專利名稱：一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種種質(zhì)資源保存和解凍培育的方法，具體的說，涉及到一種植物微莖尖小液滴包埋玻璃化超低溫保存和解凍培養(yǎng)的方法，屬植物細胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
種質(zhì)資源的保存廣義上有現(xiàn)地保存和異地保存兩種。對于那些無法用種子進行長期保存的植物如營養(yǎng)繁殖植物及頑拗性種子植物來說:田間保存易受自然災(zāi)害影響而導(dǎo)致種質(zhì)變異或毀滅，組織培養(yǎng)保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。而在超低溫保存條件下，植物的生理生化活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內(nèi)。被認為是這類植物目前安全、有效、經(jīng)濟的基因資源長期保存的最有希望的保存方法。大多數(shù)植物材料如懸浮細胞、愈傷組織、莖尖、芽尖、胚等，含有大量的細胞間水分，對冷凍傷害特別敏感。特別是植物分生組織、芽端的細胞質(zhì)分布均勻而且稠密，對低溫冰凍極為敏感，冰凍過程中的損傷效應(yīng)特別突出，哪怕是局部的冰凍損傷都會影響凍后的正常分化與再生。同時，分生組織、芽端必須保持結(jié)構(gòu)的完整性才能快速分化。在操作過程中，細嫩組織容易受到機械損傷，從而造成成活率下降。因此，超低溫保存面臨的課題是盡可能采取更多的、更有效的手段來保證分生組織、芽端在超低溫保存過程中免受損傷。在20世紀的90年代后，以PVS2作為冷凍保存液的玻璃化法成為植物超低溫保存的主要方法(參見 Sakai A, Engelmann F.Vitrification, encapsulation-vitrificationand droplet-vitrification:a review.Cryoletters, 2007, 28 (3): 151-172.) 植物材料經(jīng)高濃度的保護液中處理后，迅速投入液氮中，水分形成玻璃化狀態(tài)，從而避免形成冰晶造成機械損傷，有效保護植物組織，被成功運用于100多種植物不同組織的超低溫保存。隨著玻璃化方法的發(fā) 展，保存技術(shù)的進一步多樣化與簡易化，近年來在傳統(tǒng)玻璃化法上發(fā)展出來的包埋玻璃化法(參見D.Hira, A Sakai, Simplified cryopreservationof sweet potato [Ipomoeabatatas(L.) ]by optimizing conditions forosmoprotection, Plant Cell Reports, (2003) 21:961-966),即將植物組織在海藻酸酸中形成包埋小珠，再經(jīng)玻璃化法處理后進行冷凍的方法，綜合了傳統(tǒng)玻璃化法與包埋脫水法的優(yōu)點，操作較簡便且減少玻璃化過程中對莖尖的機械損傷，成功應(yīng)用于蘋果、薄荷、草莓、柿、山藥、大蒜等植物的超低溫保存。最新發(fā)展的小液滴法(參見Halmagyi A, Delie C，IsacV.Cryopreservation of Malus cultivars:Comparison of two droplet protocols[J].Scientia Horticulturae, 2010, 124(3):387-392.)，將植物材料經(jīng)玻璃化處理后，在鋁箔上滴成小液滴，后直接投入液氮進行迅速冷凍。由于凍存及解凍速度快，組織不易形成冰晶，易成活再生，是一有發(fā)展前景的方法。超低溫保存中，莖尖大小及結(jié)構(gòu)的完整性對超低溫保存的成活率及恢復(fù)培養(yǎng)均有影響。材料體積小，在凍存中容易脫水，受冰晶傷害小，但對操作水平要求較高，容易造成機械損傷，在其后的恢復(fù)生長中不易成活。故在超低溫保存過程中，應(yīng)盡量減少對莖尖的操作損傷以及凍存過程中冰晶對組織造成的損傷，從而達到較高的成活率?，F(xiàn)有技術(shù)在超低溫保存過程中，需對細嫩莖尖進行數(shù)次操作，對技術(shù)人員要求較高且易造成莖尖二次機械損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，采用濾紙小條作為操作載體，批量處理莖尖以提高操作效率，減少接種器具與植物細嫩莖尖的直接接觸，從而減少機械損傷，提供一種適用于植物微莖尖小液滴包埋玻璃化超低溫保存方法及冷凍植株后再生的技術(shù)。為了實現(xiàn)上述的技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)方法，其保存方法包括如下步驟:在解剖鏡下剝?nèi)o菌苗莖尖，浸A 2% 5%無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸后，將莖尖排列在無菌濾紙條上，然后將其浸入0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)10 20min固定后，再將帶有莖尖的濾紙條放入0.3 0.5mol -L-1蔗糖的MS液體中培養(yǎng)I 3天， 置于預(yù)處理溶液中處理20-40min轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑中處理10 80min，然后將帶有莖尖的濾紙條轉(zhuǎn)移到無菌冷凍管中放入液氮中保存。本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案是，所述經(jīng)10 20min固定是指將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中進行包埋固化。本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案是，所述無菌濾紙小條為3mm x20mm的無菌濾紙小條。本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案是，所述預(yù)處理溶液為包含l-3mol.171甘油和0.2-0.6mol L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基，優(yōu)選的預(yù)處理溶液為含2mol L—1甘油和
0.4mol L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案是，所述玻璃化保護劑包含1.63-4.89mol L—1甘油、
1.61-4.84mol I71 乙二醇、1.27-3.8ImoI L-1DMSO 和 0.3-0.5mol I71 蔗糖，優(yōu)選的玻璃化保護劑包含 3.26mol I71 甘油、2.42mol I71 乙二醇、1.9mol [1DMSO 和 0.4mol I71 蔗糖。本發(fā)明還提供一種植物微莖尖超低溫解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其包括以下步驟:將權(quán)利要求1 5保存的帶有莖尖的濾紙小條由冷凍管中取出，然后放入含1.2mol -r1蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20min，將解凍及洗滌后的莖尖放入恢復(fù)培養(yǎng)基進行暗光或弱光培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)入到常光培養(yǎng)，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，莖尖可直接長成植株。本發(fā)明一種優(yōu)選的實施方案是，，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為MS半固體培養(yǎng)基，所述MS半固體培養(yǎng)基包含 0.5mg L 1BAa0.1mg L 1NAA 和 0.5mg L 1GAS0在本發(fā)明中，若無特別指出，本發(fā)明中所涉及的溶液均為水溶液；本發(fā)明中涉及到的預(yù)冷的溫度是指4°C。本發(fā)明的技術(shù)效果是，采用的保存和解凍培育方法操作簡便，穩(wěn)定可靠，減少了在各項操作過程中對莖尖的機械損傷，保存后恢復(fù)生長狀況良好，植株再生率高的可達60%以上，取得了良好的經(jīng)濟和社會效果。


圖1是本發(fā)明的操作流程圖。
(a、揀選優(yōu)良的植物外植體；b、將獲取的外植體經(jīng)組織培養(yǎng)形成無菌組培苗；c、剝?nèi)o菌苗莖尖，浸入2% 5%的無鈣離子的海藻酸鈉溶液中輕蘸，用鑷子將莖尖排列在3mmX20mm無菌濾紙小條上；d、將含有莖尖的無菌濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)10 20分鐘固定；e、將固定后帶有莖尖的濾紙小條放入0.3 0.5mol L-1蔗糖的MS液體或固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)I 3天；f、將莖尖置于預(yù)處理溶液中在室溫下處理20-40分鐘；g、將莖尖轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑中在4°C或室溫下處理10 80分鐘；h、將帶有莖尖的濾紙小條轉(zhuǎn)移無菌冷凍管中、將冷凍管直接投入到液氮中保存；j、將帶有莖尖的濾紙小條由冷凍管中取出后放入選含1.2mol -r1蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20分鐘；k、將獲取的帶莖尖的濾紙條或把莖尖剝離后放入恢復(fù)培養(yǎng)基，經(jīng)暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入常光培養(yǎng)；L、常光培養(yǎng)等莖尖返綠并有萌動跡象時轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中再進行培養(yǎng)，莖尖可直接長成植株)。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明保護的范圍。在本發(fā)明中，若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。圖1敘述的是本發(fā)明保存方法的操作流程圖，其操作步驟如下:在解剖鏡下剝?nèi)o菌苗莖尖，浸入2% 5%無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸后，將莖尖排列在無菌濾紙條上，然后將其浸入0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)10 20min固定后，再將帶有莖尖的濾紙條放入0.3 0.5mol -L-1蔗糖的MS液體中培養(yǎng)I 3天，置于預(yù)處理溶液中處理20_40min轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑中處理10 80min，然后將帶有莖尖的濾紙條轉(zhuǎn)移到無菌冷凍管中放入液氣中保存。圖1還敘述了超低溫保存植株的解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其操作步驟包括:將帶有莖尖的濾紙小條由冷凍管中取出后放入選含1.2mol L—1蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20分鐘，將獲取的帶莖尖的濾紙條或把莖尖剝離后放入恢復(fù)培養(yǎng)基，經(jīng)暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入常光培養(yǎng)，常光培養(yǎng)等莖尖返綠并有萌動跡象時轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中再進行培養(yǎng)，莖尖可直接長成植株。莖尖暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基是含有適量生長激素的MS半固體培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為3天。]MS 半固體培養(yǎng)基的成份包含 0.5mg L^1BA,0.1mg L4NAA 和 0.5mg L^1GAS0為了更詳細的說明本發(fā)明的具體實施方法，下面結(jié)合各個實施例對本發(fā)明的具體實施方式
做進一步說明。實施例1香石竹的超低溫保存 材料:
香石竹品種:紅花品種，從花卉市場購買。切取花莖繁殖試管苗，獲得花莖無性繁殖系。預(yù)培養(yǎng)培 養(yǎng)基:含0.3mol L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基
預(yù)處理溶液:含2mol L—1甘油和0.4mol L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基玻璃化保護劑:含有3.26mol L—1甘油、2.42mol L-1乙二醇、1.9mol [1DMSO和0.4mol I71 鹿糖方法:
選取上述香石竹品種的健壯組培苗，在解剖鏡下剝?nèi)o菌苗莖尖(I 2mm)，浸入2% 5%的無鈣離子的海藻酸鈉溶液中輕蘸，即用鑷子將莖尖整齊放在3_X20mm無菌濾紙小條上。將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)10 20分鐘固定后，將帶有莖尖的濾紙小條放入0.3mol -r1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，淺層培養(yǎng)3天，將含有莖尖的濾紙小條在預(yù)處理液中室溫下浸泡30分鐘，然后轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑中在4°C下處理60分鐘，然后直接投入裝滿液氮的安培管中，放入液氮中保存即可。再培養(yǎng)及存活率考察
取出在液氮中凍存24h以上的冷凍管，直接將帶有莖尖的濾紙小條投入含1.2mol L—1蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌液中進行解凍及洗滌20分鐘。洗滌后帶莖尖的濾紙條用濾紙吸干，移至含0.5mg L^1BA,0.1mg L4NAA和0.5mg L_1GA3的MS半固體培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3天，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，常規(guī)光照培養(yǎng)二。結(jié)果表明，莖尖保存后香石竹新植株恢復(fù)生長狀況良好，植株再生率可達80% 實施例2菊花的超低溫保藏
材料:
菊花品種:切花菊‘神馬’(獨本菊)，從花卉市場購買。切取花托繁殖試管苗，獲得花托無性繁殖系。預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:含0.3mol L `1鹿糖的MS固體培養(yǎng)基
預(yù)處理溶液:含2mol L—1甘油和0.4mol L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基 玻璃化保護劑:含有3.26mol L—1甘油、2.42mol L-1乙二醇、1.9mol [1DMSO和
0.4mol I71 鹿糖方法:
選取上述菊花品種的健壯組培苗，在解剖鏡下切取莖尖(1.5 2mm)，浸入2% 5%的無鈣離子的海藻酸鈉溶液中輕蘸，即用鑷子將莖尖整齊放在3mmX 20mm無菌濾紙小條上。將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)10 20分鐘固定后，將帶有莖尖的濾紙小條放入0.3mol -r1蔗糖的MS固體培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3天，將帶有莖尖的濾紙小條在預(yù)處理液中室溫下浸泡30分鐘，再轉(zhuǎn)移至玻璃化保護劑中4°C下處理20分鐘，再將帶有莖尖的濾紙小條轉(zhuǎn)移無菌冷凍管中，直接投入液氮中保存。再培養(yǎng)及存活率考察
取出在液氮中凍存24h以上的冷凍管，解凍時將帶有莖尖的濾紙小條由管中拿出后直接放入選含1.2mol -r1蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20分鐘。后將帶莖尖的濾紙條用濾紙吸干，在解剖鏡下將莖尖由濾紙上剝離，移至含0.5mg L^1BA,0.1mg.1^1NAA和0.5mg -L^1GAS的MS半固體培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3天，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，常規(guī)光照培養(yǎng)。結(jié)果表明，莖尖保存后菊花新植株恢復(fù)生長狀況良好，植株再生率可達為60% 80%。實施例3百合的超低溫保藏材料:
食用百合(LiIium davidii Var.Unicolor (Hoog)Cotton)
方法:
選取上述品種的健壯組培苗，將I 2mm的小鱗莖(含莖尖生長點)浸入2% 5%的無鈣離子的海藻酸鈉溶液中輕蘸，即用鑷子將莖尖整齊放在3mmX 20mm無菌濾紙小條上。將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)20分鐘固定后，將帶有莖尖的濾紙小條放入MS+0.5mol -L-1蔗糖的培養(yǎng)基上于4°C低溫預(yù)培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)至25°C預(yù)處理液中處理20分鐘，接著在冰浴中用PVS2處理80分鐘后，換入新鮮PVS2并迅速投入液氮。再培養(yǎng)及存活率考察:
取出在液氮中凍存24h以上的冷凍管，直接將帶有莖尖的濾紙小條投入含1.2mol L—1蔗糖的MS培養(yǎng)液洗滌液中進行解凍及洗滌20分鐘。洗滌后帶莖尖的濾紙條用濾紙吸干，轉(zhuǎn)移至含6-BA0.5mol L_1+NAA0.1mol L_1+GA30.5mol L—1的MS半固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入同小鱗莖誘 導(dǎo)的條件下培養(yǎng)。30d后再生率可達53.0%。
權(quán)利要求
1.一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述保存方法包含的步驟有:在解剖鏡下剝?nèi)o菌苗莖尖，浸入29T5%無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸后，將莖尖排列在無菌濾紙條上，然后將其浸入0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)IOlOmin固定后，再將帶有莖尖的濾紙條放入0.3^0.5mol L-1蔗糖的MS液體中培養(yǎng)f 3天，置于預(yù)處理溶液中處理20-40min轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑中處理l(T80min，然后將帶有莖尖的濾紙條轉(zhuǎn)移到無菌冷凍管中放入液氮中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述經(jīng)IOlOmin固定是指將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中進行包埋固化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述無菌濾紙條為3_ X 20mm的無菌濾紙小條。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述預(yù)處理溶液為包含1-3 mo I L—1甘油和0.2-0.6 mo I L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基，優(yōu)選的預(yù)處理溶液為含2 mo I L—1甘油和0.4 mo I L—1蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述玻璃化保護劑包含1.63-4.89mol L—1甘油、1.61-4.84mol L—1乙二醇、1.27-3.8 Imo I I71 D MSO 和 0.3-0.5mol I71 蔗糖，優(yōu)選的玻璃化保護劑包含 3.26 mo I I71甘油、2.42 mol L 1 乙 二醇、1.9 mol L 1 DMSO 和 0.4 mo I L 1 鹿糖。
6.一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法包含步驟有:將權(quán)利要求1飛保存的帶有莖尖的濾紙小條由冷凍管中取出，然后放入含1.2 mol.171蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20min ;將解凍及洗滌后的莖尖放入恢復(fù)培養(yǎng)基進行暗光或弱光培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)入到常光培養(yǎng)，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，莖尖可直接 長成植株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種植物微莖尖超低溫保存和解凍、恢復(fù)培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為MS半固體培養(yǎng)基，所述MS半固體培養(yǎng)基包含0.5 mg L—1 BA、·0.1 mg L 1 NAA 和 0.5 mg L 1 GA3。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以濾紙條為操作載體的植物微莖尖小液滴包埋玻璃化超低溫保存、解凍及恢復(fù)培養(yǎng)方法，包含步驟有在解剖鏡下剝?nèi)o菌苗莖尖，浸入2%~5％無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸，將莖尖排列在無菌濾紙條上，將其浸入0.1%氯化鈣溶液中，經(jīng)10~20min固定，再將帶有莖尖的濾紙條放入0.3~0.5mol·L-1蔗糖的MS液體中培養(yǎng)1~3天，置于預(yù)處理溶液中處理20-40min轉(zhuǎn)入玻璃化保護劑中處理10~80min，然后將帶有莖尖的濾紙條轉(zhuǎn)移到無菌冷凍管中放入液氮中保存。解凍時，將帶有莖尖的濾紙條由管中取出放入含1.2mol·L-1蔗糖的MS培養(yǎng)液解凍及洗滌20min將帶莖尖的濾紙條放入恢復(fù)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，直至生長成植株，本發(fā)明方法以濾紙條為操作載體，減少接種器具與植物細嫩莖尖的直接接觸，降低機械損傷。
文檔編號A01N3/00GK103202225SQ20131007608
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者林田, 楊華, 龍萍, 朱天生, 劉灶長, 李天菲, 羅利軍 申請人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心