一株乳酸鏈球菌及在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株能夠發(fā)酵利用豆粕并產(chǎn)生Nisin的微生物菌種——乳酸鏈球菌（Streptococcus?lactis）2013-DP1，及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編：430072，保藏日期：2013年6月21日，保藏編號：CCTCC?No：M2013275。利用該菌株可以進(jìn)行豆粕等飼料原料的發(fā)酵處理，既可以提高飼料原料中蛋白質(zhì)和可溶性小肽（酸溶蛋白）的含量，也產(chǎn)生較高活性的Nisin。該菌株用于飼料產(chǎn)業(yè)，具有極大的市場潛力。
【專利說明】一株乳酸鏈球菌及在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應(yīng)用(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及經(jīng)篩選誘變獲得的一株新菌株-乳酸鏈球菌(Streptococcus
lactis) 2013-DP1，及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應(yīng)用 。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]飼料行業(yè)及相關(guān)產(chǎn)品中，為了畜禽疾病的防治，往往在飼料中添加抗生素。隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品質(zhì)量的要求越來越高，抗生素的副作用及潛在的危害和風(fēng)險已經(jīng)日益暴露出來。抗生素的長期添加使用，能使許多病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時，在畜產(chǎn)品中產(chǎn)生嚴(yán)重的藥物殘留，從而對人類健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的不利影響，抗生素在飼料業(yè)中的應(yīng)用，已面臨著淘汰或禁用的局面。開發(fā)無毒無公害的新型微生態(tài)制劑和抗菌劑等來代替或降低抗生素使用量，已成為飼料添加劑研發(fā)的一項緊迫的任務(wù)。
[0003]抗菌肽是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一種具有抗菌活性的小分子多肽，由20~60個氨基酸殘基組成，具有強堿性、熱穩(wěn)定性、抗菌活性高和抗菌譜廣等特點?？咕木哂信c抗生素不同的抗菌機制，它主要作用于細(xì)胞膜，造成細(xì)胞膜的穿孔，這樣就不需要一些特殊的受體，因此靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變?？咕脑卺t(yī)藥、食品、飼料中已經(jīng)開始應(yīng)用。利用能夠產(chǎn)生抗菌肽的微生物來發(fā)酵生產(chǎn)飼料微生態(tài)添加劑是一條很有潛力的途徑，此類添加劑在提高動物的飼料利用率，增加生產(chǎn)性能，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增加免疫力等方面具有顯著的促進(jìn)作用。此類添加劑還具有無毒副作用、無殘留、不引起抗藥性等優(yōu)點，可以替代或降低抗生素使用，用于動物生產(chǎn)可以大幅提高我國畜產(chǎn)品的國際競爭力。
[0004]乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種抗菌肽,成熟的Nisin分子由34個氨基酸殘基組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)包含有由5個硫醚橋組成的分子內(nèi)環(huán)，分子量為3510Da。Nisin能夠有效地抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌的生長，比如金黃色葡萄球菌、小球菌、明串珠菌、李斯特氏菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌等，因而被廣泛用作食品綠色防腐劑。然而在飼料產(chǎn)業(yè)中，Nisin尚未被廣泛應(yīng)用。Nisin用于飼料添加劑的優(yōu)點主要體現(xiàn)在兩個方面:一是用作添加劑后可以有效的防止沙門氏菌等致病菌的污染，保障飼料的品質(zhì)，減少防腐劑的應(yīng)用，降低對于飼養(yǎng)動物以及食用人體的危害；二是對于飼養(yǎng)動物的作用，Nisin可以有效的防止致病菌對動物腸道的影響，可以有效的抑制腸道內(nèi)致病菌并降低致病率，但不會影響動物腸道內(nèi)的有益微生物的生長，減少抗生素的使用，而且Nisin進(jìn)入腸道后會被蛋白酶降解，不會在體內(nèi)殘留。
[0005]此外，近年來我國畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展造成了國內(nèi)常規(guī)飼料資源短缺，尤其是蛋白飼料資源的缺乏顯得尤為突出，缺口很大。大豆和魚粉是主要的飼料蛋白原料，近年來大豆的需求不斷增加，據(jù)統(tǒng)計，2008年我國進(jìn)口大豆達(dá)到3743萬噸，2013年預(yù)計全年進(jìn)口大豆即將突破6000萬噸。而進(jìn)口魚粉也是量價齊升，給養(yǎng)殖業(yè)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)新型的蛋白詞料來源和生廣聞品質(zhì)的蛋白詞料也已成為詞料生廣的緊迫任務(wù)。
[0006]隨著我國農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)的發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品及食品在加工過程中產(chǎn)生了大量的柏類、糟渣類廢棄物。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國僅釀造、調(diào)味品、味精、淀粉、白酒、黃酒、淀粉糖、生物農(nóng)藥、果品加工工業(yè)部門每年度可生產(chǎn)糟渣約7000萬噸。這些含蛋白的廢棄物，常常被人們簡單處理，不能發(fā)揮其潛有功能。近年來，人們漸漸發(fā)現(xiàn)，利用微生物發(fā)酵的方法，可以對其進(jìn)行科學(xué)利用，不但可減輕環(huán)境壓力，減少資源浪費，同時也能夠提高企業(yè)的經(jīng)濟效益。例如豆柏，它是大豆等提取脂肪類物質(zhì)后的副產(chǎn)物，豆柏類物質(zhì)已經(jīng)成功開發(fā)成為可部分替代魚粉的植物蛋白飼料原料，近年來豆柏已經(jīng)在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。研究表明利用微生物發(fā)酵法處理豆柏后，可以通過微生物生長利用以及分泌的蛋白酶系對豆柏中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白進(jìn)行一定程度的降解，降低這些不良物質(zhì)在豆柏中的水平，顯著改善豆柏的營養(yǎng)品質(zhì)，實現(xiàn)?柏的聞效利用。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對以上問題，本發(fā)明提供了一株能夠發(fā)酵利用豆柏并產(chǎn)生Nisin的微生物菌
種-乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)2013-DP1,及其在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑
中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是: [0009]一株乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)2013_DPl,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏編號:CCTCC No:M2013275o
[0010]本發(fā)明通過紫外誘變法同時對該菌產(chǎn)生Nisin和發(fā)酵利用轉(zhuǎn)化豆柏的能力進(jìn)行了改良育種，獲得了乳酸鏈球菌突變菌株2013-DP1，利用該菌株進(jìn)行豆柏發(fā)酵以生產(chǎn)既產(chǎn)生抗菌肽Nisin又富含酸溶蛋白(可溶性小肽)的蛋白飼料添加劑發(fā)酵豆柏。以金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)為指示菌,測定了菌株產(chǎn)生Nisin的能力，發(fā)現(xiàn)突變株2013-DP1產(chǎn)Nisin的效價比出發(fā)菌株(WT)效價提高了 86.10%(出發(fā)菌株平均效價為769.4IU/ml，突變株2013-DP1效價1431.9IU/ml)。乳酸鏈球菌可以很好地利用豆柏為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生長，發(fā)酵豆柏的粗蛋白含量和酸溶蛋白含量都得到提高。本發(fā)明中，選育的突變菌株2013-DP1發(fā)酵S.柏后,S.柏的粗蛋白、酸溶蛋白含量也比出發(fā)菌株提聞:出發(fā)菌株發(fā)酵豆柏的粗蛋白含量為50.8%，突變菌株2013-0?1為51.2%;出發(fā)菌株發(fā)酵豆柏的酸溶蛋白含量為8.8%，突變菌株2013-DP1為11.3%。豆柏發(fā)酵后，大分子量的蛋白質(zhì)降解為可溶性的小肽，便于動物消化吸收，顯著提高了飼料原料的營養(yǎng)價值并且改善了動物營養(yǎng)水平和促進(jìn)了健康。發(fā)酵該菌株可以用于飼料蛋白添加劑的生產(chǎn)，同時可以產(chǎn)生抗菌肽Nisin，降低飼料中抗生素的添加量，提高動物養(yǎng)殖水平和動物產(chǎn)品競爭力，給養(yǎng)殖業(yè)帶來顯著經(jīng)濟效益。
[0011]本發(fā)明還涉及所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發(fā)酵制備抗菌肽Nisin中的應(yīng)用。
[0012]乳酸鏈球菌菌株2013-DP1可以在MSR培養(yǎng)基上生長繁殖，培養(yǎng)溫度30°C，在該培養(yǎng)基上生長較好并產(chǎn)生高活性Nisin，因此可以利用本發(fā)明菌株直接制備Nisin。
[0013]MSR培養(yǎng)基組成如下:蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉 5g/L，檸檬酸二胺 2g/L，Tween801g/L，K2HP042g/L，MgSO4.7Η200.2g/L, MnSO4.H2O0.05g/L，CaC0320g/L，瓊脂15g/L，溶劑為水，pH6.8。培養(yǎng)基在121°C下滅菌20min。
[0014]乳酸鏈球菌菌株2013-DP1菌落、形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征:乳酸鏈球菌是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，能產(chǎn)生乳酸和乳酸鏈球菌素Nisin。在MSR培養(yǎng)基上，乳酸鏈球菌菌落呈現(xiàn)乳白、淡白等顏色，菌落較光滑，濕潤。產(chǎn)生的Nisin主要抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長，如金黃色葡萄球菌等。乳酸鏈球菌菌株2013-DP1可以在含有蛋白胨、酵母膏作為氮源、以蔗糖或可溶性淀粉作為碳源、另外添加KH2PO4以及硫酸鎂或蛋氨酸、半胱氨酸等物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長良好，并產(chǎn)生Nisin。最適培養(yǎng)溫度均為30°C，最適pH為5.5。
[0015]本發(fā)明還涉及所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發(fā)酵制備富含抗菌肽Nisin和可溶性小肽的飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0016]具體的，所述的應(yīng)用為:取豆柏、麩皮、秸桿中的一種或多種，加水至含水量為40~50%，再經(jīng)高溫滅菌制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接種乳酸鏈球菌2013-DP1，在發(fā)酵容器密封條件下，28~32 °C靜置培養(yǎng)48~64h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物直接作為飼料添加劑或經(jīng)自然晾干或在50°C以下適度除水干燥(干燥至含水量為10~15%，w/w)后制成飼料添加劑。
[0017]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明通過紫外誘變選育獲得了一株乳酸鏈球菌2013-DP1，該菌株產(chǎn)生抗菌肽Nisin的能力較出發(fā)菌株顯著提高，該菌株轉(zhuǎn)化利用豆柏蛋白的能力也得到了提高。利用該菌株可以進(jìn)行豆柏等飼料原料的發(fā)酵處理，既可以提高飼料原料中蛋白質(zhì)和可溶性小肽(酸溶蛋白)的含量，也產(chǎn)生較高活性的Nisin。乳酸鏈球菌發(fā)酵的豆柏作為蛋白飼料添加劑用于養(yǎng)殖業(yè)，既可以減少價格較高的動物蛋白(如魚粉)的用量，又可以可有效減少抗生素的大量使用，同時幫助提高飼料的消化與吸收，增強對于有害細(xì)菌等微生物的抵抗力，改善動物腸道健康，促進(jìn)其生長。此外，乳酸鏈球菌2013-DP1對豆柏的轉(zhuǎn)化利用以及分泌的蛋白酶系對豆柏中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白可以進(jìn)行一定程度的降解，降低了這些不良物質(zhì)在豆柏中的水平，顯著改善了豆柏的營養(yǎng)品質(zhì)，實現(xiàn)豆柏的高效利用。該菌株用于飼料產(chǎn)業(yè)，具有極大的市場潛力。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為乳酸鏈球菌素`抑制金黃色葡萄球菌生長結(jié)果圖。
(五)【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0020]實施例1:
[0021](I)乳酸鏈球菌分離培養(yǎng)和篩選方法:乳酸鏈球菌進(jìn)行一定稀釋后涂布在含有指示菌的固體檢測培養(yǎng)基平板上，在30°C培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑，挑取抑菌圈直徑與菌落直徑比較大的菌株進(jìn)行保存后，測定產(chǎn)生Nisin的效價。Nisin對于革蘭氏陽性細(xì)菌具有極強的抑菌性，選用金黃色葡萄球菌作為指示菌，通過乳酸鏈球菌產(chǎn)生的Nisin對其具有的抑菌性，使其產(chǎn)生抑菌圈，通過觀察比較抑菌圈直徑來篩選較優(yōu)的菌株，并對其效價進(jìn)行評定。
[0022]檢測培養(yǎng)基組成如下:胰蛋白胨8g/L,酵母膏5g/L,葡萄糖5g/L, NaC15g/L,Na2HPO4.12H202g/L, Tween8010g/L，瓊脂 18g/L，溶劑為水，ρΗ6.8。
[0023](2)乳酸鏈球菌紫外誘變方法:將超低溫冰箱保存的菌種劃線接種到MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，在30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。取無菌水1000 μ L加入滅菌EP管，用滅菌牙簽挑取少量活化的菌放入其中，混合均勻后，用血球計數(shù)板計數(shù)(一般為107CFU/mL數(shù)量級)，將其稀釋到104CFU/mL后取4(^1^稀釋菌液，加入到一個滅菌平皿之中，再向其中加入3.61!^無菌水使其稀釋到103CFU/mL，將平皿保持打開狀態(tài)，在距離紫外燈光30cm處照射70s，保持黑暗5min后，將誘變菌液涂布到新鮮制備的混合有金黃色葡萄球菌的檢測培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿用黑布包裹后放入培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。在30°C培養(yǎng)24h后，取出觀察抑菌圈直徑，挑選出菌落直徑較大、同時抑菌圈直徑也較大的菌株。重復(fù)多次實驗，挑選出多個菌株。部分菌株的抑菌圈效果見圖1。
[0024](3) Nisin效價測定方法
[0025]利用管碟法進(jìn)行各菌株產(chǎn)Nisin的效價測定。將需要檢測的乳酸鏈球菌菌液用
0.02mol/L稀鹽酸稀釋酸化后,沸水浴5min,再5000r/min離心5min去掉沉淀,取上清,將上清液以100 μ L/杯的量注入到放置在混合有指示菌金黃色葡萄球菌的檢測培養(yǎng)基上的牛津杯中，平穩(wěn)的放入培養(yǎng)箱，在37 °C培養(yǎng)48h后測定抑菌圈直徑。
[0026]Nisin的抑菌圈直徑與其濃度呈線性關(guān)系，利用Nisin標(biāo)準(zhǔn)品以不同濃度配制后測定的對指示菌的抑菌圈直徑繪出其標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測試菌的抑菌圈直徑與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對t匕，計算出其效價。具體方法是將滅菌后冷卻至50°C左右的溶化的檢測培養(yǎng)基中以2%接入量接入金黃色葡萄球菌懸浮液，利用管碟法，在完全冷卻的培養(yǎng)基上放上滅菌牛津杯，向其中加入濃度依次為10、25、50、75、100幾/1^的附8丨11標(biāo)準(zhǔn)品100 μ L，加完后將其小心平穩(wěn)地放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0027](4)產(chǎn)Nisin較高的乳酸鏈球菌突變株發(fā)酵豆柏篩選
[0028]利用上述方法，篩選出產(chǎn)Nisin效價較高的菌株多株，然后繼續(xù)進(jìn)行豆柏、玉米蛋白等飼料原料的發(fā)酵研究，篩選獲得發(fā)酵蛋白的能力也較強的菌株。
[0029]將菌株分別接種到IOOmL的液體CM培養(yǎng)基中，200r/min，30°C培養(yǎng)24h得到種子液；取豆柏，加水至含水量為45 % (w/w), 121°C下滅菌20分鐘制成發(fā)酵培養(yǎng)基，按照10%體積比的接種量接種種子液，混合均勻后，發(fā)酵容器用塑料袋密封進(jìn)行低氧至無氧發(fā)酵，30°C靜止培養(yǎng)48h，發(fā)酵后的基質(zhì)低溫(40~45°C)適度除水干燥(干燥至含水量約為10%)制成飼料添加劑成品，進(jìn)行粗蛋白、酸溶蛋白等指標(biāo)測定。每個菌株獨立重復(fù)三次實驗，每次至少3個平行樣。
[0030]CM液體培養(yǎng)基組成:蔗糖10g/L，大豆蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，K2HP0410g/L,NaC12g/L, MgSO4.7H200.2g/L，溶劑為水，pH6.9。
[0031]發(fā)酵豆柏(即前述制備的飼料添加劑成品)用凱氏定氮法測定粗蛋白含量，用三氯乙酸法測定酸溶蛋白含量。幾株誘變菌株的Nisin效價以及發(fā)酵豆柏的粗蛋白和酸溶蛋白含量測定平均值見表1。從表中可以看出菌株UV-2產(chǎn)Nisin效價較高，該菌株發(fā)酵豆柏的粗蛋白和酸溶蛋白含量都得到了提高，說明發(fā)酵豆柏的能力得到了改良。因此，選擇菌株UV-2進(jìn)行保藏，命名為乳酸鏈球菌突變菌株2013-DP1，保藏編號CCTCC No:M2013275。原料豆柏的粗蛋白含量45.93%，酸溶蛋白含量4.58%。
[0032]表1:乳酸鏈球菌誘變菌株發(fā)酵豆柏指標(biāo)測定
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一株乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis) 2013-DP1,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏編號:CCTCC No:M2013275o
2.如權(quán)利要求1所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發(fā)酵制備抗菌肽Nisin中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發(fā)酵制備飼料添加劑中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:取豆柏、麩皮、秸桿中的一種或多種，加水至含水量為40~50%，再經(jīng)高溫滅菌制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接種乳酸鏈球菌2013-DP1，在發(fā)酵容器密封條件下，28~32°C靜置培養(yǎng)48~64h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物直接作為飼料添加劑或經(jīng)自然晾干或在50°C以下除水干燥制成飼料添加劑。
【文檔編號】A23K1/17GK103642709SQ201310383042
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】朱廷恒, 汪琨, 崔志峰, 吳斌, 王渭霞 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)