專利名稱：山綠茶種苗的快速繁育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種山綠茶種苗的快速繁育方法。
背景技術(shù)：
山綠茶為冬青科植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的干燥葉經(jīng)加工炮制而成。山綠茶療效明確、使用歷史悠久，已收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990年版)。山綠茶具有清熱解毒、消腫止痛、活血通脈的功效，主要用于降血壓、降血脂、降膽固醇及冠心病、腦血管意外所致的偏癱，以及風(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、咽喉水腫、扁桃體炎、痢疾等病癥。藥理研究還表明山綠茶中的三萜類化合物具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗肝病毒抗炎和抗AIDS等活性。以山綠茶為主要原料制成的制劑作為降壓、降脂的常用中成藥，具有使用量較大、療效確切、毒副作用小、產(chǎn)品獨特等優(yōu)點，在全國各地銷路很好，市場占有率高，有較好的經(jīng)濟效益和持續(xù)發(fā)展前景。據(jù)《新華本草綱目》記載:“山綠茶，又名海南冬青，性寒，味苦，經(jīng)入肝、脾、肺、腎，平息肝風(fēng)，用于肝風(fēng)頭痛及肝陽上亢頭痛、頭暈等癥”。申請人廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)有決明山綠茶、山綠茶降壓膠囊等主導(dǎo)產(chǎn)品，在市場同類產(chǎn)品中銷量領(lǐng)先。山綠茶的原植物海南冬青是冬青科冬青屬植物，主要分布于廣西、廣東、海南和云南一帶，在廣西區(qū)內(nèi)主要分布在大明 山附近各縣海撥超過600-800m的山上，目前企業(yè)收購的山綠茶藥材均來自于大明山附近的上林、武鳴、賓陽、馬山等地，均為野生的藥材資源，迄今尚未有栽培歷史。隨著山綠茶制劑新產(chǎn)品市場銷量的逐年增加，山綠茶藥材需求量也不斷增大，但經(jīng)過多年采集，有限的野生資源已面臨枯竭，原料供不應(yīng)求，致使藥材價格不斷上揚。為了滿足企業(yè)的生產(chǎn)需求，必須進行大面積的人工栽培，為藥材原料提供新的來源。目前，野生山綠茶主要通過種子繁殖，其種子胚組織發(fā)育不良，兼受季節(jié)、生長環(huán)境等因素的影響，種子繁殖率低，發(fā)芽率低于2% ;此外，繁育期長，繁殖后代變異大，成活率低，繁殖受自然條件限制等諸多問題，不能滿足大面積人工栽培的需要。經(jīng)檢索，迄今為止，國內(nèi)未見有關(guān)于山綠茶相關(guān)育種及栽培研究的報道，國外也無相關(guān)的研究記錄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低廉、操作簡便、增殖速度快、實用有效的山綠茶種苗的快速繁育方法，該法借助培養(yǎng)基和附加成份對山綠茶進行快速繁殖，增殖培養(yǎng)形成的種苗可直接用于大田種植，生產(chǎn)山綠茶藥材速度快、效果好、成活率高。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:山綠茶種苗的快速繁育方法，包括以下步驟:( I)外植體選擇與滅菌取山綠茶成熟的漿果，消毒處理后剝開果皮取種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為24 28°C ；
(2)初代誘導(dǎo)待子葉展開后，將無菌苗的根系切去，轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)20d ；(3)繼代增殖將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的叢生芽切下單芽叢轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng) 20d ；(4)生根當(dāng)繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)周期25d;(5)煉苗移栽把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗3 5d，將瓶苗取出，清洗后移栽到細河沙上，移栽后IOd內(nèi)保持相對濕度95%左右，溫度控制在20 26°C，無直射光，移栽15d后即可上杯種植，30d后可進行大田栽培。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS (Murashige and skoog (1962)培養(yǎng)基)+0.5
3.0mg.Ll-BA (6-芐基腺嘌呤)+0.1 1.0mg.T1NAA (萘乙酸)+ 蔗糖 25 30g.Γ1+瓊脂 5g.I71, pH6.0。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 3.0mg.L_16-BA+0.8 1.8mg.L-1KT (激動素)+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L \ pH6.0。繼代培養(yǎng)基為M S+0.5 3.0mg Γ^-ΒΑ+Ο.1 1.0mg L^KT+0.1 1.0mg.L-1TDZ(喔苯隆)+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L S pH6.0。生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 2.0mg.L-1IBA (吲哚丁酸)+0.1 1.0mg.L-1NAA+ 蔗糖 25 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0。初代誘導(dǎo)、繼代增殖與生根的培養(yǎng)條件為溫度24 28°C，光照強度2000LX 3000Lx、光照時間 I Oh/d。步驟(I)中消毒處理是0.l%HgCl2溶液消毒處理5 IOmin。為緩解山綠茶原料來源緊張、供不應(yīng)求的局面，發(fā)明人以山綠茶的種子為外植體，采用植物組織細胞繁殖法，建立了一種山綠茶種苗的快速繁育方法。該法包括外植體滅菌、初代誘導(dǎo)、繼代增殖、生根移栽等技術(shù)環(huán)節(jié)，使山綠茶迅速增殖，短時間內(nèi)生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)種苗，所得種苗可直接用于大田生產(chǎn)。本發(fā)明快速繁育方法生產(chǎn)成本低、操作簡便、增殖速度快、周期短(I 2個月)，可大量、快速、持續(xù)獲得高質(zhì)量的山綠茶試管苗，而且全年皆可進行，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。利用本發(fā)明繁殖山綠茶，移栽成活率高(84.1%以上)，種苗遺傳特性穩(wěn)定，不會發(fā)生變異，有利于保持種苗的優(yōu)良性狀，提高種苗使用的安全性，對藥用植物資源再生和持續(xù)利用具有十分積極的影響，可廣泛適用于商業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例1( I)外植體選擇與滅菌取山綠茶成熟的漿果，用0.05%洗潔精溶液浸泡lOmin，再經(jīng)流水沖洗15min，接著用0.1ffigCl2溶液消毒處理lOmin，然后用鑷子剝開果皮取種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為24 26°C，利用該法滅菌種子無污染；種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+1.5mg -Γ^-ΒΑ+Ο.5mg -L^1NAA+ 蔗糖 25g -Γ1+ 瓊脂 5g. ΛρΗ6.00(2)初代誘導(dǎo)種子20d開始萌發(fā)(萌發(fā)率為83.2%)，待子葉展開后，將無菌苗的根系切去，轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)IOd (溫度24 26°C，光照強度2000LX、光照時間10h/d)，叢生芽從無菌苗的下部葉腋處長出，繼續(xù)培養(yǎng)至20d轉(zhuǎn)接，誘導(dǎo)率為100% ;叢生芽發(fā)生過程不經(jīng)過愈傷組織階段。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5mg.L 1B-BA+1.2mg.L ^T+0.5mg.L 1NAA+ 鹿糖25g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0。(3)繼代增殖將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的叢生芽切下單芽叢轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)20d(溫度24 26°C，光照強度2000Lx、光照時間10h/d)，叢生芽生長快，無玻璃化現(xiàn)象，增殖倍數(shù)為12.4 ;·
繼代培養(yǎng)基為MS+1.5mg.L_16-BA+0.5mg.L_1KT+0.5mg.L_1TDZ+0.5mg.L-1NAA+ 蔗糖 25g.I71+ 瓊脂 5g.I71, pH6.00(4)生根當(dāng)繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)周期25d (溫度24 26°C，光照強度2000Lx、光照時間10h/d)，7d開始長根原基，25d后開蓋煉苗，生根率為91% ；生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.2mg.Γ' ΒΑ+Ο.5mg.T1NAA+ 蔗糖 25g.Γ1+ 瓊脂 5g. ΛρΗ6.00(5)煉苗移栽把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗5d，用鑷子將瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培養(yǎng)基，清洗后移栽到細河沙上，移栽后IOd內(nèi)保持相對濕度95%左右，溫度控制在20 26°C，無直射光，移栽15d后上杯種植，30d后進行大田栽培，移栽成活率86.2%。實施例2其它基本同實施例1，僅步驟(I)中用0.l%HgCl2溶液消毒處理5min，結(jié)果污染率為16.7%，萌發(fā)率83.4%，誘導(dǎo)率98.7%，增殖倍數(shù)12.7，生根率92%，移栽成活率85.8%。實施例3其它基本同實施例1，僅步驟(I)中種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+0.5mg.L_16-BA+1.0mg.L-1NAA+ 鹿糖 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0 ;培養(yǎng)室溫度為 26 280C，結(jié)果20d開始萌發(fā)，萌發(fā)率為84.6%，誘導(dǎo)率98.5%，增殖倍數(shù)12.5，生根率91%，移栽成活率86.1%。實施例4其它基本同實施例1，僅步驟(I)中種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+3.0mg.L_16-BA+0.1mg.L-1NAA+ 鹿糖 30g.I71+ 瓊脂 5g.I71, ρΗ6.0 ;培養(yǎng)室溫度為 26 280C，結(jié)果20d開始萌發(fā)，萌發(fā)率為83.9%，誘導(dǎo)率99.3%，增殖倍數(shù)12.8，生根率90%，移栽成活率85.8%。
實施例5其它基本同實施例1，僅步驟(2)中叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg Γ'θ-ΒΑ+Ι.8mg
L^KT+l.0mg.L-1NAA+蔗糖30g.L-1+瓊脂5g.L-1，pH6.0 ;培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，誘導(dǎo)率為95.6%，萌發(fā)率83.7%，增殖倍數(shù)13.1，生根率91%，移栽成活率84.1%。實施例6其它基本同實施例1，僅步驟(2)中叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0mg -Γ^-ΒΑ+Ο.8mg
Γ'ΚΤ+Ο.1mg.L- 1NAA+蔗糖30g.L-1+瓊脂5g.L-1，pH6.0 ;培養(yǎng)30d后轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，誘導(dǎo)率為96.3%，萌發(fā)率83.9%，增殖倍數(shù)12.9，生根率92%，移栽成活率85.9%。實施例7其它基本同實施例1，僅步驟(3)中繼代培養(yǎng)基為MS+0.5mg Γ'θ-ΒΑ+Ι.0mg.L^1KT+
1.0mg-L^TDZ+l.0mg.[1NAA+蔗糖 30g.L-1+瓊脂 5g. ΛρΗ6.0 ;培養(yǎng)室溫度為 26 28。。，光照強度3000Lx，培養(yǎng)20d后，增殖倍數(shù)為11.2，萌發(fā)率84.1%，誘導(dǎo)率99.2%，生根率90%，移栽成活率84.9%。實施例8其它基本同實施例1，僅步驟(3)中繼代培養(yǎng)基為MS+3.0mg Γ^-ΒΑ+Ο.1mg.L^1KT+
0.1mg -L^TDZ+0.1mg.[1NAA+蔗糖 30g.L-1+瓊脂 5g. ΛρΗ6.0 ;培養(yǎng)室溫度為 26 28。。，光照強度3000Lx，培養(yǎng)20d后，增殖倍數(shù)為11.7，萌發(fā)率84.2%，誘導(dǎo)率98.9%，生根率91%，移栽成活率85.7%。實施例9其它基本同實施例1，僅步驟(4)中生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg.L^1IBA+1.0mg.L-1NAA+ 鹿糖 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0 ;培養(yǎng)室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，培養(yǎng)25d后開蓋煉苗，生根率為90%，萌發(fā)率83.5%，誘導(dǎo)率99.4%，增殖倍數(shù)13.2，移栽成活率85.7%。實施例10其它基本同實施例1，僅步驟(4)中生根培養(yǎng)基為1/2MS+2.0mg.Γ' ΒΑ+Ο.1mg.T1NAA+ 蔗糖 30g.Γ1+ 瓊脂 5g. Λ ρΗ6.0 ;培養(yǎng)室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，培養(yǎng)25d后開蓋煉苗，生根率為91%，萌發(fā)率83.3%，誘導(dǎo)率99.2%，增殖倍數(shù)12.8，移栽成活率86.3%。實施例11其它基本同實施例1，僅步驟(5)中打開瓶蓋煉苗3d，移栽成活率84.1%，萌發(fā)率83.9%,誘導(dǎo)率98.6%,增殖倍數(shù)12.6，生根率90%。
權(quán)利要求
1.一種山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體選擇與滅菌 取山綠茶成熟的漿果，消毒處理后剝開果皮取種子接種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為24 28°C ； (2)初代誘導(dǎo) 待子葉展開后，將無菌苗的根系切去，轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)20d ； (3)繼代增殖 將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的叢生芽切下單芽叢轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)20d ； (4)生根 當(dāng)繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)周期25d ； (5)煉苗移栽 把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗3 5d，將瓶苗取出，清洗后移栽到細河沙上，移栽后IOd內(nèi)保持相對濕度95%左右，溫度控制在20 26°C，無直射光，移栽15d后即可上杯種植，30d后可 進行大田栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為 MS+0.5 3.0mg.L ^-BA+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L SρΗ6.00
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+0.5 3.0mg.L ^-ΒΑ+Ο.8 1.8mg.L ^T+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)基為 MS+0.5 3.0mg.L_16-BA+0.1 1.0mg.L_1KT+0.1 1.0mg.L_1TDZ+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L S pH6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0.5 2.0mg.L ^BA+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L SpH6.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述初代誘導(dǎo)、繼代增殖與生根的培養(yǎng)條件為溫度24 28°C，光照強度2000Lx 3000Lx、光照時間10h/d。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于步驟(I)中消毒處理是0.l%HgCl2溶液消毒處理5 lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山綠茶種苗的快速繁育方法，包括外植體滅菌、初代誘導(dǎo)、繼代增殖、生根移栽等技術(shù)環(huán)節(jié)，使山綠茶迅速增殖，短時間內(nèi)生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)種苗，所得種苗可直接用于大田生產(chǎn)，緩解山綠茶原料來源緊張、供不應(yīng)求的局面。本發(fā)明快速繁育方法生產(chǎn)成本低、操作簡便、增殖速度快、周期短，可大量、快速、持續(xù)獲得高質(zhì)量的山綠茶試管苗，而且全年皆可進行，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。利用本發(fā)明繁殖山綠茶，移栽成活率高，種苗遺傳特性穩(wěn)定，不會發(fā)生變異，有利于保持種苗的優(yōu)良性狀，提高種苗使用的安全性，對藥用植物資源再生和持續(xù)利用具有十分積極的影響，可廣泛適用于商業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK103141395SQ201310114158
公開日2013年6月12日 申請日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者蒙永業(yè), 譚文明, 利榮歡, 覃愛環(huán) 申請人:廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司