專利名稱：高鹽篩選耐鹽堿月季植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高鹽篩選耐鹽堿月季植株的方法，具體為利用高鹽篩選耐鹽堿月季的方法得到在青藏高原種植成活的月季。
背景技術(shù)：
月季(Rosachinensis)屬薔薇科，為常綠或落葉灌木，被譽為花中皇后，又稱“月月紅”，自然花期從5至11月。天津素有“月季之鄉(xiāng)”之稱，月季栽培歷史悠久，1984年天津?qū)⒃录径槭谢ㄒ院?，月季生產(chǎn)和栽培有了很大的發(fā)展，遍及市內(nèi)街頭綠地，意寓著“和平、友誼、繁榮、發(fā)展”。而位于青藏高原海拔2900米之高的格爾木市不生長鮮花，不僅這兒的人們生活中沒有鮮花，就連盛大的慶典會議上，也沒有鮮花，一排排裝飾假花隨風(fēng)飄倒，嚴重地影響了莊嚴場面，這是由于日照時間長，輻射強度大，高寒缺氧，少雨多風(fēng)，晝夜 溫差大，花卉生長極為困難。位于青藏高原的格爾木市地區(qū)地理位置非常重要，她是通往西藏的最后一站，是西藏物資儲備的重地，也是全國最大的市，面積為139535.85平方公里，比浙江省還大，格爾木又稱為鹽湖城，跨含巍嵩神秘的昆侖山。格爾木市因高寒缺氧，少雨多風(fēng)，晝夜溫差大，日照時間長，輻射強度大，沒有鮮花。雖然天津地處渤海之濱，土壤也有一定的鹽堿化，但是格爾木地區(qū)的土壤鹽堿度更大，不適宜月季生長。要打破鮮花的生長界限，必須從基因改良、個體基因型篩選入手，因為，鹽堿地中植物不能很好生長的原因是植物無法吸收足夠的水分來完成生長過程。植物具有的耐鹽堿基因，會使植物細胞在一定的逆境脅迫范圍內(nèi)，主動積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸來增強細胞的滲透壓，阻止細胞失水，保證植物正常的生長和發(fā)育。但是只有極少數(shù)耐鹽基因型個體才能產(chǎn)生有較強親水性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在組織代謝中使植物細胞免受傷害或減輕傷害。耐鹽堿生理反應(yīng)過程需要多個基因、多個代謝途徑共同起作用，即便是同一品種的植物，因個體的發(fā)育過程、生長環(huán)境以及細微的基因型差異，都會導(dǎo)致植物對長日照、鹽堿地和高原現(xiàn)有的地質(zhì)、氣候、環(huán)境條件不同的反應(yīng)。利用細胞工程方法，應(yīng)激細胞中一系列抗逆代謝途徑，激發(fā)相關(guān)基因的生物功能，使有能力的基因型產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增強細胞的滲透壓，阻止細胞失水，形成耐鹽堿功能，這需要做大量的耐鹽堿篩選實驗，才能將較高抗逆性的月季基因型選擇出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高鹽篩選耐鹽堿月季植株的方法，具體為利用高鹽篩選耐鹽堿月季的方法，利用高鹽培養(yǎng)基誘導(dǎo)月季自身的抗逆基因表達，不需經(jīng)過基因工程和植物的組織培養(yǎng)，可在較短時間內(nèi)獲得耐鹽堿的植株，從而獲得在青藏高原種植成活的月季植株，使格爾木地區(qū)生長出月季，對格爾木鮮花生產(chǎn)和鹽堿地的綠化有很重要的理論和實踐意義，并適用于其它鹽堿度大的地區(qū)月季的大量擴繁。本發(fā)明打破了鮮花的生長界限，從基因改良、個體基因型篩選入手，獲得5種耐鹽堿月季。
本發(fā)明提供的高鹽篩選耐鹽堿月季植株的方法包括的步驟
O月季外植體栽培基質(zhì)的配制
蛭石、珍珠巖和營養(yǎng)土以5-10:2:1的質(zhì)量比例配制基質(zhì)，并在基質(zhì)上層壓O. 5-1厘米的河沙，用0.2-0.5%高錳酸鉀消毒后，再用0.1- 0.3%的生根液對基質(zhì)進行噴灑。蛭石和珍珠巖主要是起透氣，保濕性強的作用，給植物提供一個良好的生長條件；壓上河沙主要是固定作用(圖1)。2)月季外植體的制備
選取維管束較粗的木質(zhì)纖維化月季枝條，剪成8-15cm的莖段，每個莖段留2-3片葉子。將月季莖段的形態(tài)學(xué)下端浸入1-3%的生根液中浸泡0.5-1小時，扦插入配制的基質(zhì)中，并用稀釋10倍的培養(yǎng)基A進行澆灌(培養(yǎng)基A為MS + O. 4mg/L 6-BA + 0.8 mg/L NAA)。培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx。3)月季芽組織的誘導(dǎo)和高鹽篩選
扦插兩周后，月季外植體開始有新的芽長出，依次用含NaCl的芽組織誘導(dǎo)與生根培養(yǎng)基B (培養(yǎng)基B為MS + lmg/L 6-BA + NaCl)進行篩選
第一 二周，NaCl濃度為6.0%。，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lxo第三 四周，NaCl濃度為7.0%。，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx。第五 六周，NaCl濃度為8.0%。，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx。4)篩選后成活月季的移栽
將成活的月季植株(選取能正常生長的植株)種植于鹽堿花盆，正常管理，成活后移栽到鹽堿地，鹽堿地pH值8. 7-9. O ;總鹽量為O. 5% -O. 85%;培養(yǎng)基C用水稀釋100倍后進行澆灌(培養(yǎng)基C為MS+0. 4mg/L6-BA+0. 8 mg/L NAA+lmg/L IBA),實施正常的粗放型管理。5)抗性分子的檢測
繪制脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程y=27. 015x +1. 7929，R2=O. 9936。分別取篩選的耐鹽堿月季和防堿槽中種植的月季，每種月季取五棵植株，每棵植株取葉片各O. 5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取IOmin (提取過程中要經(jīng)常搖動)，冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。吸取之前的提取液2. 5ml，加冰乙酸2. 5ml，2. 5%酸性茚三酮溶液4ml，置100°C水浴lh，冷卻后加4ml甲苯混勻，靜置12-16小時。第二天，用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度(A)值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計算樣品中脯氨酸含量
脯氨酸含量(μ g M-1Fw) =[ X X提取液總量(ml) ]/[樣品鮮重(g) X測定時提取液用量(ml)]
公式中X —從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量(μ g)
通常情況下植物體內(nèi)游離脯氨酸含量很低，在逆境條件下脯氨酸含量可猛增十?dāng)?shù)倍至數(shù)十倍，因此植物體內(nèi)脯氨酸含量已成為抗逆性的一項生化指標(biāo)。在鹽脅迫下，抗逆月季植株中的游離脯氨酸含量會明顯升高。6)運輸、栽培與移栽
將批量耐鹽堿月季苗(將篩選得到的耐鹽堿月季苗組織培養(yǎng)擴繁1000株)按正常條件保溫、保濕、避光包裝好，直接運輸格爾木市區(qū)室內(nèi)大棚栽培，將成活月季移栽到室外，正常管理，成活率高達85%。本發(fā)明提供了一種利用高鹽篩選耐鹽堿月季的方法及其產(chǎn)生的在青藏高原種植成活的月季。利用高鹽培養(yǎng)基誘導(dǎo)月季自身的抗逆基因表達，不需經(jīng)過基因工程和植物的組織培養(yǎng)，可在較短時間內(nèi)獲得耐鹽堿的植株，本發(fā)明打破了鮮花的生長界限，從基因改良、個體基因型篩選入手，獲得5種耐鹽堿月季，填補了格爾木沒有鮮花的空白。從而獲得在青藏高原種植成活的月季植株，使格爾木地區(qū)生長出月季，對格爾木鮮花生產(chǎn)和鹽堿地的綠化有很重要的理論和實踐意義，并適用于其它鹽堿度大的地區(qū)月季的大量擴繁。


圖1為獲得的月季外植體。圖2為月季的芽誘導(dǎo)與鹽堿篩選a為有NaCl篩選，b為無NaCl篩選。圖3為篩選的月季種植于鹽堿花盆。圖4耐鹽堿苗到達格爾木進行大棚試種并成功。圖5格爾木高原首次生長的耐鹽堿月季鮮花植株。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。材料與方法
(O月季材料來自天津大學(xué)遺傳工程研究所實驗基地。(2)實驗器材營養(yǎng)缽，紫外分光光度計，廣口瓶。(3)基質(zhì)試劑材料蛭石，珍珠巖，河沙，高錳酸鉀，MS基本培養(yǎng)基，氯化鈉，蔗糖，6-BA (6 -芐氨基嘌呤)，NAA (萘乙酸)，IBA (吲哚乙酸)。生根粉為陜西普思頓農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)的碧能系列生根粉，30g裝。(4)利用細胞工程方法，通過鹽堿刺激應(yīng)激細胞中一系列抗逆代謝途徑，激發(fā)相關(guān)基因的生物功能，將較高抗逆性的月季基因型選擇出來。
實施例以大花月季為材料，經(jīng)高鹽篩選出適于在鹽堿地正常生長的月季，篩選過程如下
(O月季外植體栽培基質(zhì)的配制
蛭石、珍珠巖和營養(yǎng)土以10 2 1的質(zhì)量比例配制基質(zhì)，并在基質(zhì)上層壓I厘米的河沙，用O. 5%的高錳酸鉀水溶液消毒后，再用O. 3%的生根液對基質(zhì)進行噴灑。蛭石和珍珠巖主要是起透氣，保濕性強的作用，給植物提供一個良好的生長條件；壓上約I厘米的河沙，主要是固定作用。(2)月季外植體的制備
選取維管束較粗的木質(zhì)纖維化枝條，剪成IOcm左右的莖段，每個莖段留2-3片葉子。將月季莖段的形態(tài)學(xué)下端浸入3%的生根液中浸泡I小時，扦插入配制的基質(zhì)中，并用稀釋10倍的液體培養(yǎng)基A進行澆灌(液體培養(yǎng)基A為MS+ O. 4mg/L 6-BA+ 0.8 mg/L NAA)。培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2 000 4 OOOLx00
(3)月季芽組織的誘導(dǎo)和高鹽篩選
扦插兩周后，月季外植體開始有新的芽長出，此時用稀釋5-10倍的芽組織誘導(dǎo)與生根培養(yǎng)基B (培養(yǎng)基B為MS + I mg/L 6- BA+NaCl)進行篩選，篩選條件
第一 二周，NaCl濃度為6. 0%。，，成活率13. 5% ;培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度 2 000 4 OOOLx ；
第三 四周，NaCl濃度為7. 0%。，成活率9. 2% ;培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度 2 000 4 OOOLx ；
第五 六周，NaCl濃度為8. 0%。，成活率2. 8%，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度 2 000 4 OOOLx ；
(4)篩選后成活月季的移栽
將成活的植株移栽到鹽堿地，pH值8. 7-9. O,總鹽量為7. 5%o -8. 5%。；培養(yǎng)基C用水稀釋100倍后進行澆灌(培養(yǎng)基C為MS+0. 4mg/L6-BA+0. 8 mg/L NAA+lmg/L IBA)，實施正常的
粗放型管理。(5)抗性分子的檢測
繪制脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程y=27. 015x +1. 7929，R2=O. 9936分別取篩選的耐鹽堿月季和防堿槽中種植的月季，每種月季取五棵植株，每棵植株取葉片各O. 5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取IOmin (提取過程中要經(jīng)常搖動)，冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。吸取脯氨酸提取液2. 5ml，加冰乙酸2. 5ml, 2. 5%酸性茚三酮溶液4ml，置100°C水浴lh，冷卻后加4ml甲苯混勻，靜置過夜。第二天，用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度(A)值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計算樣品中脯氨酸含量
脯氨酸含量(μ g · g —1Fw) =[ X X提取液總量(ml)]/ [樣品鮮重(g) X測定時提取液用量(ml)]
公式中X —從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量(μ g)。表I抗逆月季葉組織游離脯氨酸含量的測定結(jié)果
—I耐鹽堿月季I防堿槽種植月季—
OD5200.8790.095
Pro(ug/g fw) 丨55.8509 |ll. 5716
上表表明，在鹽脅迫下，抗逆月季整株中的游離脯氨酸含量升高5倍。證明了在通常情況下植物體內(nèi)游離脯氨酸含量很低，但在逆境條件下脯氨酸含量可猛增數(shù)十倍至百倍，因此植物體內(nèi)脯氨酸含量已成為抗逆性的一項生化指標(biāo)。(6)運輸與栽培
將批量耐鹽堿月季苗(組織培養(yǎng)耐鹽堿苗)按正常條件保溫、保濕、避光包裝好，直接運輸青藏高原格爾木市地區(qū)室內(nèi)大棚栽培，將成活月季移栽到室外，正常管理，成活率高達85%。耐鹽堿苗遠途運輸是成敗的關(guān)鍵，需要保溫、保濕、根不能干燥見光并保證植物的新陳代謝最基本條件，攜帶著1000株細胞工程耐鹽堿苗，經(jīng)北京乘坐火車成功抵達格爾木,耐鹽堿苗到達格爾木進行試種并成功，圖4為耐鹽堿苗到達格爾木進行大棚試種并成功，格爾木高原首次生長了鮮花，圖5為格爾木高原首次生長的耐鹽堿月季鮮花植株。使天津月季登上了青藏高原，填補了格爾木沒有鮮花的空白。
按照本發(fā)明的方法獲得5種耐鹽堿月季，在青藏高原種植成活
第(I)種
形態(tài)特征粉色傘房花序，花瓣較多，花心色較淡，花期4月下旬至10月，果實成熟期9-11月。因環(huán)境常綠或半常綠直立灌木，第一年可高達O. 5-1米，第二年可高達1. 5- 2米。園林用途月季花色艷麗，按月開放，花期較長，可配植于庭園、花壇中，也可制作花籃、花環(huán)、盆景及用作切花等。第(2)種
形態(tài)特征紅色單生或傘房花序，花瓣較多，花期4月下旬至10月，果實成熟期9-11月。因環(huán)境常綠或半常綠直立灌木，第一年可高達O. 5-1米，第二年可高達1. 5- 2米。園林用途月季花色艷麗，按月開放，花期較長，可配植于庭園、花壇中，也可制作花籃、花環(huán)、盆景及用作切花等。第(3)種
形態(tài)特征紅色單生花序，花瓣多，花期4月下旬至10月，果實成熟期9-11月。因環(huán)境常綠或半常綠直立灌木，第一年可高達O. 5-1米，第二年可高達1. 5- 2米。園林用途月季花色艷麗，按月開放，花期較長，可配植于庭園、花壇中，也可制作花籃、花環(huán)、盆景及用作切花等。第(4)種
形態(tài)特征粉色單生花序，花瓣多，花期4月下旬至10月，果實成熟期9-11月。因環(huán)境常綠或半常綠直立灌木，第一年可高達O. 5-1米，第二年可高達1. 5- 2米。園林用途月季花色艷麗，按月開放，花期較長，可配植于庭園、花壇中，也可制作花籃、花環(huán)、盆景及用作切花等。第(5)種
形態(tài)特征水粉-紅色-淺紫色傘房花序，花瓣較多，花心色較淡，花期4月下旬至10月，果實成熟期擴11月。因環(huán)境常綠或半常綠直立灌木，第一年可高達O. 5-1米，第二年可高達1. 5- 2米。園林用途月季花色艷麗，按月開放，花期較長，可配植于庭園、花壇中，也可制作花籃、花環(huán)、盆景及用作切花等。本發(fā)明提供了一種利用高鹽篩選耐鹽堿月季的方法及其產(chǎn)生的在青藏高原種植成活的月季，不需經(jīng)過基因工程和植物的組織培養(yǎng)，可在較短時間內(nèi)獲得耐鹽堿的植株， 用于耐鹽堿月季的大量擴繁，對格爾木鮮花生產(chǎn)和鹽堿地的綠化有很重要的理論和實踐意義。
權(quán)利要求
1.高鹽篩選耐鹽堿月季植株的方法，其特征在于它包括的步驟 1)月季外植體栽培基質(zhì)的配制 蛭石、珍珠巖和營養(yǎng)土以5-10 2 1的質(zhì)量比例配制基質(zhì)，并在基質(zhì)上層壓0. 5-1厘米的河沙，用0. 2- 0. 5%高錳酸鉀消毒后，再用0.1- 0. 3%的生根液對基質(zhì)進行噴灑； 2)月季外植體的制備 選取維管束較粗的木質(zhì)纖維化月季枝條，剪成8-15cm的莖段，每個莖段留2-3片葉子，將月季莖段的形態(tài)學(xué)下端浸入1-3%的生根液中浸泡0. 5-1小時，扦插入配制的基質(zhì)中，并用稀釋10倍的液體培養(yǎng)基A進行澆灌，培養(yǎng)兩周； 3)月季芽組織的誘導(dǎo)和高鹽篩選 扦插兩周后，月季外植體開始有新的芽長出，依次用含不同濃度NaCl的芽組織誘導(dǎo)與生根培養(yǎng)基B進行篩選； 第一 二周，NaCl濃度為6.0%。，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx ； 第三 四周，NaCl濃度為7.0%。，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx ； 第五 六周，NaCl濃度為8.0%。，培養(yǎng)溫度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx ； 4)篩選后成活月季的移栽 選取正常生長的月季植株種植于鹽堿花盆，正常管理，成活后移栽到鹽堿地，鹽堿地PH值8. 7-9. 0 ;總鹽量為0. 5% -0. 85%，并澆灌稀釋100倍的培養(yǎng)基C，實施正常的管理； 5)按通用的脯氨酸含量的檢測方法，對耐鹽堿月季的抗性分子的檢測 繪制脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程y=27. 015x +1. 7929，R2=O. 9936 ； 從篩選的耐鹽堿月季中提取得到脯氨酸的提取液，測定其中的脯氨酸的含量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計算樣品中脯氨酸含量 脯氨酸含量(U g g —1Fw) =[ X X提取液總量(ml)]/ [樣品鮮重(g) X測定時提取液用量(ml)] 公式中X —從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量(Ug); 6)運輸、栽培與移栽 將批量耐鹽堿月季苗按正常條件保溫、保濕、避光包裝好，直接運輸格爾木室內(nèi)大棚栽培，將成活月季移栽到室外，正常管理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基A的配方為MS+0. 4mg/L 6-BA+ 0. 8 mg/L NAA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述的培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度18 26。。，光照 12h/d，光照度 2000 4000Lx。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基B的配方為MS+1mg/L6-BA+NaCl。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基C的配方為MS+0. 4mg/L6-BA+O. 8 mg/L NAA+lmg/L IBA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高鹽篩選耐鹽堿月季植株的方法，具體為利用高鹽篩選耐鹽堿月季的方法得到在青藏高原種植成活的月季。步驟包括將獲得的月季外植體適用的月季外植體栽培基質(zhì)，誘導(dǎo)出芽組織后用高鹽的培養(yǎng)基進行澆灌篩選，得到耐鹽堿的月季。維管束較粗的纖維化枝條切成的10厘米的莖段，栽培基質(zhì)為蛭石、珍珠巖和營養(yǎng)土以1021的比例，用0.5%高錳酸鉀消毒，再用0.3%的生根液對基質(zhì)進行噴灑；高鹽篩選指用含不同濃度的氯化鈉液體培養(yǎng)基B稀釋液澆灌，選取能正常生長的植株。本發(fā)明打破了鮮花的生長界限，從基因改良、個體基因型篩選入手，獲得5種耐鹽堿月季，填補了格爾木沒有鮮花的空白。
文檔編號A01G1/00GK103004610SQ201310008730
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者王昱蓉, 季靜 申請人:王昱蓉, 季靜