 (3): 238-244; Hofte, H.，1988.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室及田間至少有十幾種昆蟲對(duì)Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會(huì)產(chǎn)生抗性(Schn印f，E.，等 1998.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806)。另外，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題，但是蚊蟲對(duì)其抗性問題不斷在實(shí)驗(yàn)室中得到證實(shí)，這種情況也可能會(huì)在大田中出現(xiàn)(Georghiou G P, 1997.Applied andEnvironmental Microbiology, 63:1095-1101)。
[0007]為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力、寬殺蟲譜的Bt基因資源是解決這個(gè)問題的有效途徑，這對(duì)我國的生物防治有著十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種新的Bt蛋白Cry72Aal操縱子基因及其應(yīng)用。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種新的Bt蛋白Cry72Aal操縱子基因，所述Cry72Aal操縱子基因包括一個(gè)Cry72Aal基因、orf2基因以及它們之間的非編碼間隔區(qū)，其核苷酸序列為:
[0010]i) Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或
[0011]ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0012]iii)在嚴(yán)格條件下與Seq ID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0013]所述嚴(yán)格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0014]本發(fā)明還提供用于檢測上述操縱子基因的PCR引物對(duì)，包括:[0015]72AF:5’ -ATGTCTAATCGTTATCCACG-3’
[0016]72A0R: 5，-TTAACGGCTGTATCCTTGATT-3，
[0017]本發(fā)明從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)新菌株HS18-1。該菌株已于2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號(hào)為CGMCC N0.2718。該菌株已在ZL200910081594.2中公開。
[0018]通過對(duì)菌株HS18-1基因組和質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)該菌株存在一個(gè)新的cry操縱子基因，設(shè)計(jì)其全長基因引物，克隆得到Cry72Aal操縱子基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1 所示，全長為 3754bp，包括一個(gè) Cry72Aal 基因(SEQ ID N0.3，2064bp)和一個(gè) orf2 基因(SEQ ID N0.4，1623bp)以及它們之間67bp非編碼間隔區(qū)。
[0019]所述Cry72Aal操縱子基因包括編碼蛋白Cry72Aal和0RF2的核苷酸序列。其中，Cry72Aal基因編碼687個(gè)氨基酸組成的Cry72Aal蛋白(SEQ ID N0.5)；orf2基因編碼536個(gè)氨基酸組成的orf2蛋白(SEQ ID N0.2)。蛋白0RF2為蛋白Cry72Aal的分子伴侶。
[0020]在softberry網(wǎng)站米用bacterial sigma7.0promoter程序?qū)υ摬倏v子中的cry基因進(jìn)行預(yù)測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點(diǎn)的序列，將其命名為Cry72Aal0
[0021]其中，Cry72Aal和0RF2蛋白的氨基酸組成如表1和表2所示。
[0022]表1 Cry72Aal蛋白的氨基酸組成
[0023]
【權(quán)利要求】
1.Bt蛋白Cry72Aal操縱子基因，其核苷酸序列為: i)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii)在嚴(yán)格條件下與SeqID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
2. 含有權(quán)利要求1所述基因的載體。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的工程菌。
4.由權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白制備的殺蟲劑。
5.權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述基因、權(quán)利要求2所述載體或權(quán)利要求3所述工程菌在提高植物抗蟲性中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為棉花、玉米、水稻。
8.用于檢測權(quán)利要求1所述基因的PCR引物對(duì)，其特征在于，包括:
72AF:5’ -ATGTCTAATCGTTATCCACG-3’ 和
72A0R:5’ -TTAACGGCTGTATCCTTGATT-3’。
9.一種分子伴侶，其氨基酸序列為: 1)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】A01N47/44GK103525837SQ201310429403
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】鄭愛萍, 李平, 李巧, 朱軍, 鄧其明, 王世全, 李雙成 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)