專利名稱：蘇云金芽胞桿菌新型vip3X基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及蘇云金芽胞桿菌新型vip3X基因的克隆、表達(dá)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在芽胞形成的過(guò)程中可以產(chǎn)生由殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, I CPs)組成的伴胞晶體，也稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系[Schnepf，E.，N.Crickmorej J.Van Riej et al.，1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol BiolRev.62(3):p.775-806]。這種伴胞晶體蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等多種重要的害蟲都有特異性的毒殺作用[Dossj V.A.，K.A.Kumar, R.Jayakumarj et al.，2002.Cloning and expression of the vegetative insecticidal protein (vip3V)gene ofBacillus thuringiensis in Escherichia col1.Protein Expr Purif.26(I):p.82-8.Raymond, B.，P.R.Johnston, C.Nielsen-LeRouxj et al.，2010.Bacillus thuringiensis:animpotent pathogen.Trends Microbiol.18(5):p.189-94]，而對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。Bt是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑。除了芽胞形成過(guò)程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白之外，Bt在營(yíng)養(yǎng)期還分泌一類營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs)，與Cry類殺蟲晶體蛋白的氨基酸序列同源性極低[Estruch, J.J.，G.W.Warren, M.A.Mullins，et al.，1996.Vip3A, anovel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a widespectrum of activities against lepidopteran insects.Proc Natl Acad Sci U SA.93(11):p.5389-94]。Vips 主要分為 VipU Vip2、Vip3 和 Vip4。Vip3 類蛋白包括Vip3Aa、Vip3Ab、Vip3Ac 、Vip3Ad、Vip3Ae、Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ah、Vip3Ba 和 Vip3Bb。目前 GenBank 上登錄的 vip3 類全長(zhǎng)基因共有 75 個(gè)[http://www.lifesc1.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/.Crickmorej N.，D.R.ZeiglerjJ.Feitelsonjet al.，1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidalcrystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev.62 (3):p.807-13]，其中大部分為 vip3Aa基因。Vip3蛋白對(duì)甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、草地貪夜蛾(S.frugiperda)等一系列農(nóng)業(yè)害蟲具有較高的毒性[Estruch, J.J.，G.W.Warren, M.A.Mullins，et al.，1996.Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with awide spectrum of activities against lepidopteran insects.Proc Natl Acad SciU S A.93(11):p.5389-94]。一些昆蟲對(duì)Bt殺蟲晶體蛋白有很強(qiáng)的抗性，而Vip3蛋白可能對(duì)這些昆蟲具有較好的活性。Vip3蛋白對(duì)某些昆蟲的活性要比Cry蛋白高很多，如Vip3Aa蛋白對(duì)小地老虎的活性要比CrylAc蛋白高260倍[Selvapandiyan，A.，N.ArorajR.Rajagopaljet al.，2001.Toxicity analysis of N_and C-terminus—deletedvegetative insecticidal protein from Bacillus thuringiensis.Appl EnvironMicrobiol.67(12):p.5855-8]。陳建武等人從蘇云金芽胞桿菌菌株S184中克隆了 2.3kb大小的vip3A基因，并插入表達(dá)載體PQE30構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒ρΟΤΡ，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到的Vip3A-S184蛋白對(duì)夜蛾科害蟲具有較高的活性[陳建武，唐麗霞，宋少云，等.2003.蘇云金芽孢桿菌vip3A基因的檢測(cè)及保守性分析.生物工程學(xué)報(bào).19(5):538-543]。蔡啟良等人選擇蘇云金芽胞桿菌李氏亞種(subsp.1eesis)菌株YBT-833、鲇澤亞種(subsp.aizawai)菌株YBT-1416得到基因vip83和vipl4，分別轉(zhuǎn)化Bt受體菌BMB171和4Q7，獲得了相應(yīng)的工程菌。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白對(duì)棉鈴蟲、小菜蛾和甜菜夜蛾的三齡幼蟲有一定的殺蟲活性，其中對(duì)小菜蛾的毒力是最高的[蔡啟良，劉子鐸，孫明，等.2002.蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白基因的克隆及表達(dá)分析.生物工程學(xué)報(bào).18(5):578-582]。Vip3蛋白與已知的殺蟲晶體蛋白沒有同源性，殺蟲機(jī)理也不相同[Cai，J.，L.Xiao,B.Yanj et al., 2006.Vip3A is responsible for the potency of Bacillusthuringiensis9816C culture supernatant against Helicoverpa armigera andSpodoptera exigua.J Gen Appl Microbiol.52 (2): p.83-9]。Vip3 蛋白單獨(dú)或者與 Cry蛋白共同使用[Chilcottj C.N.and D.J.Ellarj 1988.Comparative toxicity of Bacillusthuringiensis var.1sraelensis crystal proteins in vivo and in vitr0.J GenMicrobiol.134(9):p.2551-8.Angsuthanasombatj C.，N.Crickmorej and D.J.Ellarj 1992.Comparison of Bacillus thuringiensis subsp.1sraelensis CryIVA and CryIVBcloned toxins reveals synergism in viv0.FEMS Microbiol Lett.73(1-2):p.63-8.Deleclusej A., S.Poncetj A.Klierj et al.,1993.Expression of cryIVA and cryIVBgenes,independently or in combination, in a crystal-negative strain of Bacillusthuringiensis subsp.1sraelensis.Appl Environ Microbiol.59 (11):p.3922-7]，或者是組建融合基因構(gòu)建工程菌，可以擴(kuò)大Bt的殺蟲譜，同時(shí)可以有效抑制害蟲抗藥性的產(chǎn)生。Vip3Aa蛋白間的氨基酸序列同源性都在95%以上，但其序列間個(gè)別氨基酸的差異也會(huì)導(dǎo)致對(duì)害蟲毒力和殺蟲譜的變化[Selvapandiyan，A.，N.Aroraj R.Rajagopalj et al.，2001.Toxicity analysis of N_and C-terminus-deleted vegetative insecticidal proteinfrom Bacillus thuring iensis.Appl Environ Microbiol.67 (12):p.5855-8]，因此針對(duì)不同農(nóng)業(yè)害蟲分離新的vip3類基因可以豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來(lái)源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲效果，并且可以降低害蟲對(duì)Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的蘇云金芽胞桿菌晶體殺蟲蛋白對(duì)小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾等鱗翅目害蟲的應(yīng)用，以轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對(duì)工程菌的抗藥性產(chǎn)生。對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因vip3X，其核苷酸序列如SEQ ID N03所示?！?~■種表達(dá)載體，其含有上述殺蟲基因VipSXtj所述表達(dá)載體為pUS，其結(jié)構(gòu)如圖4中所示。對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因vip3X在防治鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
所述鱗翅目害蟲為小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾。所述應(yīng)用為將殺蟲基因蛋白Vip3X制成殺蟲劑用于防治鱗翅目害蟲，所述殺蟲基因蛋白Vip3X的氨基酸序列如SEQ ID N02所示，或者將上述殺蟲基因vip3X轉(zhuǎn)入植物或微生物中表達(dá)抗鱗翅目害蟲的特性。所述殺蟲基因vip3X具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列，所述植物為玉米。本發(fā)明是從菌株BTAOTl (保藏號(hào):CGMCC N0.6781 )，公眾還可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所取得)克隆得到的一個(gè)新基因，全長(zhǎng)為2370bp，其核苷酸序列為SEQ IDNOl，其編碼的氨基酸序列為790個(gè)見SEQ ID N02所示。經(jīng)過(guò)殺蟲活性測(cè)定，該基因蛋白對(duì)小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾有高毒力。針對(duì)上述殺蟲活性區(qū)氨基酸序列，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了用于轉(zhuǎn)基因植物開發(fā)的DNA序列，如SEQ ID N03所示。該合成序列導(dǎo)入到玉米中，對(duì)小地老虎有較好的抗蟲活性。保藏信息:保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)保藏日期:2012年11月06日，保藏編號(hào):CGMCC N0.6781分類命名:蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis


圖lvip3X基因小片段的PCR鑒定圖譜圖2vip3X基因全長(zhǎng)序列PCR擴(kuò)增圖M:DNA marker DL10000 ；1:BTA5D1 中 vip3 基因圖3vip3X基因在Rosetta (DE3)菌株中的表達(dá)M:protein marker ；l:pEB ；2:pEB-Vip3X圖4表達(dá)載體pUS構(gòu)建流程5抗性植株P(guān)CR檢測(cè)M:ffide-range Marker ；P:pUX ；CK:陰性對(duì)照；1 10:部分轉(zhuǎn)基因植株圖6PCR陽(yáng)性植株中Vip3X蛋白占可溶性蛋白比例圖7T0代轉(zhuǎn)基因植株的小地老虎生物活性測(cè)定左為轉(zhuǎn)Vip3X基因玉米，右為非轉(zhuǎn)因玉米。
具體實(shí)施例方式1.大腸桿菌JMllO和Rosetta (DE3)菌株熱擊感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化挑取單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按1%接種量接種于IOOmlLB 液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng) 2-2.5hr, (OD600=0.5-0.6);4°C，4000rpm離心 IOmin ;棄上清，向沉淀中加入50ml預(yù)冷的0.lmol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，置于冰上30min ；4°C, 4000rpm離心lOmin，回收細(xì)胞；用2-4ml冰預(yù)冷的0 .lmol/L CaCl2重懸細(xì)胞，分裝成200 μ L/0.5mL離心管中，于4°C保存，一周內(nèi)用完。將200 μ L感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)?；靹颍?0min，42°C熱擊1.5min,冰浴3min,加入800 μ L LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)60min,取200 μ L涂板，37°C培養(yǎng)。2.vip3基因的鑒定
參照GenBank公布的vip3類基因編碼區(qū)的N-端和C-端的序列同源性，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異性引物VIP-F/VIP-R，序列如下:VIP-F:5 ‘-TCTATGTTGAGTGATGTA-3’VIP-R:5 ‘-TTGATANGCAGGTGTAA-3’以標(biāo)準(zhǔn)菌株BTAOTl的總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μ L的PCR反應(yīng)體系為:
權(quán)利要求
1.對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因vip3X，其核苷酸序列如SEQID N03所示。
2.一種表達(dá)載體,其含有權(quán)利要求1所述的殺蟲基因vip3X。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其為pUS，結(jié)構(gòu)如圖4中所示。
4.對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因vip3X在殺害鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述鱗翅目害蟲為小地老虎、小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，為將殺蟲基因蛋白Vip3X制成殺蟲劑用于殺害鱗翅目害蟲，所述殺蟲基因蛋白Vip3X的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，為將權(quán)利要求1所述的殺蟲基因vip3X轉(zhuǎn)入植物或微生物中，表達(dá)抗鱗翅目害蟲的特性。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述殺蟲基因vip3X具有如SEQID N03所示的核苷酸序列，所述植物為玉米 。
全文摘要
本發(fā)明涉及“蘇云金芽胞桿菌新型vip3X基因及其應(yīng)用”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因蛋白Vip3X，表現(xiàn)出鱗翅目害蟲的高毒力。該基因序列改造后SEQ ID NO3應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物或植物，具有較高的表達(dá)量，且使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對(duì)工程菌的抗藥性產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103173469SQ20131012869
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者彭琦, 束長(zhǎng)龍, 宋福平, 張 杰, 黃大昉, 梁影屏, 耿麗麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所