專利名稱：一種反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵及微生態(tài)制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及包含多種益生菌的針對(duì)反芻動(dòng)物的復(fù)合微生態(tài)制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
針對(duì)反芻動(dòng)物(牛、羊)疾病的預(yù)防和治療，目前國內(nèi)外獸醫(yī)臨床主要采用的是在飼料中添加抗生素和化學(xué)合成藥物來進(jìn)行治療。由于反芻動(dòng)物擁有特殊的消化生理結(jié)構(gòu)，其瘤胃是一個(gè)天然發(fā)酵罐，分布有成千上萬種有益微生物和纖毛蟲，長期使用抗生素和化學(xué)合成藥物會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常菌群失調(diào)，易導(dǎo)致二重感染，另外，抗生素還會(huì)在畜產(chǎn)品(肉、奶、皮毛等)中產(chǎn)生殘留，進(jìn)而通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，威脅人類健康。世界各國飼料行業(yè)對(duì)抗生素禁用和限用的呼聲越來越高，并禁用了一批毒性較大和殘留較大的藥物，因此，改變養(yǎng)殖觀念，以提高動(dòng)物機(jī)體免疫力為先，“預(yù)防為主，防重于治”，并開發(fā)應(yīng)用無毒無藥殘的新型綠色飼料添加劑成為必然趨勢。微生態(tài)制劑由益生菌經(jīng)工業(yè)化發(fā)酵制備得到，其包含多種有益微生物及其代謝產(chǎn)物，可直接飼喂動(dòng)物，通過維持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡而發(fā)揮作用，具有防病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長、增加體重等多種功能，是一種多功能、無毒無害、無殘留、不污染環(huán)境的綠色飼料添加劑。目前，市場上的微生態(tài)制劑主要存在以下問題:
(1)主要針對(duì)單胃動(dòng)物，不適宜于反芻動(dòng)物復(fù)雜多變的瘤胃內(nèi)環(huán)境，所含各種益生菌對(duì)胃酸和膽堿耐受性不良，活菌數(shù)量少，在消化道內(nèi)難以保持活性；
(2)缺乏益生菌間拮抗性的測試和研究，往往只是將各種菌株進(jìn)行簡單的復(fù)配，未充分考慮到菌種協(xié)同和拮抗效應(yīng)，配比不科學(xué)，影響實(shí)際應(yīng)用效果；
(3)缺乏菌株毒性測試，存在潛在的食用安全隱患；
(4)缺乏針對(duì)反芻動(dòng)物免疫增強(qiáng)作用的應(yīng)用效果檢測數(shù)據(jù)，尤其是針對(duì)反芻動(dòng)物特有常見疾病(如口蹄疫)的免疫防御效果，實(shí)際免疫促進(jìn)效果有待考察；
(5)涉及菌株種類較多，發(fā)酵工序復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。綜上所述，開發(fā)一種針對(duì)反芻動(dòng)物的耐酸耐膽鹽、各益生菌間無拮抗性、安全性好且具有良好促生長以及免疫增強(qiáng)效果的微生態(tài)制劑十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有微生態(tài)制劑存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑及其應(yīng)用。該復(fù)合微生態(tài)制劑所含菌株耐酸耐膽堿性強(qiáng)、相互之間無拮抗性、安全性好，制備工藝簡單，成品活菌含量高，可顯著提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其制備方法如下:將枯草芽胞桿菌CGMCC1.257、嗜酸乳桿菌LB-1、植物乳桿菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180分別經(jīng)液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)后得到二級(jí)菌種，再取所述嗜酸乳桿菌LB-1、植物乳桿菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180的二級(jí)菌種分別按體積質(zhì)量比5%的接種量接種至固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻，于32 35°C發(fā)酵6h，然后按相同的接種量接種所述枯草芽胞桿菌CGMCC1.257的二級(jí)菌種，混勻，繼續(xù)發(fā)酵42h，取發(fā)酵物于4 8°C真空密封保存，即得復(fù)合微生態(tài)制劑成品；所述固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基所含成分按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)為:麩皮60%，豆柏25%，玉米粉15% ;所述復(fù)合微生態(tài)制劑的活菌含量分別為:枯草芽胞桿菌CGMCC1.257和植物乳桿菌WZ47-1不低于108cfu/g，嗜酸乳桿菌LB-1不低于IO7Cfu/g、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180不低于106cfu/g。其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:
所述枯草芽胞桿菌CGMCC1.257的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)方法如下:挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌種接種于2(T30ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于34 37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 24h，得到一級(jí)種子液；再取l(T25ml該一級(jí)種子液接種于20(T250ml營養(yǎng)肉湯培基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 24h，得到二級(jí)菌種。所述嗜酸乳桿菌LB-1和植物乳桿菌WZ47-1的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)方法如下:分別挑取MRS斜面上生長的嗜酸乳桿菌LB-1和植物乳桿菌WZ47-1并接種于2(T30mlMRS肉湯培養(yǎng)基，于34 37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 48h，得到一級(jí)種子液；再取l(T25ml各菌株的一級(jí)種子液分別接種于20(T250mlMRS肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 48h，得到二級(jí)菌種。所述啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)方法如下:分別挑取孟加拉紅培養(yǎng)基斜面上生長的啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180并接種于2(T30ml麥芽汁培養(yǎng)基，于28 36°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 30h，得到一級(jí)種子液；再取15 30ml各菌株的一級(jí)種子液分別接種于20(T250ml麥芽汁培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 36h，得到二級(jí)菌種。所述二級(jí)菌種的活菌含量均為IO8 cfu/ml。所述固體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為34 35°C。本發(fā)明還提供一種上述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑在提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力上的應(yīng)用，是將所述復(fù)合微生態(tài)制劑作為飼料添加劑按照每頭4(T45g的量添加到反芻動(dòng)物基礎(chǔ)日糧中進(jìn)行飼喂。本發(fā)明的有益技術(shù)效果如下:
本發(fā)明針對(duì)反芻動(dòng)物特有的生理消化特點(diǎn),提供一種專門針對(duì)反芻動(dòng)物的復(fù)合微生態(tài)制劑，與現(xiàn)有市售微生態(tài)制劑相比，具有以下突出優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明所含菌株對(duì)酸性和膽鹽的耐受性好，適宜于反芻動(dòng)物復(fù)雜多變的瘤胃內(nèi)環(huán)境，可保證在消化道內(nèi)的有效活菌數(shù)量。(2)本發(fā)明充分考慮到菌種間的協(xié)同和拮抗效應(yīng)，選用相互之間完全無拮抗性的五株益生菌，通過科學(xué)配比可起到協(xié)同增效作用。(3)本發(fā)明所選菌株菌為“飼料添加劑品種目錄(2008年)”中規(guī)定的菌株，且經(jīng)過
毒性測試證明其無毒無害，安全性好。(4)本發(fā)明采固體混合發(fā)酵的制備方法，預(yù)先篩選出最佳混合發(fā)酵培養(yǎng)條件，將五株菌置于同一固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行同時(shí)發(fā)酵，避免了各菌株分別單獨(dú)發(fā)酵的繁瑣工序，操作簡便，制備工藝簡單，成品活菌含量高。
(5)養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐證明:本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑可顯著提高反芻動(dòng)物的綜合生產(chǎn)性能，促生長效果明顯；同時(shí)能有效增強(qiáng)機(jī)體淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞活性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病力，符合“預(yù)防為主，防重于治”的現(xiàn)代養(yǎng)殖理念，具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。本發(fā)明實(shí)施例所使用生物材料如下:
嗜酸乳桿菌LB-1和植物乳桿菌WZ47-1均由本申請(qǐng)人所在的內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院預(yù)防教研室微生物實(shí)驗(yàn)中心分離、鑒定和真空冷凍干燥保藏，并已在下述非專利文獻(xiàn)公開:嗜酸乳桿菌LB-1 (2005年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文《奶牛微生態(tài)制劑的研制》，作者:王美秀)，植物乳桿菌WZ47-1 (2006年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文《內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳桿菌生物學(xué)特性及其益生作用的研究》，作者:周雨霞)，以下分別簡稱嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌；枯草芽孢桿菌CGMCC1.257、啤酒酵母CGMCC2.597、產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，并由本申請(qǐng)人所在實(shí)驗(yàn)中心(同上)真空冷凍干燥保藏，以下分別簡稱枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母；致病性大腸桿菌CVCC2059購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，致病性金黃色葡萄球菌CVCC2086購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)，以下分別簡稱大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。營養(yǎng)肉湯、麥芽汁培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂，MRS肉湯、MRS瓊脂、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Kranep瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基:牛肉膏l(xiāng)g、蛋白胨10g、甘露醇10g、氯化鈉75g、酚紅0.025、瓊脂15g、蒸餾水1000ml, pH 值 7.5，121°C 高壓滅菌 15min。上述各菌株在使用時(shí)預(yù)先進(jìn)行斜面菌種活化，所用斜面培養(yǎng)基為:MRS斜面(嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌)、營養(yǎng)瓊脂斜面(枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)、孟加拉紅培養(yǎng)基斜面(啤酒酵母以及產(chǎn)朊假絲酵母)。其他原料和試劑均為市售商品。實(shí)施例1菌種的特性研究 1.1菌株間拮抗性試驗(yàn)
用接種針挑取保存于斜面上的枯草芽孢桿菌并在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上劃三條平行線，然后再分別挑取嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母在上述營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上各劃一條線，方向與上述三條平行線垂直相交，將平板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 48h，觀察劃線相交處的菌落是否連續(xù)，以此來證明枯草芽孢桿菌與其他四株菌是否拮抗，其他菌株的拮抗性試驗(yàn)方法同上，其中，嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌使用MRS瓊脂平板，啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母用孟加拉紅平板。試驗(yàn)結(jié)果:營養(yǎng)瓊脂平板上的枯草芽孢桿菌與其他四株菌劃線相交處的菌落連續(xù)，表明枯草芽孢桿菌與其它四株菌無拮抗作用；MRS瓊脂平板上嗜酸乳桿菌和與其它四株菌劃線相交處的菌落連續(xù)，表明嗜酸乳桿菌與其它四株菌無拮抗作用，同時(shí)，植物乳桿菌與其它四株菌劃線相交處的菌落連續(xù)，表明植物乳桿菌與其它四株菌無拮抗作用；孟加拉紅瓊脂平板上啤酒酵母與其它四株菌劃線相交處的菌落連續(xù)，表明啤酒酵母與其它四株菌無拮抗作用，同時(shí)，產(chǎn)朊假絲酵母與其它四株菌劃線相交處的菌落連續(xù)，表明產(chǎn)朊假絲酵母與其它四株菌無拮抗作用。1.2菌株安全性檢測
采用急性毒性試驗(yàn)(小鼠腹腔注射法):取40只小白鼠，隨機(jī)分成8組，每組5只，一組作為對(duì)照組，其余七組作為試驗(yàn)組，對(duì)照組小白鼠腹腔注射生理鹽水0.2ml，試驗(yàn)組小白鼠腹腔分別注射枯草芽孢桿菌菌液、嗜酸乳桿菌菌液、植物乳桿菌菌液、啤酒酵母菌液和產(chǎn)朊假絲酵母菌液(用麥?zhǔn)媳葷峁茏鲗?duì)比調(diào)整各菌液濃度為5X109CFU/ml)0.2ml，一種菌液對(duì)應(yīng)一個(gè)試驗(yàn)組；于室溫飼養(yǎng)觀察七天，通過小白鼠的臨床表現(xiàn)及剖檢變化，確定菌株的安全性。試驗(yàn)結(jié)果:在試驗(yàn)過程中，小白鼠的各種表現(xiàn)均正常，試驗(yàn)結(jié)束后，剖檢觀察發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小白鼠各個(gè)內(nèi)臟器官與對(duì)照組相比無任何異常變化，從小白鼠腹腔中也未分離到攻擊菌，證明本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑安全性好，飼喂無毒副作用。1.3耐酸性試驗(yàn)
1.3.1不同pH值培養(yǎng)基的配制
用HCl和NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)肉湯的pH值分別為2.5,3.5,4.5,5.5,6.5,8.5,7.4 (對(duì)照)；調(diào)節(jié)MRS肉湯的pH值分別為2.5,3.5,4.5,5.5,7.5,8.5,6.2 (對(duì)照);調(diào)節(jié)麥芽汁培養(yǎng)基的pH值分別為2.5、3.5、4.5、6.5、7.5、8.5、5.6 (對(duì)照)。將各pH值培養(yǎng)基分裝到IOOml三角瓶中，每瓶裝50ml，高壓滅菌備用。1.3.2菌液的制備
將斜面上的枯草芽孢桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(pH7.4),37°C培養(yǎng)18 24h,置于4°C冰箱備用；將斜面上的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基(PH6.2)，于37°C培養(yǎng)48h，置于4°C冰箱備用；將斜面上的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母分別接種于麥芽汁培養(yǎng)基(pH5.6)，30°C培養(yǎng)36 48h，置于4°C冰箱備用。1.3.3指示菌菌懸液的制備
將1.3.2中制備的各菌液4000r/min離心IOmin，棄上清液，將菌體沉淀懸浮于滅菌生理鹽水中，再離心洗滌I次，棄上清液，最后制成濃度為3.0 X 108CFU/ml的菌懸液(活菌計(jì)數(shù)采用平板稀釋計(jì)數(shù)法)，備用。1.3.4測定方法
取1.3.3制備的枯草芽孢桿菌菌懸液Iml接種到不同pH值營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37°C靜置培養(yǎng)4h，取樣，采用平板稀釋計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)，以對(duì)照組的活菌數(shù)為對(duì)照計(jì)算存活率。取1.3.3制備的嗜酸乳桿菌菌懸液Iml接種到不同pH值MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37°C靜置培養(yǎng)4h，取樣，計(jì)數(shù)及對(duì)照設(shè)置同上；植物乳桿菌耐酸性試驗(yàn)測定方法同嗜酸乳桿菌耐酸性試驗(yàn)。取1.3.3制備的啤酒酵母菌菌懸液Iml接種到不同pH值的麥芽汁培養(yǎng)基中，于30°C靜置培養(yǎng)48h，取樣，計(jì)數(shù)及對(duì)照設(shè)置同上；產(chǎn)朊假絲酵母耐酸性試驗(yàn)方法同啤酒酵母耐酸性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果:五株菌對(duì)酸均有較好的耐受性。其中啤酒酵母、枯草芽孢桿菌耐酸性最強(qiáng)，在pH3.0的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)4h后，存活率為分別為66.4%,60.4% ;其次為產(chǎn)朊假絲酵母，在PH3.0的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)4h后，存活率為56.6% ;再次為嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌，在pH 3.0的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)4h后，存活率分別為64.3%,54.1%。
1.4耐膽鹽試驗(yàn)
1.4.1不同膽鹽濃度培養(yǎng)基的配制
配制營養(yǎng)肉湯、MRS肉湯、麥芽汁培養(yǎng)基，向上述各種液體培養(yǎng)基中加入牛膽鹽，使其質(zhì)量濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%(ff/V),以不加牛膽鹽為對(duì)照組，將各膽鹽濃度培養(yǎng)基分裝到IOOml三角瓶中，每瓶裝50ml，高壓滅菌備用。1.4.2測定方法
取1.3.3制備的枯草芽孢桿菌菌懸液1ml，接種到不同膽鹽濃度的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37°C靜置培養(yǎng)6h，取樣，采用平板稀釋計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)，以對(duì)照組的活菌數(shù)為對(duì)照計(jì)算存活率。取1.3.3制備的嗜酸乳桿菌菌懸液液Iml接種到不同膽鹽濃度的MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37°C靜置培養(yǎng)6h，計(jì)數(shù)及對(duì)照設(shè)置同上。植物乳桿菌耐膽鹽試驗(yàn)測定方法同嗜酸乳桿菌耐膽鹽試驗(yàn)。取1.3.3制備的啤酒酵母菌菌懸液Iml接種到不同膽鹽濃度的麥芽汁培養(yǎng)基中，于30°C靜置培養(yǎng)6h，計(jì)數(shù)及對(duì)照設(shè)置同上。產(chǎn)朊假絲酵母耐膽鹽試驗(yàn)測定方法同啤酒酵母耐膽鹽試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果:五株菌對(duì)膽鹽均有較好的耐受力。其中枯草芽孢桿菌耐膽鹽性
最強(qiáng)，在牛膽鹽濃度為0.7% (W/V)的 液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)4h后，存活率為86.3% ；植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母在牛膽鹽濃度為0.5% (W/V)的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)6h后，存活率分別為34.3%,29.2% ;嗜酸乳桿菌、啤酒酵母在牛膽鹽濃度為0.3% (W/V)的液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)4h后，存活率分別為33.3%,27.2%。以上1.3耐酸性試驗(yàn)、1.4耐膽鹽試驗(yàn)中枯草芽孢桿菌菌落計(jì)數(shù)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為24h ;嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌菌落計(jì)數(shù)采用MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h ;啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母菌落計(jì)數(shù)采用孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h。1.5病原菌拮抗試驗(yàn)
1.5.1試驗(yàn)菌菌懸液的制備
試驗(yàn)菌枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中于37°C、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中于37°C、啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母在麥芽汁液體培養(yǎng)基中于30°C分別培養(yǎng)2代，4°C保存?zhèn)溆谩?.5.2指示菌菌懸液的制備
將指不菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h。然后，4000rpm離心IOmin ,棄上清液,菌體懸浮于滅菌生理鹽水中，再離心洗漆I次，最后制成濃度為3.0 X 108CFU/mL的菌懸液，備用。1.5.3抑菌性的測定
本試驗(yàn)采用牛津杯定量擴(kuò)散法。在滅菌平皿內(nèi)加入IOmL 2%的滅菌瓊脂，冷凝后放入滅菌的牛津杯，將含菌數(shù)為3.0 X 108CFU/mL的200 L指示菌菌懸液加入到15mL溫度為50°C的指示菌生長培養(yǎng)基中，迅速混合均勻，倒入平皿；冷凝后用無菌鑷子取出牛津杯，加100 L待測試驗(yàn)菌菌懸液于孔內(nèi)，室溫?cái)U(kuò)展3 5h，37°C培養(yǎng)12 15h，測抑菌圈直徑，并設(shè)重復(fù)，取抑菌圈直徑的平均值。
試驗(yàn)結(jié)果:抑菌性試驗(yàn)結(jié)果表明，五株菌對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其中枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母抑菌作用較弱。實(shí)施例2復(fù)合微生態(tài)制劑的制備
2.1菌種的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)
枯草芽胞桿菌:挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌種接種于裝有20ml營養(yǎng)肉湯的三角瓶中，于37°C, 180 r/min振蕩培養(yǎng)24h,得到一級(jí)種子液；再取IOml該一級(jí)種子液接種于裝有200ml營養(yǎng)肉湯的三角瓶中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)36h至活菌含量為108cfu/ml，得到二級(jí)菌種。嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌:分別挑取MRS斜面上生長的嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌并接種于裝有20mlMRS肉湯的三角瓶中，于37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 48h，得到一級(jí)種子液；再取IOml各菌株的一級(jí)種子液分別接種于裝有200ml MRS肉湯的三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24h至活菌含量為108cfu/ml，得到二級(jí)菌種。啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母:分別挑取孟加拉紅培養(yǎng)基斜面上生長的啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母并接種于裝有20 ml麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，于30°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)30h，得到一級(jí)種子液；再取15ml各菌株的一級(jí)種子液分別接種于200 ml麥芽汁培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24h至活菌含量為108cfu/ml，得到二級(jí)菌種。2.2最佳混合發(fā)酵溫度的確定
將2.1制備的二級(jí)菌種，均以體積質(zhì)量比5%的接種量接種于固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基(其成分為:麩皮60g,豆柏25g,玉米粉15g,發(fā)酵前處理過程:將各種固體培養(yǎng)基成分混勻,力口入60 ml水?dāng)嚢杈鶆?，再按上述比例依次加入各種菌的二級(jí)菌種攪勻，分成五份，分別在
32.00C >33.00C >34.0°C >3 4.5°C >35.(TC的條件下發(fā)酵30h，測定發(fā)酵物中各種菌的活菌數(shù)。枯草芽孢桿菌活菌計(jì)數(shù)采用營養(yǎng)瓊脂；嗜酸乳桿菌菌液和植物乳桿菌活菌計(jì)數(shù)采用MRS培養(yǎng)基；啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母活菌計(jì)數(shù)采用孟加拉紅培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果:活菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，在32 35°C時(shí)活菌數(shù)較高，最優(yōu)選地，溫度為34.5°C時(shí)活菌數(shù)最高，達(dá)到1.525X 1010cfu/g,因此為固體混合發(fā)酵的最佳溫度。2.3固體混合發(fā)酵培養(yǎng)和復(fù)合微生態(tài)制劑的保存
取2.1制備的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的二級(jí)菌種分別按照體積質(zhì)量比5%的接種量接種于固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基(其成分為:麩皮60g，豆柏25g，玉米粉15g，發(fā)酵前處理過程:將各種固體培養(yǎng)基成分混勻，加入60 ml水?dāng)嚢杈鶆?，再按上述比例依次加入各種菌的二級(jí)菌種攪勻發(fā)酵，于34.5°C發(fā)酵6h，再按相同的接種量接種2.1中制備的枯草芽孢桿菌二級(jí)菌種，混勻，繼續(xù)發(fā)酵24h，發(fā)酵完畢，取發(fā)酵物裝入真空密封袋，于4°C保存，即得復(fù)合微生態(tài)制劑成品。應(yīng)用實(shí)施例 飼喂試驗(yàn):
挑選120頭體重在16.55^40.1kg，3 4月齡的蒙古羔羊，隨機(jī)分成兩個(gè)組，每組60只，一組為試驗(yàn)組，一組為對(duì)照組；試驗(yàn)組按照每頭40克(濕重)的量將實(shí)施例2 2.3所制復(fù)合微生態(tài)制劑添加到蒙古羔羊基礎(chǔ)日糧中進(jìn)行飼喂，對(duì)照組按照每頭20g的量將微生態(tài)制劑基礎(chǔ)原料(未經(jīng)任何處理的固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基)添加到蒙古羔羊基礎(chǔ)日糧中進(jìn)行飼喂，于每日早晨飼喂一次，各組羊只嚴(yán)格隔離，采用圈養(yǎng)，自由采食和飲水的管理方式；飼養(yǎng)15d后，試驗(yàn)組和對(duì)照組羊只均接種A型和O型口蹄疫滅活苗(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，口蹄疫O型-亞洲I型二價(jià)滅活疫苗，批號(hào)201204001 ; 口蹄疫A型滅活疫苗，批號(hào):201204001);接種后第30天采集羊只血液進(jìn)行吞噬細(xì)胞噬菌試驗(yàn)和口蹄疫抗體效價(jià)測定，飼養(yǎng)期共計(jì)60d。試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)組和對(duì)照組羊只體重平均日增重分別為0.0432kg和
0.0240kg，差異顯著(P〈0.05)，表明本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高羊只的生產(chǎn)性能(產(chǎn)肉力)，促生長效果明顯。吞噬細(xì)胞的噬菌能力試驗(yàn):
將保存于斜面的大腸桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)18h后,用營養(yǎng)肉湯進(jìn)行梯度稀釋，得到103、104、IO5UO6四個(gè)稀釋度的大腸桿菌菌液；于無菌條件下取上述采集的羊只(試驗(yàn)組+對(duì)照組)抗凝血200 μ I分別與上述四個(gè)稀釋度的大腸桿菌菌液各100 μ I進(jìn)行混勻，于37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)3h ;再將300 μ I混合液(200 μ I抗凝血+100 μ I菌液)加至普通瓊脂平板上，用滅菌涂布棒推勻，于37°C培養(yǎng)18 24h，取同一稀釋度的菌落數(shù)在3(Γ300之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；吞噬細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的噬菌試驗(yàn)方法同上。試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)統(tǒng)計(jì)，加入試驗(yàn)組羊只全血后大腸桿菌、金黃色葡萄球菌平均菌落數(shù)(68CFU/平板、43 CFU/平板)顯著低于加入對(duì)照組羊只全血后的大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌平均菌落數(shù)(91 CFU/平板、64 CFU/平板)(Ρ〈0.05)，表明本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑可提高羊只體內(nèi)吞噬細(xì)胞的噬菌殺菌功能，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能?？谔阋呖贵w效價(jià)測定試驗(yàn):
取上述采集的羊只(試驗(yàn)組+對(duì)照組)血液的血清，用A型和O型口蹄疫液相阻斷ELISA檢測試劑盒(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所產(chǎn)品，批號(hào)分別為2012052301和2012051901)測定口蹄疫抗體效價(jià)，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)檢測，試驗(yàn)組口蹄疫抗體效價(jià)在免疫后第30日為:A型1:492，O型1:523，對(duì)照組口蹄疫抗體效價(jià)在免疫后第30日為:Α型1:322，0型1:424，試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(Ρ〈0.05)，表明本發(fā)明復(fù)合微生態(tài)制劑能顯著提高羊只血液中的抗體水平，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫功能。以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例?？梢岳斫猓绢I(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，均應(yīng)認(rèn)為包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于制備方法如下:將枯草芽胞桿菌CGMCC1.257、嗜酸乳桿菌LB-1、植物乳桿菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180分別經(jīng)液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)后得到二級(jí)菌種，再取所述嗜酸乳桿菌LB-1、植物乳桿菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180的二級(jí)菌種分別按體積質(zhì)量比5%的接種量接種至固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻，于32 35°C發(fā)酵6h，然后按相同的接種量接種所述枯草芽胞桿菌CGMCC1.257的二級(jí)菌種，混勻，繼續(xù)發(fā)酵42h，取發(fā)酵物于4 8°C真空密封保存，即得復(fù)合微生態(tài)制劑成品；所述固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基所含成分按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)為:麩皮60%，豆柏25%，玉米粉15%;所述復(fù)合微生態(tài)制劑的活菌含量分別為:枯草芽胞桿菌CGMCC1.257和植物乳桿菌WZ47-1不低于108cfu/g，嗜酸乳桿菌LB-1不低于107cfu/g、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180不低于IO6Cfu/g°
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于所述枯草芽胞桿菌CGMCC1.257的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)方法如下:挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌種接種于2(T30ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于34 37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 24h，得到一級(jí)種子液；再取l(T25ml該一級(jí)種子液接種于20(T250ml營養(yǎng)肉湯培基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 24h，得到二級(jí)菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于所述嗜酸乳桿菌LB-1和植物乳桿菌WZ47-1的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)方法如下:分別挑取MRS斜面上生長的嗜酸乳桿菌LB-1和植物乳桿菌WZ47-1并接種于2(T30mlMRS肉湯培養(yǎng)基，于34 37°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 48h,得到一級(jí)種子液；再取l(T25ml各菌株的一級(jí)種子液分別接種于20(T250mlMRS肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 48h，得到二級(jí)菌種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于所述啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180的液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)方法如下:分別挑取孟加拉紅培養(yǎng)基斜面上生長的啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180并接種于2(T30ml麥芽汁培養(yǎng)基，于28 36°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 30h，得到一級(jí)種子液；再取15 30ml各菌株的一級(jí)種子液分別接種于20(T250ml麥芽汁培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 36h，得到二級(jí)菌種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于:所述二級(jí)菌種的活菌含量均為IO8 cfu/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，其特征在于:所述固體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為34 35°C。
7.權(quán)利要求1飛任一項(xiàng)所述反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑在提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力上的應(yīng)用，其征在于:將所述復(fù)合微生態(tài)制劑作為飼料添加劑按照每頭4(T45g的量添加到反芻動(dòng)物基礎(chǔ)日糧中進(jìn)行飼喂。
全文摘要
本發(fā)明公開一種反芻動(dòng)物復(fù)合微生態(tài)制劑，制備方法為將枯草芽胞桿菌CGMCC1.257、嗜酸乳桿菌LB-1、植物乳桿菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和產(chǎn)朊假絲酵母CGMCC2.1180經(jīng)液體一級(jí)種子培養(yǎng)和液體二級(jí)培養(yǎng)后，取嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、啤酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母的二級(jí)菌種按體積質(zhì)量比5%的接種量接種至固體混合發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮60wt%，豆粕25wt%，玉米粉15wt%)，于32~35℃發(fā)酵6h，再接種枯草芽胞桿菌的二級(jí)菌種，混勻，繼續(xù)發(fā)酵42h，即得成品。本發(fā)明所含菌株耐酸耐膽堿性強(qiáng)、相互之間無拮抗性、安全性好，制備工藝簡單，成品活菌含量高，可顯著提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和免疫力。
文檔編號(hào)A23K1/18GK103082156SQ20131005714
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者郝永清, 劉志偉, 徐春光, 張愛榮, 陳曉杰, 范麗霞, 張萍慧, 王美秀 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)