專利名稱：白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物的培養(yǎng)和繁殖，特別是一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法。
背景技術(shù)：
白鳳菜(Gynura formosana Kitam.)是菊科(Compositae)多年生藥食兩用植物,特產(chǎn)臺灣。〃白鳳菜〃別名白擔(dān)當(dāng)，俗名肝炎草。白鳳菜白鳳菜營養(yǎng)豐富，每100公克含有蛋白質(zhì)2公克、維生素A 573.3RE、維生素C 24.5毫克，以及豐富微量元素，鉀380毫克、鈣82毫克、磷42毫克、鋅0.4毫克。因其含鋅量高，又有“聰明菜”之稱，是新興的蔬菜品種，嫩莖葉為食用部位，為保健藥膳珍稀蔬菜，有“最佳保健藥膳蔬菜”之稱。近年來，成為中國各大城市蔬菜、保健、醫(yī)療市場上的新秀，受到消費者歡迎。白鳳菜全草或莖葉可入藥，清熱排毒舒筋。主入肝、肺、腎、大小腸諸經(jīng)，有消炎、解熱、解毒、利尿、降血壓等功效，主治肝炎、肝硬化、肺炎、肺癌、高血壓、感冒、發(fā)燒、腎臟炎、水腫、便秘、腸炎、兒童日本腦炎，外敷刀傷、創(chuàng)傷、跌打損傷、毒蟲咬傷和無名腫毒。許多城市，相繼引入試種，栽培面積逐漸擴(kuò)大。近年來隨著國內(nèi)外對白鳳菜需求量的增加，供需矛盾日益突出，白鳳菜苗木及新品種培育勢在必行。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論(個體的某個器官或組織已經(jīng)分化的細(xì)胞再生成完整個體的遺傳潛力)，取植物個體上的器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工配制的培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)以獲得成千上萬個的完整植株。利用組培進(jìn)行離體快繁具有重要意義:(1)占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)、氣候限制，一年四季均可繁殖；(2)偏于保持優(yōu)良種性、培養(yǎng)脫毒種苗；(3)在保存和繁育優(yōu)良突變體或優(yōu)良雜種一代方面具有非常重要的意義；(4)解決有些植物產(chǎn)種子少或無的難題。一株具有明顯優(yōu)勢的白鳳菜突變體或一個具有明顯優(yōu)勢的后代經(jīng)組織培養(yǎng)后可大面積推廣。

目前白鳳菜以扦插繁殖為主，組織培養(yǎng)尚未見報道。由于白鳳菜含有的化學(xué)物質(zhì)較多，對外植體的選擇和滅菌方法都非常關(guān)鍵。本發(fā)明首次采用組織培養(yǎng)方法，開展白鳳菜種質(zhì)離體繁殖工作，這為緩解白鳳菜苗木供應(yīng)緊張，開展白鳳菜遺傳改良、促進(jìn)白鳳菜工廠化育苗提供了一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過組織培養(yǎng)進(jìn)行白鳳菜種質(zhì)保存和快速繁苗的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:以白鳳菜的莖段為外植體，經(jīng)滅菌處理、接種誘導(dǎo)形成叢生芽，再經(jīng)生根培養(yǎng)，長成完整的植株小苗，將完整的小苗移栽到育苗基質(zhì)中，長成正常的白鳳菜植株。所述的白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，包括下列步驟:
A、外植體的選擇和滅菌處理:以白鳳菜的莖段為外植體，以洗潔精浸泡，搖床100-150轉(zhuǎn)搖15-20分鐘，再用清水沖洗15-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升汞中，浸泡滅菌9-14分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，備用；B、外植體接種:將經(jīng)過步驟A中準(zhǔn)備的外植體切去兩端，切成0.5-0.8厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時間為28-35天，在莖切口處膨大形成愈傷組織；
C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，愈傷組織增殖25-30天，長出黃色、致密的愈傷組織；
D、愈傷組織的芽的誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30-35天，出現(xiàn)白鳳菜叢生芽；
E、生根培養(yǎng):將步驟D中得到的白鳳菜叢生芽分株，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系；
F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天；
G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株。所述的外植體滅菌處理采用0.1-0.2升汞浸泡滅菌9-14分鐘方法，無需用75%酒精浸泡。所述的致密的愈傷組織是指非顆粒狀散在的愈傷組織。所述的白鳳菜基源植物為菊科多年生草本植物白鳳菜Gynura formosana Kitam。所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS、L-脯氨酸、2，4-D 5.0-1.0mg/L、NAA 0.2mg/L,其中:MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962，2，4-D為2，4_ 二氯苯氧乙酸，NAA為萘乙酸。所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基為:MS、L-脯氨酸0.5^2.5mg/L、2，4-D 0.5^1.0mg/L,其中:MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基M urashige and Skoog 1962, 2,4-D為2,4_ 二氯苯氧乙酸。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-BA1.5^4.5mg/L、NAA0.2^0.5mg/L，其中:MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962，6-BA為6-芐基腺嘌呤，NAA為萘乙酸。所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS和NAA0.0lmg/L,其中:MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962，該常規(guī)基本培養(yǎng)基中的大量元素濃度減半得到1/2MS，NAA為萘乙酸。所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基均加入占相應(yīng)培養(yǎng)基總質(zhì)量0.7 1.0%的瓊脂、3%蔗糖和0.Γ0.5%活性炭。所述的育苗基質(zhì)的理化性質(zhì)為總孔隙度為75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。所述的完整小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出小葉片，可以獨立進(jìn)行自養(yǎng)生長的幼小植株。所述的育苗基質(zhì)的理化性質(zhì)為總孔隙度為75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。本發(fā)明的有點在于:本發(fā)明利用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體快速繁殖在以下四個方面具有重要意義:1)占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)、氣候限制，一年四季均可繁殖；(2)偏于保持優(yōu)良種性、培養(yǎng)脫毒種苗；(3)在保存和繁育優(yōu)良突變體或優(yōu)良雜種一代方面具有非常重要的意義；(4)解決有些植物產(chǎn)種子少或無的難題。一株具有明顯優(yōu)勢的白鳳菜突變體或一個具有明顯優(yōu)勢的后代經(jīng)組織培養(yǎng)后可大面積推廣。本發(fā)明所用培養(yǎng)基誘發(fā)時間短、出苗快、繁殖頻率高，尤其出苗整齊，易于操作、大規(guī)模生產(chǎn)育苗。本發(fā)明首次采用組織培養(yǎng)方法，開展白鳳菜種質(zhì)離體繁殖工作，這為保護(hù)白鳳菜種質(zhì)資源，開展白鳳菜遺傳改良、促進(jìn)白鳳菜的工廠化育苗提供了一條新途徑，提供了一種能進(jìn)行白鳳菜人工繁殖、種質(zhì)資源離體保存、利用及選育藥用成分含量高的突變系的組織培養(yǎng)方法。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護(hù)范圍不被此限制。實施例中各種原料或設(shè)備均可從市場購買。其中，所述的MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962的簡稱(按常規(guī)為:硝酸銨(NH4N03) 1650 mg/L，硝酸鉀(KN03) 900 mg/L，硫酸鎂(MgS04.7Η20) 370 mg/L,硫酸二氫鉀(KH2P04) 170 mg/L,氯化鈣(CaC12.2H20 ) 440 mg/L，硫酸錳(MnS04.4H20)22.3 mg/L，硫酸鋅(ZnS04.7H20) 8.6 mg/L，硼酸(H3B03) 6.2 mg/L，碘化鉀(ΚΙ) 0.83mg/L,鑰酸鈉(Na2Mo04.2H20) 0.25 mg/L,硫酸銅(CuS04.5H20 ) 0.025mg/L,氯化鈷(CoC12.6Η20) 0.025 mg/L，硫酸亞鐵(FeS04.7Η20) 27.8 mg/L，Na2_EDTA.2Η20 37.3mg/L,甘氨酸2 mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) 0.1 mg/L,鹽酸吡哆醇(維生素B6) 0.5mg/L，IVB煙酸0.5 mg/L,肌醇100 mg/L。)，2，4-D為2，4-二氯苯氧乙酸，NAA為萘乙酸；實施例中所述的育苗基質(zhì)的理化性質(zhì)為總孔隙度為75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。實施例1
一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，包括下列步驟:
A、取白鳳菜Gynura formosana Kitam.的莖段為外植體,用流水沖洗3_5分鐘，以洗潔精浸泡，室溫下?lián)u床100-150轉(zhuǎn)搖15-20分鐘，再用清水沖洗15-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升 汞中，浸泡滅菌10分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，備用；
A、外植體的選擇和滅菌處理:以白鳳菜的莖段為外植體，以洗潔精浸泡，搖床100-150轉(zhuǎn)搖15-20分鐘，再用清水沖洗15-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升汞中，浸泡滅菌9-14分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，備用；
B、外植體接種:在超凈工作臺上，將經(jīng)過步驟A的外植體切成0.5-0.8厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為:MS+L-脯氨酸2.0 mg/L+2, 4-D 0.5 mg/L+NAA 0.2mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、3%的蔗糖和0.1%的活性炭，培養(yǎng)約35天后，可見在莖切口處膨大形成愈傷組織；
所述的超凈工作臺，型號為HS-1300，由蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的俞傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+L-脯氨酸1.5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L，培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、3%的蔗糖和
0.1%的活性炭，增殖培養(yǎng)約30-32天后，長出黃色、致密的愈傷組織；
D、愈傷組織的芽誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.02mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、3%的蔗糖和0.1%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，出現(xiàn)叢生白鳳菜活苗；
E、生根培養(yǎng):將步驟D中的白鳳菜苗長至2-3厘米時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為1/2MS++NAA 0.20mg/L，培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、2%的蔗糖，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系；
培養(yǎng)溫度及光照條件:溫度為21±2°C，關(guān)照強(qiáng)度為1600LUX，光照時間為14小時；F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天；
G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株，一般成活率在90%以上。實施例2
一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，包括下列步驟:
A、取白鳳菜Gynuraformosana Kitam.的莖段為外植體,用流水沖洗3_5分鐘，以洗潔精浸泡，室溫下?lián)u床100-150轉(zhuǎn)搖10-15分鐘，再用清水沖洗20-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升汞中，浸泡滅菌11分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，最后用無菌濾紙吸干水分備用；
B、外植體接種:在超凈工作臺上，將經(jīng)過步驟A的外植體切成0.3-0.5厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為:MS+L-脯氨酸1.0 mg/L+2, 4-D 0.8 mg/L+NAA 0.4mg/L,培養(yǎng)基中加入0.7 %的瓊脂、3%的蔗糖和0.5%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，可見在莖切口處膨大形成愈傷組織；
所述的超凈工作臺，型號為HS-1300，由蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。所述的MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962的簡稱，2,4_D為2,4- 二氯苯氧乙酸，NAA為萘乙酸；
C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的俞傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+L-脯氨酸1.0 mg/L+2, 4-D 0.7 mg/L，培養(yǎng)基中加入0.7%的瓊脂、3%的蔗糖和
0.5%的活性炭，增殖培養(yǎng)·約30-32天后，長出黃色、致密的愈傷組織；
D、愈傷組織的芽誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L,培養(yǎng)基中加入0.7%的瓊脂、3%的蔗糖和0.5%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，出現(xiàn)叢生白鳳菜活苗；
E、生根培養(yǎng):將步驟D中的白鳳菜苗長至2-3厘米時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為1/2MS++NAA 0.4mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、2%的蔗糖，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系；
培養(yǎng)溫度及光照條件:溫度為21±2°C，關(guān)照強(qiáng)度為1600LUX，光照時間為14小時；
F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天；
G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株，一般成活率在90%以上。實施例3
一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，包括下列步驟:
A、取白鳳菜Gynuraformosana Kitam.的莖段為外植體,用流水沖洗3_5分鐘，以洗潔精浸泡，室溫下?lián)u床100-150轉(zhuǎn)搖10-15分鐘，再用清水沖洗20-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.15%的升汞中，浸泡滅菌10分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，最后用無菌濾紙吸干水分備用；
B、外植體接種:在超凈工作臺上，將經(jīng)過步驟A的外植體切成0.3-0.5厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為舊3+1^-脯氨酸2.0 mg/L+2, 4-D 1.0mg/L +NAA0.5mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8 %的瓊脂、3%的蔗糖和0.2%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，可見在莖切口處膨大形成愈傷組織；
所述的超凈工作臺，型號為HS-1300，由蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。所述的MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962的簡稱，2，4_D為2，4- 二氯苯氧乙酸，NAA為萘乙酸；
C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的俞傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+L-脯氨酸2.0 mg/L+2, 4-D 1.0mg/L,培養(yǎng)基中加入0.7%的瓊脂、3%的蔗糖和0.5%的活性炭，增殖培養(yǎng)約30-32天后，長出黃色、致密的愈傷組織；
D、愈傷組織的芽誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+6-BA2.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、3%的蔗糖和0.2%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，出現(xiàn)叢生白鳳菜活苗；
E、生根培養(yǎng):將步驟D中的白鳳菜苗長至2-3厘米時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為1/2MS++NAA 0.6mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、2%的蔗糖，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系；
培養(yǎng)溫度及光照條件:溫度為21±2°C，關(guān)照強(qiáng)度為1600LUX，光照時間為14小時；
F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天；
G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育 苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株，一般成活率在90%以上。實施例4
一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，包括下列步驟:
A、取白鳳菜Gynuraformosana Kitam.的莖段為外植體,用流水沖洗3_5分鐘，以洗潔精浸泡，室溫下?lián)u床100-150轉(zhuǎn)搖10-15分鐘，再用清水沖洗20-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.15%的升汞中，浸泡滅菌12分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，最后用無菌濾紙吸干水分備用；
B、外植體接種:在超凈工作臺上，將經(jīng)過步驟A的外植體切成0.3-0.5厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為舊3+1^-脯氨酸1.5 mg/L+2, 4-D 1.5mg/L +NAA
0.5mg/L,培養(yǎng)基中加入0.9 %的瓊脂、3%的蔗糖和0.3%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，可見在莖切口處膨大形成愈傷組織； 所述的超凈工作臺，型號為HS-1300，由蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。所述的MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962的簡稱，2,4_D為2,4- 二氯苯氧乙酸，NAA為萘乙酸；
C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的俞傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+L-脯氨酸2.5 mg/L+2, 4-D 0.9mg/L,培養(yǎng)基中加入0.9%的瓊脂、3%的蔗糖和0.3%的活性炭，增殖培養(yǎng)約25-30天后，長出黃色、致密的愈傷組織；
D、愈傷組織的芽誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.02mg/L,培養(yǎng)基中加入0.9%的瓊脂、3%的蔗糖和0.3%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，出現(xiàn)叢生白鳳菜活苗；
E、生根培養(yǎng):將步驟D中的白鳳菜苗長至2-3厘米時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為1/2MS++NAA 1.0 mg/L，培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、2%的蔗糖，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系；
培養(yǎng)溫度及光照條件:溫度為21±2°C，關(guān)照強(qiáng)度為1600LUX，光照時間為14小時；
F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天；
G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株，一般成活率在90%以上。所述的育苗基質(zhì)的理化性質(zhì)為總孔隙度為75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。實施例5
一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，包括下列步驟:
A、取白鳳菜Gynuraformosana Kitam.的莖段為外植體,用流水沖洗3_5分鐘，以洗潔精浸泡，室溫下?lián)u床100-150 轉(zhuǎn)搖10-15分鐘，再用清水沖洗20-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.2%的升汞中，浸泡滅菌10分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，最后用無菌濾紙吸干水分備用；
B、外植體接種:在超凈工作臺上，將經(jīng)過步驟A的外植體切成0.3-0.5厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為:MS+L-脯氨酸0.5 mg/L+2, 4-D 1.0mg/L +NAA
0.5mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8 %的瓊脂、3%的蔗糖和0.2%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，可見在莖切口處膨大形成愈傷組織；
所述的超凈工作臺，型號為HS-1300，由蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。所述的MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基Murashige and Skoog 1962的簡稱，2,4_D為2,4- 二氯苯氧乙酸，NAA為萘乙酸；
C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的俞傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+L-脯氨酸2.0 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L，培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、3%的蔗糖和0.2%的活性炭，增殖培養(yǎng)約25-30天后，長出黃色、致密的愈傷組織；
D、愈傷組織的芽誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1 mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、3%的蔗糖和0.2%的活性炭，培養(yǎng)約30-35天后，出現(xiàn)叢生白鳳菜活苗；
E、生根培養(yǎng):將步驟D中的白鳳菜苗長至2-3厘米時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為1/2MS++NAA 0.2mg/L,培養(yǎng)基中加入0.8%的瓊脂、2%的蔗糖，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系；
培養(yǎng)溫度及光照條件:溫度為21±2°C，關(guān)照強(qiáng)度為1600LUX，光照時間為14小時；
F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天；
G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株，一般成活率在90%以上。
權(quán)利要求
1.一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:以白鳳菜的莖段為外植體，經(jīng)滅菌處理、接種誘導(dǎo)形成愈傷組織后，再經(jīng)愈傷組織增殖、誘導(dǎo)芽和生根培養(yǎng)，形成完整的植株小苗，將完整小苗移栽到育苗基質(zhì)中，長成正常白鳳菜植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:包括下列步驟: A、外植體的選擇和滅菌處理:以白鳳菜的莖段為外植體，以洗潔精浸泡，搖床100-150轉(zhuǎn)搖15-20分鐘，再用清水沖 洗15-30分鐘，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1%的升汞中，浸泡滅菌9-14分鐘，無菌去離子水沖洗6-8次，備用； B、外植體接種:將經(jīng)過步驟A中準(zhǔn)備的外植體切去兩端，切成0.5-0.8厘米長的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時間為28-35天，在莖切口處膨大形成愈傷組織； C、愈傷組織增殖:將步驟B中得到的愈傷組織接種到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，愈傷組織增殖25-30天，長出黃色、致密的愈傷組織； D、愈傷組織的芽的誘導(dǎo):將步驟C中得到的愈傷組織接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30-35天，出現(xiàn)白鳳菜叢生芽； E、生根培養(yǎng):將步驟D中得到的白鳳菜叢生芽分株，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-25天，小苗基部出現(xiàn)白色短根并長出完整根系； F、煉苗:將步驟E中的完整小苗打開培養(yǎng)瓶瓶口，人工氣候室內(nèi)煉苗3-5天； G、植株移栽:移栽前，對含蛭石、泥炭的育苗基質(zhì)滅菌，將步驟F中得到的經(jīng)過煉苗的小苗直接移栽到育苗基質(zhì)，上覆保鮮膜以保持局部空氣濕度，長成正常白鳳菜植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的白鳳菜基源植物為菊科多年生草本植物白鳳菜Gynura formosana Kitam。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS、L-脯氨酸、2，4-D5.0-1.0mg/L、NAA0.2mg/L，其中:MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基 Murashige and Skoog 1962, 2,4-D 為 2,4_ 二氣苯氧乙酸，NAA 為蔡乙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基為:MS、L-脯氨酸0.5^2.5mg/L、2，4-D 0.5^1.0mg/L，其中:MS為常規(guī)基本培養(yǎng)基 Murashige and Skoog 1962, 2,4-D 為 2,4_ 二氣苯氧乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS、6-BA1.5 4.5mg/L、NAA0.2 0.5mg/L，其中:MS 為常規(guī)基本培養(yǎng)基 Murashige andSkoog 1962，6-BA為6-芐基腺嘌呤，NAA為萘乙酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS、NAA0.0lmg/L，其中:MS 為常規(guī)基本培養(yǎng)基 Murashige and Skoog 1962，該常規(guī)基本培養(yǎng)基中的大量元素濃度減半得到1/2MS，NAA為萘乙酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基均加入0.7^1.0%的瓊脂、3%蔗糖和0.f 0.5活性炭。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于:所述的育苗基質(zhì)的理化性質(zhì)為總孔隙度為75%，有機(jī)質(zhì)含量為20%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種白鳳菜組織培養(yǎng)繁殖方法，以白鳳菜莖段為外植體，經(jīng)滅菌、接種誘導(dǎo)形成愈傷組織后，再經(jīng)愈傷組織增殖、芽誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)，形成完整植株小苗，將完整小苗移栽到育苗基質(zhì)中，長成正常白鳳菜植株，所用基本培養(yǎng)基均為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，輔以L-脯氨酸、6-芐基腺嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、蔗糖和活性炭等成分；本發(fā)明應(yīng)用組織培養(yǎng)克服白鳳菜育苗周期長、繁殖系數(shù)低的問題，可進(jìn)行工廠化快速育苗，以適應(yīng)市場對白鳳菜的需求。
文檔編號A01H4/00GK103229721SQ201310178549
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月15日
發(fā)明者穆紅梅, 張秀省, 杜秀菊 申請人:聊城大學(xué)