在植物中木質(zhì)化的降低的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了含有編碼羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的序列的多核苷酸的表達(dá)盒，其與異源啟動(dòng)子可操作地連接。也提供了工程改造有降低木質(zhì)化的植物，以及來自如此工程改造的植物的細(xì)胞、植物部分和植物組織的方法。
【專利說明】在植物中木質(zhì)化的降低
[0001]相關(guān)申請的交叉參考
[0002]本申請要求2013年7月13日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/507，484的優(yōu)先權(quán)，其通過引用納入本文。
[0003]聯(lián)邦資助的研究與開發(fā)下作出發(fā)明的權(quán)利聲明
[0004]本發(fā)明是在美國能源部授予的合同號DE-AC02-05CH11231下由政府資助完成。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005]發(fā)明背景
[0006]在各種農(nóng)業(yè)-工業(yè)活動(dòng)中使用木質(zhì)纖維素植物生物質(zhì)作為可再生原料。木質(zhì)素是在生物質(zhì)內(nèi)包殼的芳族和疏水性的支鏈聚合物，其在工業(yè)加工中負(fù)面影響多糖的提取和水解。工程改造木質(zhì)素的單體組分提供了減少其頑固性的吸引人的潛力。本發(fā)明提供了在擬南芥(Arabidopsis)中開發(fā)的用于過量產(chǎn)生稀少木質(zhì)素單體的新策略，該單體以聚合物中的端基納入并且減少了木質(zhì)素鏈延伸。通過在擬南芥花序梗的木質(zhì)化組織中表達(dá)細(xì)菌羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)來實(shí)現(xiàn)這些“木質(zhì)化終止劑’ ’的生物合成。HCHL切割羥基肉桂?；?輔酶A木質(zhì)素前體的丙素(propanoid)側(cè)鏈以產(chǎn)生相應(yīng)的羥基苯甲醛。與野生型植物相比，來自表達(dá)HCHL的植物的莖積累較高量的羥基苯甲醛和羥基苯甲酸衍生物。這些C6C1酚類的部分是從植物組織中醇-可提取的并且在溫和的堿水解時(shí)從不含提取物的細(xì)胞壁中釋放。與野生型植物相比，具有中等HCHL活性水平的工程改造的植物沒有顯示出總木質(zhì)素、糖含量和生物質(zhì)產(chǎn)率的減少。然而，通過2D-NMR表征的細(xì)胞壁揭示了在芳香區(qū)中新 的分子的存在并且對從這些植物中分離的木質(zhì)素的分析揭示了增加的C6C1酚類端基的量和降低的分子質(zhì)量分布。另外，這些工程改造的種系顯示出預(yù)處理的細(xì)胞壁生物質(zhì)的糖化改善。在木質(zhì)素中強(qiáng)化的C6C1酚類端基的引入代表了改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)和降低細(xì)胞壁對于酶促水解的頑固性的希望的策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括編碼羥基肉桂酰基-輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)和異源啟動(dòng)子的多核苷酸序列的分離的表達(dá)盒，并且該啟動(dòng)子與該多核苷酸序列可操作地連接。在一些實(shí)施方式中，HCHL是突光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens) HCHL,其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子，如PIRX5，其在SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列中。
[0008]在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于工程改造具有降低的木質(zhì)化的植物的方法。所述方法包括以下步驟:(I)將本文所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入植物；以及(2)在表達(dá)HCHL的條件下培養(yǎng)該植物，從而減少該植物中的木質(zhì)化。在一些實(shí)施方式中，植物選自擬南芥、楊樹、桉樹、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘鹿、松樹、苜猜、小麥、大豆、大麥、草皮草、煙草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳樹和短柄草。
[0009]在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過本文所述方法工程改造的植物，來自這樣的植物的植物細(xì)胞，來自這樣的植物的種子、花、葉或果實(shí)，含有本文所述的表達(dá)盒的植物細(xì)胞，以及包括來自本文所述的植物或植物的部分的植物組織的生物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了包括與啟動(dòng)子可操作地連接的異源羥基肉桂酰基-輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的工程改造的植物。在一些實(shí)施方式中，編碼異源HCHL的多核苷酸被整合進(jìn)入植物基因組中。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子對于植物是異源的。在一些實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是內(nèi)源性啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子，如IRX5啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，HCHL是突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens) HCHL。植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。在一些實(shí)施方式中，植物選自擬南芥、楊樹、桉樹、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松樹、苜蓿、小麥、大豆、大麥、草皮草、煙草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳樹和短柄草。
[0010]在其它方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的工程改造的植物、植物的部分或包括來自植物的材料的植物生物質(zhì)的方法。在一些實(shí)施方式中，與未經(jīng)過改性以表達(dá)HCHL的野生型植物相比，在糖化反應(yīng)，例如酶促糖化中使用植物材料以增加的效率水平產(chǎn)生可溶的糖。在一些實(shí)施方式中，與野生型植物相比，使用該植物、植物的部分或植物生物質(zhì)材料來增加生物質(zhì)產(chǎn)率或?qū)τ谀静墓I(yè)(如造紙、制漿和建筑)簡化下游的加工。在一些實(shí)施方式中，使用該植物、植物部分或植物生物質(zhì)材料來提高用于建筑目的的木材的品質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，能夠在燃燒反應(yīng)、氣化、熱解、或多糖水解(酶促或化學(xué))中使用該植物、植物部分或植物生物質(zhì)材料。在一些實(shí)施方式中，與野生型植物相比，該植物、植物部分或植物生物質(zhì)材料被用作更易于消化的飼料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1.HCHL-介導(dǎo)的羥基肉桂?；?輔酶A轉(zhuǎn)化為羥基苯甲醛。HCHL進(jìn)行羥基肉桂?；?輔酶A (R = H，香豆酰-輔酶A ;R = OH,咖啡酰-輔酶A ;R = OCH3,阿魏酰-輔酶A)的水合和切割通過相應(yīng)的反應(yīng)中間體4-羥基苯基-β -羥基丙?；?輔酶A產(chǎn)生羥基苯甲醛(R = H，4-羥基苯甲醛；R = 0Η，3，4-二羥基苯甲醛；R = OCH3,4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)和乙酰輔酶A。
[0012]圖2.在IRX5: HCHL品系中HCHL表達(dá)的分析。(A)用分離自Tl代中5個(gè)獨(dú)立的5周齡轉(zhuǎn)化體的次生莖(secondarystem)的mRNA通過RT-PCR檢測HCHL轉(zhuǎn)錄物。使用由純化自野生型(WT)莖的mRNA合成的cDNA作為陰性對照。使用Tub8_特異性引物來評價(jià)每個(gè)樣品的cDNA量。(B)通過使用通用抗體和5 μ g的提取自在T2代中5個(gè)5周齡的IRX5: HCHL轉(zhuǎn)化體的初級莖(primarystem)的總蛋白對AttB2肽(大小約32kDa)標(biāo)記的HCHL的western印跡的檢測。來自野生莖(WT)的蛋白提取物被用作陰性對照。
[0013]圖3.來自5周齡擬南芥植物的莖切片的組織化學(xué)染色。㈧MSule染色。(B)間苯三酚-HCl染色。(C)甲苯胺藍(lán)O染色。i，束間纖維；x，木質(zhì)部。對于㈧和⑶標(biāo)尺表不50 μ m,對于(C)表不20 μ m。注意品系IRX5: HCHL(4)中觀察到的塌縮的木質(zhì)部導(dǎo)管(黃色箭頭)。
[0014]圖4.1RX5: HCHL和野`生型植物的光譜分析。(A)使用FT-拉曼光譜的在來自野生型(WT)和品系IRX5: HCHL(2)的成熟衰老莖的CWR中木質(zhì)素和多糖的含量。數(shù)值代表在1555-169001^1和ΙΟΙΟ-ΙΠδα1的范圍內(nèi)積分強(qiáng)度,其分別用于木質(zhì)素和多糖(纖維素/半纖維素)定量。數(shù)值是3個(gè)生物重復(fù)樣的平均值土SE。⑶從野生型和品系IRX5: HCHL(2)的莖基(basal stem)切片中木質(zhì)部(黑線)和束間纖維(灰線)得到的FT-1R光譜的比較。對于野生型對于轉(zhuǎn)基因的吸收值以及圖對于波數(shù)進(jìn)行斯氏t檢驗(yàn)。在每個(gè)波長上，-2和+2之間的區(qū)域?qū)?yīng)于兩種測試的基因型之間沒有顯著差異(P-值〈0.05)。顯著陽性的t_值表示在野生型中吸收值高于IRX5: HCHL植物。
[0015]圖5.品系IRX5: HCHL植物的2D-HSQC NMR譜分析。來自野生型(WT)莖(A)和來自IRX5: HCHL(FCAl)莖(B)的木質(zhì)素的2D-HSQC NMR譜；差異圖譜(IRX5: HCHL⑵-野生型)顯示在芳香區(qū)(C)中存在新的組分。
[0016]圖6.純化自野生型和品系IRX: HCHL⑵植物的莖的CEL木質(zhì)素的多分散性概況。使用㈧UV-A3qq吸收和⑶UV-Fex25Q/em45Q熒光得到SEC色譜。
[0017]圖7.來自IRX5: HCHL和野生型植物的成熟衰老莖的生物質(zhì)的糖化。用DNS試驗(yàn)測量從IOmg的熱水、稀釋的堿或稀釋的酸預(yù)處理然后72小時(shí)酶促水解后的生物質(zhì)釋放的還原糖的量。數(shù)值是4個(gè)生物重復(fù)樣的平均值土SE。
[0018]圖8.熒光假單胞菌HCHL (SEQ ID NO:1)和其它同源蛋白的氨基酸序列的比對。
[0019]圖9.在擬南芥中IRX5啟動(dòng)子的器官和組織特異性活性。使用含有pIRX5:⑶S表達(dá)盒的品系CS70758來使得IRX5啟動(dòng)子的活性局部化。在37°C下，幼苗(A和B)、玫瑰花結(jié)葉(C和D)、長角果(E和F)、莖生葉(G和H)、花(I和J)以及花序梗(K和L)在GUS試驗(yàn)緩沖液中孵育I小時(shí)和8小時(shí)。在I小時(shí)的孵育后(K)基本在莖木質(zhì)部導(dǎo)管中檢測到Gus活性。對于較長的孵育(8小時(shí))，也在莖(L)的束間纖維、幼苗(A)的維管系統(tǒng)、長角果(F)、玫瑰花結(jié)(D)和莖生葉(H)以及花柱和花藥(J)中觀察到GUS染色。X:木質(zhì)部導(dǎo)管，if:束間纖維。比例尺:2mm(A-B，E-F)，4mm(C-D，G-H)，500ym(1-J)，100ym(K-L)。
[0020]圖10.在不同階段IRX5: HCHL和野生型(WT)植物的生長和發(fā)育。(A) 3周齡玫瑰花結(jié)(B) 5周齡開花階段 。(C) 8周齡衰老階段。
[0021]圖11.HCHL活性后C6C1酚類產(chǎn)生的合成和可能相關(guān)的酶。表示了苯丙素途徑(中間框)和單體木質(zhì)醇途徑(左框)。HCHL將羥基肉桂?；?輔酶A轉(zhuǎn)化為它們相應(yīng)的羥基苯甲醛。代謝數(shù)據(jù)顯示羥基肉桂酸和醇的出現(xiàn)，這表明醛脫氫酶(DH)和還原酶的參與(左框)。Μ)Ρ-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)導(dǎo)致C6-C1酚基葡萄糖偶聯(lián)物的形成。在依次單加氧酶(Monox)和O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性(OMT)之后，丁香醛可能衍生自香草醛和50H-香草醛。星號表示在表達(dá)HCHL的擬南芥的木質(zhì)素中發(fā)現(xiàn)較高含量的化合物。酶的縮寫如下:PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸酯4-羥化酶；4CL，4-香豆酸酯-輔酶A連接酶；CCR，羥基肉桂酰基-輔酶A還原酶；CAD，松柏醇脫氫酶；HCT，對羥基肉桂酰基-輔酶A:奎尼酸莽草酸對羥基肉桂?；?輔酶A轉(zhuǎn)移酶；C3H，對香豆酸酯3-羥化酶；CCoAOMT，咖啡酰-輔酶A O-甲基轉(zhuǎn)移酶；F5H，阿魏酸5-羥化酶(松柏醛5-羥化酶)；C0MT，咖啡酸/5-羥基阿魏酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0022]圖12.表達(dá)pAtIRX5:: HCHL的轉(zhuǎn)基因水稻品系。
[0023]圖13.在工程改造水稻品系中HCHL的表達(dá)分析。使用從水稻植物和HCHL-特異性引物的RNA的RT-PCR的結(jié)果。
[0024]圖14.來自工程改造的 水稻品系的莖中pHBA的檢測。
[0025]發(fā)明詳述
[0026]1.定義[0027]如本文所述，術(shù)語“羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶’’或“HCHL’’是指催化木質(zhì)素前體對-香豆酰-輔酶A、咖啡酰-輔酶A或阿魏酰-輔酶A硫酯的雙鍵的水合的酶，其然后通過反醒醇切割(retro aldol cleavage)反應(yīng)來產(chǎn)生相應(yīng)的C6C1輕基苯甲醛和乙酰輔酶A。在本發(fā)明的含義中的典型HCHL是來自熒光假單胞菌細(xì)菌的HCHL(EC4.2.1.101-反式-阿魏酰-輔酶A水合酶)，其具有圖11中SEQ ID NO:I (GenBank登錄號CAA73502)所示的氨基酸序列，由GenBank登錄號Y13067.1所示的eDNA序列或SEQID NO:2 (由新澤西州皮斯卡塔韋的GenScript公司(GenScript,Piscatway,NJ)合成)所示的密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列編碼。在本申請中，術(shù)語HCHL包括熒光假單胞菌HCHL的多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物，在圖8中提供了其中的一些例子。編碼HCHL的核酸是指基因、前mRNA和mRNA等，包括編碼本文所述的特定序列的多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物。因此，HCHL核酸(I)與編碼SEQ ID NO:1的多核苷酸序列相比(例如，SEQ ID勵(lì):2或￥13067.1中所示的多核苷酸序列)，優(yōu)選在至少約10、15、20、25、50、100、200、500或更多核苷酸的區(qū)域中或在完整多核苷酸的長度中，具有超過約50%的核苷酸序列相同性，55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95(%、96(%、97(%、98(%或99(%或更高核苷酸序列相同性的多核苷酸序列；或⑵與具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽或圖8中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:4_34)中的任意一個(gè)相比，優(yōu)選在至少約25、50、100、200或更多氨基酸的區(qū)域中或在完整多肽的長度中，編碼具有超過約50%的氨基酸序列相同性，55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高氨基酸序列相同性的氨基酸序列。能夠通過本領(lǐng)域已知或在本申請的實(shí)施例部分所述的功能性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證本申請的含義內(nèi)的HCHL的酶促活性，驗(yàn)證其將木質(zhì)素前體對-香豆酰-輔酶A、咖啡酰-輔酶A和阿魏酰-輔酶A硫酯中的任意一個(gè)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的C6C1羥基苯甲醛和乙酰輔酶A的能力。
[0028]當(dāng)在描述表達(dá)基本局限于特定組織的外源性HCHL的植物的內(nèi)容中使用時(shí)，術(shù)語“基本局限的’’是 指與其它細(xì)胞或組織類型相比，在感興趣的特定細(xì)胞或組織類型中產(chǎn)生更大量的酶促活性和改性的單體木質(zhì)醇(monolignol)。在一些實(shí)施方式中，HCHL和改性的單體木質(zhì)醇的存在基本局限于植物細(xì)胞的次生細(xì)胞壁和植物的莖中。
[0029]術(shù)語“多核苷酸’’和“核酸’’可互換使用，指從5'端讀向3'端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。本發(fā)明的核酸一般含有磷酸二酯鍵，雖然在一些情況下，可以使用可能具有另外的主鏈的核酸類似物，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯(參見Eckstein，《寡核苷酸和類似物:實(shí)踐方法》(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach),牛津大學(xué)出版社);帶正電主鏈；非離子型主鏈，和非核糖主鏈。因此，核酸或多核苷酸也可以包括通過聚合酶允許正確通讀的改性的核苷酸?！岸嗪塑账嵝蛄小颉昂怂嵝蛄小▎蝹€(gè)單鏈或雙螺旋中的核酸的正義鏈和反義鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，單鏈的描述也能確定互補(bǔ)鏈的序列；因此本文所述的序列也提供該序列的互補(bǔ)。除非另有說明，具體核酸序列也包括其變體(如，簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。核酸可以是DNA，包括基因組DNA和cDNA，RNA或雜交體，其中所述核酸可以含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及堿基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等。
[0030]在兩種核酸或多肽的內(nèi)容中使用的術(shù)語“基本相同’’是指一條序列與參照序列相比具有至少50%的序列相同性。百分比相同性可以是50%-100%之間的任意整數(shù)。使用本文所述的程序與參照序列比較，一些實(shí)施方式包括至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列相同性；優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST，如下述。例如，HCHL可以具有與熒光假單胞菌HCHL的氨基酸序列 SEQ ID NO:1 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列。
[0031]當(dāng)如下述比對最大對應(yīng)性時(shí)，如果在兩條序列中核苷酸或氨基酸殘基的序列分別是相同的，兩條核酸序列或多肽序列被稱為“相同的’ ’。在兩條或更多條核酸或多肽序列內(nèi)容中的術(shù)語“相同的’’或“相同性’’指就比較窗的最大對應(yīng)性進(jìn)行比較和比對時(shí)，相同或有特定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩條或更多條序列或亞序列，如使用下列序列比較算法之一或通過手工比對和目測測量。序列相同性百分比涉及蛋白和肽使用時(shí)，認(rèn)為不同的殘基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基取代，因此不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列由于保守取代而不同時(shí)，序列相同性百分比可上調(diào)以根據(jù)該取代的保守性質(zhì)校正。進(jìn)行該調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。通常其涉及將保守取代作為部分評分而不是完全錯(cuò)配，從而增加序列相同性百分比。因此例如，相同氨基酸得分為1，非保守取代得分為0，保守取代得分為0-1。保守取代的評分按照，例如Meyers和Miller的算法，Computer Applic.Biol.Sc 1.4:11 -17 (1988)，例如，如在程序PC/GENE (美國加利福尼亞州芒廷維尤的智慧遺傳公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中執(zhí)行的進(jìn)行計(jì)算。
[0032]對于序列比較，一般將一種序列用作與測試序列比較的參照序列。使用序列比較算法時(shí)，測試和參照序列均輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定子序列坐標(biāo)，指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J(rèn)的程序參數(shù)，或者可指定另外的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算出測試序列相對于參照序列的序列相同性百分?jǐn)?shù)。
[0033]本文所用的“比較窗’’包括參`考選自20-600，通常約50-200，更常見約100-150數(shù)量的毗連位置的區(qū)段，對兩個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對后，可將該區(qū)段的序列與相同數(shù)量的毗連位置的參比序列作比較。比對序列的比較方法是本領(lǐng)域熟知的。可進(jìn)行最優(yōu)序列比對以作比較，例如，通過Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981);通過 Needleman 和 Wunsch 的同源性比對算法，J.Mol.Biol.48:443(1970);通過 Pearson 和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA85:2444(1988);通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些算法(遺傳學(xué)計(jì)算組(Genetics Computer Group)的威斯康星遺傳學(xué)軟件包(WisconsinGenetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，575 科學(xué)大道(ScienceDr.)，威斯康星州麥迪遜(Madison，WI))，或通過手工比對和目測。
[0034]適合測定序列相同性百分?jǐn)?shù)和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是BLAST和BLAST2.0算法，分別描述于 Altschul 等(1990) J Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等(1977)NucleicAcids Res.25:3389_3402。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)網(wǎng)站從公共渠道獲得。此算法包括:首先通過鑒定查詢序列中長度為w的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，與數(shù)據(jù)庫序列中長度相同的字比對時(shí)它們能匹配或滿足一些正值的閾值評分Τ。T稱為相鄰字評分閾值(Altschul等，同上)。這些初始相鄰字命中用作啟動(dòng)搜索的種子，以便找到含有它們的較長HSP。然后，沿各個(gè)序列在兩個(gè)方向上延伸該字命中，直到提高累積的比對評分。就核苷酸序列而言，采用參數(shù)M(—對匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)評分；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是〈O)計(jì)算累積評分。就氨基酸序列而言，用評分矩陣計(jì)算累積評分。出現(xiàn)以下情況時(shí)中止字命中在各個(gè)方向上的延伸:累積比對評分比其最大獲得值降低X ;由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評分殘基比對的累積，累積評分變?yōu)榱慊蛄阋韵?；或者達(dá)到任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)w、T和X決定比對的靈敏度和速率。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默認(rèn)值如下:字長(W) 28，期望值(E)10，M= 1，Ν = -2，以及比較兩條鏈。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用默認(rèn)參數(shù)，字長(W) 3、期望值(E) 10、使用BLOSUM62評分矩陣(參見HenikofT和Henikoff (1989)Proc Natl Acad Sci USA89:10915 (1989))。
[0035]BLAST算法也對兩種序列間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如，Karlin和Altschul, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一種相似性測量是最小概率和(P (N))，它表明兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶爾發(fā)生匹配的概率。例如，如果測試核酸與參比核酸的比較中最小概率和小于約0.01，更優(yōu)選小于約10_5，最優(yōu)選小于約10_2°，則認(rèn)為該核酸與參比序列相似。
[0036]與參照序列基本相同的核酸或蛋白序列包括“保守修飾的變體’ ’。對于特定的核酸序列，保守修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼子指定丙氨酸的每個(gè)位置上，可將所述密碼子改變成所述的任何相應(yīng)密碼子而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默變異’’，這是保守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每種核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識，可修飾核酸中的每個(gè)密碼子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，在所述的各序列中隱含了編碼多肽的各核酸沉默變異。
[0037]至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，在編碼序列中改變單個(gè)氨基酸或較少百分?jǐn)?shù)氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列中的單獨(dú)取代是“保守修飾變體’’，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域熟知的。
[0038]以下六組各自含有可互相保守取代的氨基酸:
[0039]I)丙氨酸(A)，絲氨酸⑶，蘇氨酸⑴；
[0040]2)天冬氨酸⑶，谷氨酸(E)；
[0041]3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；
[0042]4)精氨酸(R)，賴氨酸⑷；
[0043]5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V);和
[0044]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
[0045](參見例如，Creighton,Proteins (1984))。
[0046]核苷酸序列基本相同的另一個(gè)標(biāo)志是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，兩個(gè)分子是否互相雜交，或與第三個(gè)核酸雜交。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的，在不同情況下不同。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件選擇為比特定序列在確定離子強(qiáng)度和pH下的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低約5°C。Tm是50%的目標(biāo)序列與完美配合探針雜交時(shí)的溫度(在確定離子強(qiáng)度和PH的條件下)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件是在pH7下鹽濃度為約0.02摩爾/升并且溫度為至少約60°C的條件。例如，雜交，如在印跡技術(shù)中RNA-DNA雜交的嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在55°C下20分鐘或等價(jià)條件下的0.2X SSC中的一次洗滌。
[0047]術(shù)語“啟動(dòng)子’’是指在細(xì)胞中能夠驅(qū)動(dòng)DNA序列轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。因此，在本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體中使用的啟動(dòng)子包括參與調(diào)節(jié)或調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄的周期和/或速率的順式和反式作用的轉(zhuǎn)錄控制元件、翻譯控制元件(5’UTR:未翻譯區(qū)域)和調(diào)節(jié)序列。例如，啟動(dòng)子能夠是包括參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起點(diǎn)、染色體整合序列、5'和3'未翻譯區(qū)域或內(nèi)含子或外顯子區(qū)域的順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件。順式作用序列通常與蛋白或其它生物分子相互作用來進(jìn)行(打開/關(guān)閉、調(diào)節(jié)、調(diào)整等)基因轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄的基因的5'端，并且如本文使用，包括距離翻譯起始密碼子的序列5'端(例如，包括mRNA的5'未翻譯區(qū)域，通常包括50-200bD)。最常見地，核心啟動(dòng)子序列位于距離翻譯起始位點(diǎn)l_3kb以內(nèi)，更經(jīng)常位于Ikbp以內(nèi)并且經(jīng)常位于翻譯起始位點(diǎn)500bp以內(nèi)。按照習(xí)慣，啟動(dòng)子序列以其控制的基因的編碼鏈上的序列提供。
[0048]“組成型啟動(dòng)子’’是能夠在幾乎所有細(xì)胞類型中引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中“細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子’’僅僅在一種或一些特定細(xì)胞類型或細(xì)胞組形成的組織中引發(fā)轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性的。次生細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成并且沉積在植物的一些但不是全部的組織中，如木質(zhì)組織。本文使用的“次生細(xì)胞壁特異性’ ’啟動(dòng)子是指在有次生細(xì)胞壁的細(xì)胞類型，例如木質(zhì)化的組織如導(dǎo)管和纖維中引發(fā)較高水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，這些木質(zhì)化組織可以在樹的木質(zhì)細(xì)胞或樹皮細(xì)胞，以及植物的其它部分如葉梗中發(fā)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，如果在次生細(xì)胞壁中啟動(dòng)子引發(fā)的轉(zhuǎn)錄水平與該啟動(dòng)子在其它組織中引發(fā)的轉(zhuǎn)錄水平相比至少高3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多，導(dǎo)致編碼的蛋白基本局限于有次生細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中，例如植物的莖，則該啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性的。次生細(xì)胞壁啟動(dòng)子的非限制性例子包括引導(dǎo)以下基因表達(dá)的啟動(dòng)子:IRX1> IRX3、IRX5、IRX7、IRX8、IRX9、IRX10、IRX14、NSTl、NST2、NST3、MYB46、MYB58、MYB63、MYB83、MYB85、MYB103、PAL1、PAL2、C3H、CcOAMT,(:0?1、？5!1、^^4、1^(:17、040(3和040(1。參見，例如1\111^1'等，1997 ;Meyer 等，1998 Jones等，2001 ;Franke 等，2002 ;Ha 等，2002 ;Rohde 等，2004 ;Chen 等，2005 ;Stobout 等，2005 ；Brown等，2005 ;Mitsuda 等，2005 ;Zhong 等，2006 ;Mitsuda 等，2007 ;Zhong 等，2007a，2007b ；Zhou等，2009 ;Brown 等，2009 !McCarthy 等，2009 ;Ko 等,2009 ;Wu 等，2010 ;Berthet 等，2011。在一些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子基本與引導(dǎo)IRX5基因表達(dá)的天然啟動(dòng)子序列基本相同(參見，在SEQ ID N0:3中含有例如IRX5的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件)。上述次生細(xì)胞壁啟動(dòng)子序列中的一些能夠在本文提供的SEQ ID NO:36-61多核苷酸序列中找到。來源于一種植物物種的啟動(dòng)子可以在另一種植物物種中用于引導(dǎo)基因表達(dá)。
[0049]如果來源于外 來物種，或者來源于相同物種但是從其原始形式修飾，則多核苷酸對于生物體或次生多核苷酸序列來說是“異源的’ ’。例如，當(dāng)編碼多肽序列的多核苷酸與異源啟動(dòng)子所謂可操作地連接時(shí)，其表示編碼多肽的多核苷酸序列衍生自一個(gè)物種而啟動(dòng)子序列衍生自另一個(gè)不同的物種；或者，如果兩者都衍生自相同物種，則編碼序列并不與啟動(dòng)子天然相關(guān)(例如，是遺傳工程改造的編碼序列，例如，來自相同物種中的不同基因，或來自不同生態(tài)型或變種的等位基因)。
[0050]術(shù)語“可操作地連接’ ’是指兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸(例如，DNA)區(qū)段之間的功能性關(guān)系。通常，其是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列對轉(zhuǎn)錄序列的功能性關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列促進(jìn)或調(diào)整在合適宿主細(xì)胞或其它表達(dá)體系中的DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列可操作地連接到DNA或RNA序列。通常，可操作地連接到轉(zhuǎn)錄序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列在物理上與轉(zhuǎn)錄序列毗連，即它們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，如增強(qiáng)子，不需要物理上毗連或緊鄰它們增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的編碼序列。
[0051]術(shù)語“表達(dá)盒’ ’是指當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，分別導(dǎo)致RNA或多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸構(gòu)建體。沒有或不能被翻譯的反義和正義構(gòu)建體明確地包含在該定義中。在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和內(nèi)源性基因的抑制的情況下(例如，通過反義、RNAi或正義抑制)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到插入的多核苷酸序列不需要是相同的，但可以是僅僅與其衍生的基因的序列基本相同的。如本文解釋，這些基本相同的變體由特定核酸序列的參考特定覆蓋。表達(dá)盒的一個(gè)例子是包括編碼可操作地連接到啟動(dòng)子的HCHL蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸構(gòu)建體，該啟動(dòng)子對于植物細(xì)胞是異源的，表達(dá)盒可被導(dǎo)入該構(gòu)建體。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)盒包括編碼靶向植物基因組中的位置的HCHL蛋白的多核苷酸序列，使得HCHL多核苷酸序列的表達(dá)由在該植物中存在的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
[0052]本文使用的術(shù)語“植物’ ’是指完整植株并且包括各倍體水平的植物，包括包括非整倍體、多倍體、二倍體和單倍體。本文使用的術(shù)語“植物部分’’是指枝條營養(yǎng)器官和/或結(jié)構(gòu)(例如，葉、莖干和塊莖)、枝條、根、花和花器官(例如，苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉囊)、胚珠(包括卵和中央細(xì)胞)、種子(包括合子、胚芽、胚乳和種皮)、果實(shí)(成熟子房)、苗和植物組織(例如，維管組織、基本組織等)以及單個(gè)植物細(xì)胞、一組植物細(xì)胞(例如，培養(yǎng)的植物細(xì)胞)、原生質(zhì)體、植物提取物和種子。本發(fā)明所述方法可用的植物種類通常寬泛到可使用轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和低等植物，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類和多細(xì)胞藻類。
[0053]本文使用的術(shù)語“生物質(zhì)’ ’是指經(jīng)加工得到產(chǎn)物，例如生物燃料如乙醇，或牲畜飼料，或用于造紙和制漿工業(yè)產(chǎn)品的纖維素的植物材料。這樣的植物材料可以包括完整植株、或植物的部分，例如莖、葉、枝條、枝、根和塊莖等。
[0054]術(shù)語“降低的木質(zhì)化’’包括降低的木質(zhì)素聚合物尺寸(例如，較小數(shù)量的單體木質(zhì)醇被加入到聚合物中造成的更短的木質(zhì)素聚合物鏈)以及降低的木質(zhì)素聚合物的支化程度或減少的空間填充(也稱為減少的擴(kuò)張?bào)w積)。通常，當(dāng)與對照植物中的平均木質(zhì)素分子比較時(shí)，可通過檢測到其分子量的減少或單體木質(zhì)醇數(shù)量的減少至少
20%,25%,30%,40%,50%或更多來顯示降低的木質(zhì)素聚合物。在本申請的實(shí)施例部分中詳細(xì)描述了檢測降低的木質(zhì)化的方法。
[0055]本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)的“一個(gè)’ ’、“一種’ ’和“這種’ ’包括復(fù)數(shù)含義，除非文中另有明確說明。因此，例如，在描述“植物細(xì)胞’’時(shí)，也包括多個(gè)這樣的植物細(xì)胞。
[0056]I1.引言
[0057]通過包埋在稱為木質(zhì)素的芳族聚合物中的纖維素微原纖和半纖維素的多糖網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成植物細(xì)胞壁。這個(gè) 分叉的聚合物主要由三種名為對-香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇和芥子醇的苯丙素-衍生的酚類(即單體木質(zhì)醇)組成，其代表對-羥基苯基(H)、愈創(chuàng)木基(guaiacyl) (G)和丁香(S)木質(zhì)素單元(Boerian等,2003)。單體木質(zhì)醇具有由苯環(huán)(C6)和丙烷(C3)側(cè)鏈組成的C6C3碳骨架。由于其賦予植物細(xì)胞壁頑固性，木質(zhì)素對于陸地植物的發(fā)育是重要的。其也提供直立生長的機(jī)械強(qiáng)度、賦予運(yùn)輸水的導(dǎo)管疏水性并且作用為對抗降解細(xì)胞壁的病原體的物理屏障(BOudet，2007)。值得注意的是，木質(zhì)素含量和組成根據(jù)環(huán)境的生物脅迫和非生物脅迫被精細(xì)調(diào)節(jié)(Moura等，2010)。
[0058]經(jīng)濟(jì)上，來自植物細(xì)胞壁的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)廣泛用作在造紙工業(yè)中漿料生產(chǎn)和反芻牲畜飼料的原料。植物原料也代表用于使用工程改造的微生物生產(chǎn)合成分子如藥物以及運(yùn)輸燃料的可發(fā)酵糖的來源(Keasling，2010)。然而，植物中木質(zhì)素含量和漿料產(chǎn)率、飼料消化性或多糖酶促水解之間存在負(fù)相關(guān)(de Vriie等,2002 ;Reddy等,2005 ;Dien等，2006 ；Chen 和 Dixon, 2007 ；Dien 等，2009 ；Taboada 等,2010 ；Elissetche 等，2011 ；Studer等，2011)。因此，在植物原料中降低木質(zhì)素頑固性是感興趣的主要焦點(diǎn)，尤其是在木質(zhì)素纖維素生物燃料領(lǐng)域中，其中多糖向單糖的高效酶促轉(zhuǎn)化對于實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境可持續(xù)生產(chǎn)是很重要的(Carroll 和 Somerville, 2009)。
[0059]在陸地植物之間，木質(zhì)素生物合成是充分表征的和非常保守的(Weng和Chappie，2010)。已經(jīng)采用遺傳修飾如參與該途徑的特定步驟或其調(diào)節(jié)的基因的沉默來降低木質(zhì)素含量(Simmons等,2010 ；Umezawa, 2010),但是這個(gè)方法通常導(dǎo)致不希望的表型，如矮態(tài)、不育、植物生物質(zhì)的下降和增加的對環(huán)境脅迫和病原體的易感性(Bonawitz和Chappie,2010)。這些多效影響一般是次生細(xì)胞壁完整性缺失、毒性中間體積累、防御反應(yīng)的組成型活化或其它對于植物發(fā)育和防御必要的苯丙素-衍生的代謝物消耗的結(jié)果(Li等，2008 ；Naoumkina等,2010,Gallego-Giraldo等,2011)。另外，能夠通過修飾其單體組成來實(shí)現(xiàn)改變木質(zhì)素的頑固結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)。例如，在木質(zhì)素中納入阿魏酸松柏酯改善了細(xì)胞壁多糖的酶促降解(Grabber等,2008)。最近，已經(jīng)證明在5-羥基-G單元中的富集和在木質(zhì)素中S單元的減少產(chǎn)生了增強(qiáng)的糖化效率而沒有大幅影響生物質(zhì)產(chǎn)率和木質(zhì)素含量(Weng等，2010 ；Dien 等，2011 ；Fu 等，2011)。
`[0060]在本研究中，可替代的策略是減少木質(zhì)素頑固性，本發(fā)明人開發(fā)了使用衍生自木質(zhì)素生物合成途徑的前體來增強(qiáng)名為C6C1酚類的非常規(guī)單體木質(zhì)醇的產(chǎn)生的主要方法。與經(jīng)典C6C3單體木質(zhì)醇相比，這些苯酚單元缺少丙烷側(cè)鏈并且因此具有不同的聚合性質(zhì)。通常在一些木質(zhì)素中以痕量發(fā)現(xiàn)這樣的C6C1酚類并且形成所謂的“芐基端基’ ’ (Kim等，2000 ;Ralph 等，2001 ;Kim 等，2003 ；Morreel 等，2004 ;Ralph 等，2008 ;Kim和 Ralph，2010)。本發(fā)明人認(rèn)為在木質(zhì)素中增加的C6C1端基酚類降低其聚合度和天然分支結(jié)構(gòu)。為了這個(gè)目的，來自熒光假單胞菌的羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL，EC4.2.2.101/EC4.1.2.41)在擬南芥的莖中表達(dá)。HCHL是一種催化木質(zhì)素前體對-香豆酰-輔酶A、咖啡酰-輔酶A和阿魏酰-輔酶A硫酯的雙鍵水合，隨后通過反醛醇切割反應(yīng)來產(chǎn)生相應(yīng)的C6C1羥基苯甲醛和乙酰輔酶A的酶(圖1 ;Mitra等，1999)。使用次生細(xì)胞壁纖維素合成酶的啟動(dòng)子(Cesa4/IRX5)來在莖的木質(zhì)化組織(木質(zhì)部和束間纖維)中限制HCHL表達(dá)并且防止在其他參與植物防御和發(fā)育的組織中羥基肉桂?；?輔酶A的消耗(Gou等，2009 ；Luo等，2009 ；Buer等，2010 ；MiIkowski和Strack, 2010)。本文所揭示的數(shù)據(jù)表明由IRX5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HCHL表達(dá)對于一些細(xì)胞系在木質(zhì)素含量、植物發(fā)育和生物質(zhì)產(chǎn)率中沒有顯著變化。也已經(jīng)證明在HCHL轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)素中C6C1酚類積累為端基，其減少了木質(zhì)素的大小并且賦予細(xì)胞壁對于酶促水解的較低頑固性。
[0061]II1.具有降低木質(zhì)化的植物
[0062]A.HCHL酶的表達(dá)的修飾
[0063]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于工程改造具有降低的木質(zhì)化的植物的方法。所述方法包括以下步驟:首先，向植物中導(dǎo)入包括編碼HCHL酶的多核苷酸序列和啟動(dòng)子的表達(dá)盒，其中編碼序列和啟動(dòng)子是操作性地連接安排；然后，在允許功能性HCHL的表達(dá)的條件下培養(yǎng)該植物以產(chǎn)生C6C1酚類，其能夠與其它單體木質(zhì)醇聚合并且由此減少該植物中的木質(zhì)化。
[0064]具體地，本發(fā)明提供了工程改造具有修飾的木質(zhì)素多聚體的植物，其可有減少的大小、分子量和/或改變的(尤其是減少的或較低延伸的)支化，這基本局限于植物的木質(zhì)化組織中。這通過首先向植物中導(dǎo)入上述的表達(dá)盒，但是其尤其具有次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子，并且然后在表達(dá)功能性HCHL酶的條件下培養(yǎng)該植物。該酶將各種羥基肉桂酰基-輔酶A轉(zhuǎn)化為它們相應(yīng)的羥基苯甲醛，其能夠直接被納入或通過與天然單體木質(zhì)醇的聚合在它們納入木質(zhì)素多聚體之前由天然的酶進(jìn)一步修飾(例如，醛基的氧化或還原)。
[0065]當(dāng)被導(dǎo)入植物時(shí)，上述的表達(dá)盒不必改變木質(zhì)素含量。導(dǎo)管保持完整表明木質(zhì)素細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)仍然牢固以防止導(dǎo)管破碎，但是木質(zhì)素組成和性質(zhì)被修飾至減少其頑固性的水平。
[0066]本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解通過本文所述的表達(dá)盒向植物導(dǎo)入的HCHL不必與熒光假單胞菌HCHL相同，熒光假單胞菌HCHL被用于本公開的實(shí)施例部分詳述的實(shí)驗(yàn)中。在一些實(shí)施方式中，通過表達(dá)盒向植物導(dǎo)入的HCHL與熒光假單胞菌HCHL基本相同(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)。例如，與SEQ ID NO:1相比，變體HCHL在其氨基酸殘基中有至少80185190%或95%序列相同性，特別`是8個(gè)高度保守區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)(圖8中所示的8個(gè)框)。
[0067]1.羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)
[0068]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的表達(dá)盒包括編碼產(chǎn)生能夠?qū)е聹p少的木質(zhì)化的修飾的單體木質(zhì)醇的多核苷酸。這樣的酶的例子是有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的熒光假單胞菌HCHL。適于在本發(fā)明中使用的HCHL的另外的例子包括圖8所示的那些。也適用于本發(fā)明的是變體HCHL，其可以天然存在或經(jīng)重組工程改造，得到具有(I)基本與示例性HCHL(例如，SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列和⑵通過各種科學(xué)出版物或本文所述的本領(lǐng)域已知的HCHL酶試驗(yàn)確定的將至少一種木質(zhì)素前體對-香豆酰-輔酶A、咖啡酰-輔酶A或阿魏酰-輔酶A硫酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的C6C1羥基苯甲醛的酶活性的變體。
[0069]能用于實(shí)踐本發(fā)明的天然存在的HCHL的例子包括對羥基肉桂?；?輔酶A水合酶/裂解酶(HCHL)、烯酰輔酶A水合酶/異構(gòu)酶(isomarase) (ECH)、阿魏酰-輔酶A水合酶/裂解酶(FCA，F(xiàn)erA)、以及圖8所命名的那些，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:4_34。
[0070]2.次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子
[0071]在一些實(shí)施方式中，編碼HCHL的多核苷酸可操作地與次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子連接。次生細(xì)胞特異性啟動(dòng)子與編碼HCHL的多核苷酸是異源的，換而言之，啟動(dòng)子和HCHL編碼序列衍生自兩種不同的物種。如果啟動(dòng)子在次生細(xì)胞壁，例如在導(dǎo)管和植物的纖維細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，但在不含次生細(xì)胞壁的細(xì)胞中以低得多的水平表達(dá)或不表達(dá)，該啟動(dòng)子適于用作次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子。
[0072]在一些實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子與編碼次生細(xì)胞壁的纖維素合成酶Cesa4/IRX5的基因的天然啟動(dòng)子基本相同(例如，至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同),多核苷酸序列示于Genebank登錄號 AF458083_1 和 SEQ ID NO:35，啟動(dòng)子 pIRX5 包含于 SEQ ID NO:3。
[0073]在一些實(shí)施方式中，次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子包括SEQ ID NO:3。在一些實(shí)施方式中，次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子包括SEQ ID NO:3的序列或其變體。在一些實(shí)施方式中，次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子包括SEQ ID NO:3的一段序列，該序列包括SEQ ID NO:3的約50-約100或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子包括SEQ IDNO:3 的一段序列，該序列包括 SEQ ID NO:3 的 50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100 ;75_1000、75-900、75-800、75-700、75-600、75-500,75-400,75-300,75-200 ； 100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300 或 100-200 個(gè)連續(xù)核苷酸。
[0074]次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子也在本領(lǐng)域中描述。參見,例如Mitsuda等,2005PlantCell ；Mitsuda 等，2007Plant Cell ；Zhou 等，2009plant cell ；0htani 等，2011PlantJournal。它們包含在本申請?zhí)峁┑亩嗪塑账嵝蛄蠸EQ ID NO:36-61中。
[0075]本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解啟動(dòng)子區(qū)域可以耐受相當(dāng)?shù)淖兓话l(fā)生活性損失。因此，在一些實(shí)施方式中，次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子與SEQ ID NO:3是基本相同的(例如，至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)。可 通過本領(lǐng)域已知或本申請的實(shí)施例部分所述的報(bào)告基因(例如，β -葡糖醛酸糖苷酶或GUS)測定來確定次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子的功效。
[0076]B.重組表達(dá)載體的制備
[0077]當(dāng)?shù)玫絾?dòng)子序列和感興趣基因的編碼序列(例如，熒光假單胞菌HCHL或圖8所示的任意其它HCHL)時(shí)，這些序列能用于制備在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)感興趣基因的表達(dá)盒。通常，植物轉(zhuǎn)化載體包括在5'和3'調(diào)節(jié)序列和選擇性標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄控制下的一條或多條克隆的植物編碼序列(基因組或cDNA)。這樣的轉(zhuǎn)化載體也可含有啟動(dòng)子(例如，本文所述的次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、RNA加工信號(如內(nèi)含子剪接位點(diǎn))、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或聚腺苷酸化信號。
[0078]植物表達(dá)載體可包括RNA加工信號，其可位于編碼序列中、其上游或下游。另外，表達(dá)載體可包括取自植物基因的3'-未翻譯區(qū)域的調(diào)節(jié)序列，例如3'終止子區(qū)以增加mRNA的mRNA穩(wěn)定性，如土豆的P1-1I終止子區(qū)或章魚堿合酶或胭脂氨酸合成酶Y終止子區(qū)。
[0079]植物表達(dá)載體通常也包括選擇性標(biāo)記物基因以使轉(zhuǎn)化體易于選擇。這樣的基因包括編碼抗生素抗性基因(例如，對潮 霉素、卡那霉素、博來霉素、G418、鏈霉素或壯觀霉素的抗性)、除草劑抗性基因(例如，草胺膦乙?；D(zhuǎn)移酶)和編碼陽性選擇酶的基因(例如，甘露糖異構(gòu)酶)。
[0080]一旦已經(jīng)構(gòu)建了包括編碼HCHL并且與啟動(dòng)子(尤其是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子)可操作連接的多核苷酸的的表達(dá)盒，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來將該多核苷酸導(dǎo)入植物來表達(dá)HCHL并且完成減少的木質(zhì)化。參見，例如Ammirato等《植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊-作物品種》(Handbookof Plant Cell Culture—Crop Species),麥克米蘭出版公司(Macmillan Publ.C0.) 1984 ；Shimamoto 等，Nature338:274-276,1989 ；Fromm 等，Bio/Technology8:833-839,1990 ；和Vasil 等，Bio/Technology8:429-434,1990 中所描述的方案。
[0081]植物的轉(zhuǎn)化和再生在本領(lǐng)域中已知，并且由實(shí)踐者確定最合適轉(zhuǎn)化技術(shù)的選擇。合適的方法可包括但不限于:植物原生質(zhì)體電穿孔；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；使用病毒的轉(zhuǎn)化；植物細(xì)胞的微注射；植物細(xì)胞微粒轟擊；真空浸潤；和根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化意味著以引起所述序列穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)的方式將核苷酸序列引入植物中。這些方法在不同植物中的示例包括:美國專利第5，571，706 ;5，677，175 ；5，510，471 ;5，750，386 ;5，597，945 ;5，589，615 ;5，750，871 ;5，268，526 ;5，780，708 ；5，538，880 ;5，773，269 ;5，736，369 和 5，610，042 號。
[0082]轉(zhuǎn)化以后，能采用摻入轉(zhuǎn)化載體的選擇性標(biāo)記物選擇植物。通常，這種標(biāo)記物將賦予轉(zhuǎn)化植物抗生素或除草劑抗或在特定基質(zhì)中生長的能力，并且可通過將所述植物暴露于適當(dāng)濃度的所述抗生素、除草劑或基質(zhì)而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的選擇。
[0083]能按照本領(lǐng)域中任意已知方法得到編碼HCHL的多核苷酸序列以及包括啟動(dòng)子(例如，次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子)的多核苷酸序列。這樣的方法可包括擴(kuò)增反應(yīng)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和其它基于雜交的反應(yīng)或能夠被直接合成。
[0084]C.其中能降低木質(zhì)化的植物
[0085]如本文所述，包括編碼與啟動(dòng)子，特別是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子可操作連接的HCHL的多核苷酸的表達(dá)盒能在多種植物中表達(dá)。該植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該植物`是綠色種植植物。在一些實(shí)施方式中，該植物是裸子植物或松柏類植物。
[0086]在一些實(shí)施方式中，該植物是適于產(chǎn)生生物質(zhì)的植物。合適的植物的例子包括，但不限于擬南芥、楊樹、桉樹、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松樹、苜蓿、小麥、大豆、大麥、草皮草、煙草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳樹、麻風(fēng)樹和短柄草。
[0087]在一些實(shí)施方式中，被本發(fā)明的表達(dá)盒導(dǎo)入的植物與衍生出啟動(dòng)子的植物是相同物種的植物。在一些實(shí)施方式中，被表達(dá)盒導(dǎo)入的植物是與衍生出啟動(dòng)子的植物物種不同物種的植物。
[0088]D.降低木質(zhì)化的植物的篩選
[0089]在選擇轉(zhuǎn)化的植物之后，可以評估植物或植物的部分來確定是否能夠檢測到外源性HCHL的表達(dá)，例如通過評估RNA或蛋白的水平，通過測量HCHL的酶活性以及評估在植物中發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素分子的大小、分子量、含量或其中支化的程度。能夠使用本領(lǐng)域已知的任意數(shù)量的方法實(shí)施這些分析。
[0090]在一些實(shí)施方式中，通過評估RNA或蛋白的水平來篩選植物。測量RNA表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中已知并且包括，例如PCR、northern分析、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和微陣列。測量蛋白水平的方法也在本領(lǐng)域中已知并且包括，例如質(zhì)譜或基于抗體的技術(shù)，如ELISA, Western印跡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法和免疫組織化學(xué)。
[0091]在一些實(shí)施方式中，通過測量HCHL活性，也通過評估木質(zhì)素大小和組成來篩選植物。HCHL的酶學(xué)試驗(yàn)在本領(lǐng)域中熟知并且在本申請中描述。例如，能通過核磁共振(NMR)、分光光度法、顯微分析、克拉松(klason)木質(zhì)素測定、乙酰-溴化物試劑或通過組織化學(xué)染色(例如，用間苯三酚)來評價(jià)木質(zhì)素分子。
[0092]IV.使用降低木質(zhì)化的植物的方法
[0093]來自由于外源性HCHL在次生細(xì)胞壁中的表達(dá)而具有降低木質(zhì)化的植物的植物、植物部分或植物生物質(zhì)材料能夠用于多種方法。在一些實(shí)施方式中，與野生型植物相比，植物、植物的部分或植物生物質(zhì)材料產(chǎn)生較低頑固性生物質(zhì)用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，植物、植物的部分或植物生物質(zhì)材料被用于糖化反應(yīng)，例如，酶促糖化，與野生型植物相t匕，以增加的效率水平產(chǎn)生可溶性糖。在一些實(shí)施方式中，與野生型植物相比，使用植物、植物的部分或植物生物質(zhì)材料來增加生物質(zhì)產(chǎn)率或?qū)τ谀静墓I(yè)(如造紙、制漿和建筑)簡化下游的加工。在一些實(shí)施方式中，使用該植物、植物部分或植物生物質(zhì)材料來提高用于建筑目的的木材的品質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，能夠在燃燒反應(yīng)、氣化、熱解、或多糖水解(酶促或化學(xué))中使用該植物、植物部分或植物生物質(zhì)材料。在另外的實(shí)施方式中，植物、植物的部分或植物生物質(zhì)被用作飼料作物并且與野生型植物相比展現(xiàn)出改善的可消化性。
[0094]轉(zhuǎn)化的方法，例如生物質(zhì)氣化，在本領(lǐng)域中已知。簡單來說，在氣化中，植物或植物生物質(zhì)材料(例如，葉和莖)被研磨為小顆粒并且與受控的量的空氣或氧氣以及蒸汽儀器進(jìn)入氣化器。反應(yīng)的熱和壓力將生物質(zhì)的化學(xué)鍵分裂，形成合成氣，其隨后經(jīng)清潔去除如硫、汞、顆粒和痕量物質(zhì)的雜質(zhì)。合成氣然后能被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品如乙醇或其它生物燃料。
[0095]酶促糖化的方法也為本領(lǐng)域熟知。簡單來說，任選地用熱水、稀釋的堿、AFEX (氨纖維爆破)、離子液體或稀釋的酸預(yù)處理植物或植物生物質(zhì)材料(例如，葉和莖)，然后在緩沖液中使用細(xì)胞壁水解酶混合物`(如半纖維素酶、纖維素酶和糖苷酶)酶促糖化并且孵育植物或植物生物質(zhì)材料與酶混合物。在孵育之后，能通過使用糖檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法測量減少的釋放糖的量來確定糖化反應(yīng)的產(chǎn)率，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的二硝基水楊酸方法。與野生型植物相比，按照本發(fā)明工程改造的植物提供了較高的糖化效率，同時(shí)植物生長、發(fā)育或疾病耐受性沒有受到負(fù)面影響。
[0096]從使用本發(fā)明的植物生物質(zhì)的糖化反應(yīng)產(chǎn)生的糖能用于產(chǎn)生任意產(chǎn)物，該產(chǎn)物中糖能用作碳源。產(chǎn)物的例子包括，但不限于醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有機(jī)酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，比和0)2);抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；維生素(例如，核黃素、Β12、β-胡蘿卜素)；脂肪酸和脂肪酸衍生物(如PCT/US2008/068833中所述)；異戊二烯鏈烷酸酯(isoprenylalkanoates)(如 PCT/US2008/068756 中所述)，甲基丁烯醇(如 PCT/US2008/068831 中所述)；脂肪酸酯(如PCT/US2010/033299中所述)，基于類異戊二烯衍生的柴油燃料(如PCT/US201I/059784中所述)；由聚酮合成酶合成的聚酮，如二元酸(參見，例如PCT/US201I/061900)，生物燃料(參見，例如PCT/US2009/042132)和α-烯烴(參見，例如PCT/US201I/053787)。
實(shí)施例[0097]提供以下實(shí)施例用于說明而非限制本發(fā)明的權(quán)利要求。
[0098]實(shí)施例1:在擬南芥中細(xì)菌HCHL的表達(dá)
[0099]1.材料與方法
[0100]植物材料和生長條件
[0101]擬南芥(Arabidopsis thaliana)(哥倫比亞生態(tài)型，Col-Ο)種子直接在土壤上發(fā)芽。生長條件為每天14小時(shí)IOOymol π Υ1的光照，22°C，55%濕度。在用1%蔗糖、1.5%瓊脂(西格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich))補(bǔ)充調(diào)節(jié)至ρΗ5.6-5.8并且含有50 μ g ml/1卡那霉素的固體Murashige和Skoog維生素培養(yǎng)基(植物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室(PhytoTechnology Laboratories))上進(jìn)行Tl和T2純合轉(zhuǎn)基因植物的選擇。
[0102]化學(xué)品
[0103]4-羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸、香草酸、4-羥基苯甲醛、香草醛、5-羥基香草醛、4-羥基芐醇、香草醇和1-甲基-2-吡咯烷酮購自西格瑪-艾爾德里奇公司。香草酸、丁香酸、3，4-二羥基苯甲醛、丁香醛和芥子醇購自阿法埃莎公司(Alfa Aesar) 0 5-羥基香草酸從美國中草藥公司(ChiOmadex)獲得，并且3，4_ 二羥基芐醇從TCI美國公司(TCIAmerica)獲得。
[0104]pIRX5:⑶S品系和⑶S染色
[0105]擬南芥品系CS70758(哥倫比亞生態(tài)型，Col-2)從擬南芥生物資源中心(ABRC)獲得。該品系具有含有由位于 與GUS基因融合的CESA4起始密碼子上游的基因組片段組成的表達(dá)盒的pMLBART質(zhì)粒。如前述分析組織化學(xué)⑶S活性(Eudes等，2006)。在37°C下，土壤生長品系CS70758的各種器官在使用5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-葡糖醛酸(Indofine化學(xué)公司(Indofine Chemical Company, Inc.))作為底物的⑶S試驗(yàn)緩沖液中孵育1-8小時(shí)。在染色之后，在顯微鏡(萊卡公司(Leica))下觀察之前使用振動(dòng)切片機(jī)將莖樣品(Icm)橫向切片(80 μ m) ο
[0106]IRX5 =HCHL構(gòu)建體和植物轉(zhuǎn)化
[0107]為了在擬南芥中的HCHL表達(dá)，使用衍生自PPZP212的二元載體pTKan (Hajdukiewicz 等，2004)。Gateway 克隆盒(英杰公司(Invitrogen))被插入到 XhoI和PstI的限制性位點(diǎn)之間以產(chǎn)生pTKan-GW載體。從擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型，Col-Ο)基因組 DNA 中用寡核苷酸 5’ -CCCGGCGGCCGCATGAAGCCATCCTCTACCTCGGAAA-3’ 和 5’ -CCCGGCTAGCGGCGAGGTACACTGAGCTCTCGGAA-3，(Nod和NheI限制性位點(diǎn)用下劃線表示)通過PCR擴(kuò)增IRX5啟動(dòng)子的核苷酸序列，并且在pTKan-GW的ApaI和SpeI限制性位點(diǎn)之間插入產(chǎn)生pTKan-pIRX5-GW表達(dá)載體。合成不含種植密碼子的用于在擬南芥中表達(dá)的編碼來自熒光假單胞菌AN103 (登錄號CAA73502)的HCHL酶的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(金斯瑞(Genescript))并且用寡核苷酸 5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTACTTACGAGGGAAGATGG-3’ 和 5’ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCTCTTGTAAGCCTGGA GTCC-3’ (attbl和attb2位點(diǎn)用下劃線表示)通過PCR擴(kuò)增來克隆進(jìn)入Gateway pD0NR221_fl進(jìn)入載體(Lalonde等，2010)。測序驗(yàn)證的HCHL進(jìn)入克隆與pTKan-pIRX5_GW載體LR重組以產(chǎn)生最終的IRX5: HCHL構(gòu)建體。該構(gòu)建體通過擬南芥介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入野生型擬南芥植物(生態(tài)型 ColO)中(Bechtold 和 Pelletier,1998)。
[0108]RNA 提取和 RT-PCR[0109]用植物RNeasy提取試劑盒(凱杰公司(Qiagen))從IRX5: HCHL Tl轉(zhuǎn)化體和野生型植物的花序梗中提取的總RNA (I μ g)用Transcriptor First Strand cDNA合成試劑盒(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(Roche applied Science))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對所得的cDNA制備物進(jìn)行質(zhì)量控制以用于使用tu砧-特異性寡核苷酸(5’-GGGCTAAAGGACACTACACTG-3’/V-CCTCCTGCACTTCCACTTCGT CTTC-3’)的 PCR。使用寡核苷酸 5’-ATGTCTACTTACGAGGGAAGATGG-3’和 5’ -TCTCTTGTAAGCCTGGAGTCC-3’ 用于通過 PCR 檢測 HCHL 表達(dá)。
[0110]Western 印跡分析
[0111]為了蛋白提取，IRX5: HCHL T2轉(zhuǎn)化體和野生型植物的花序梗在液氮中研磨，并且在1400rpm下用提取緩沖液[IOOmM Tris-HCl pH6.5,2% (w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，2%(ν/ν) β -巰基乙醇，I % (w/v) SDS]對0.25g的所得的粉末進(jìn)行勻化30分鐘?；旌衔镌?0，OOOg下離心5分鐘并且收集上清用于使用Bradford法(Bradford, 1976)和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白定量。對于電泳，可溶性蛋白(5yg)與0.2M Tris-HCl, pH6.5,8% (w/v) SDS,8% (ν/ν) β-巰基乙醇，40% (ν/ν)甘油和0.04% (w/v)溴酚藍(lán)混合并且在40°C下孵育30分鐘。通過使用8-16% (w/v)聚丙烯酰胺梯度凝膠(英杰公司)的SDS-PAGE分離蛋白并且電轉(zhuǎn)(100伏，45分鐘)到PVDF膜(賽默飛世爾科學(xué)公司(Thermo FisherScientific))上。印跡的膜在含有 2% (w/v)脫脂奶粉的 TBS-T(20mM Tris-HCl, 150mMNaCl，0.1% (ν/ν)吐溫20，ρΗ7.6)中孵育I小時(shí)，并且用通用抗體(I: 20000)在含有2%(w/v)脫脂奶粉的TBS-T中過夜孵育。然后在TBST-T中洗滌膜30分鐘并且在含有2% (w/V)脫脂奶粉的TBS-T中與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔二抗(I: 20000;西格瑪-艾爾德里奇公司)孵育I小時(shí)。然后在TBS-T中洗滌膜30分鐘，并且通過使用SuperSignal WestDura Extended Duration Substrate (賽默飛世爾科學(xué)公司)的化學(xué)發(fā)光實(shí)施檢測。
[0112]HCHL 活性
[0113]為了蛋白提取， IRX5: HCHL T2轉(zhuǎn)化體和野生型植物的花序梗在液氮中研磨，并且用25mg的聚乙烯基聚吡咯烷酮和1.25mL的提取緩沖液(EB ；IOOmM Tris-HCl, pH8.5，20mM DTT和IOmM Na2EDTA)對0.25g的所得粉末進(jìn)行勻化。在4°C下在1400rpm下振搖提取物15分鐘，并且在4°C下在20，OOOg下離心30分鐘。收集上清，用EB調(diào)至2.5mL并且加到用25mL的EB預(yù)平衡的HHO柱(GE衛(wèi)生保健公司(GE healthcare))上。用3.5mL的EB稀釋蛋白并且用Bradford法(Bradford，1976)和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)來定量。
[0114]對于HCHL活性，在30°C下用在IOOmM Tris-HCl pH8.5中的150 μ M阿魏酰-輔酶A中孵育5 μ L的蛋白提取物15分鐘，總體積50 μ L0每個(gè)反應(yīng)的蛋白總量在4-6.5 μ g之間變化。用50yL冷酸化的甲醇(12%冰醋酸/88%甲醇，ν/ν)終止反應(yīng)并且在_70°C下保存直到LC-MS分析。
[0115]生物質(zhì)
[0116]對于生物質(zhì)測量，IRX5: HCHL和野生型植物生長直至衰老并且在稱重前收集不含根、葉和長角果的干燥的莖。使用ANOVA然后雪費(fèi)(SchefTe)事后檢驗(yàn)來實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0117]顯微觀察
[0118]5周齡的植物被用于顯微觀察。在第一和第二節(jié)間之間切下的莖區(qū)段在4%瓊脂糖中包埋。使用振動(dòng)切片機(jī)(Leica公司)得到莖半薄切片(100-μ μπι厚)。對于甲苯胺藍(lán)O(TBO)染色，在水中TBO(西格瑪-艾爾德里奇公司)的0.05% (w/v)溶液中孵育切片30秒并且用水清洗。對于Wiesner木質(zhì)素染色，切片在間苯三酚-HCl試劑(VWR國際(VWR國際公司))中孵育3分鐘并且用水清洗。對于Maule木質(zhì)素染色，切片在4% KMnO4中孵育5分鐘，用水清洗，在37% HCVH2O(I: I, ν/ν)中孵育2分鐘，并且在加入I滴氨水后觀察。立即使用亮場光學(xué)顯微鏡(Leica DM4000B)觀察切片。
[0119]可溶性酚類提取
[0120]對于甲醇可溶性酚類的提取，大約200mg的冷凍莖粉末與ImL的80% (ν/ν)甲醇-水混合并且在1400rpm下振搖I小時(shí)。在LC-MS分析之前,通過離心(5分鐘，20000g)清潔提取物，與400 μ μ L的分析級純的水混合并且用Amicon超速離心濾膜(3，OOODa MW截止值的再生纖維素膜；密理博(Millipore))過濾。另外，等份的過濾的提取物在真空下干燥，用IN HCl重懸并且在95°C下孵育3小時(shí)來酸水解?；旌衔锝?jīng)過3次乙酸乙酯分配步驟。收集乙酸乙酯部分，真空中干燥，并且在LC-MS分析之前在50% (ν/ν)甲醇-水中重懸。
[0121]細(xì)胞壁結(jié)合酚類提取
[0122]對于細(xì)胞壁結(jié)合酚類的提取，收集不含葉和長角果的成熟衰老的莖，并且用MixerMill MM400(雷太克公司(Retsch))和不銹鋼球以30s—1持續(xù)2分鐘將其球磨成細(xì)粉末。通過依次用Iml的95°C的96%乙醇洗滌2次30分鐘，和用ImL的70%乙醇渦旋2次30秒的得到不含提取物的細(xì)胞壁殘留物(CWR)。所得的CWR在30°C下過夜真空干燥。大約6mg的CffR與500 μ μ L的2Μ NaOH混合并且在30°C下在1400rpm下振搖24小時(shí)。用100 μ μ L的濃HCl酸化混合物，并且經(jīng)過3次乙酸乙酯分配步驟。收集乙酸乙酯部分，真空中干燥，并且在LC-MS分析之前在50% (ν/ν)甲醇-水中懸浮。
[0123]LC-MS
[0124]使用1200系列HPLC系統(tǒng)(安捷倫技術(shù)公司(Agilent Technologies Inc.))在Poroshel 1-120柱(150mm長,3mm內(nèi)徑,2.7 μ μπι粒度)上進(jìn)行C6C1酹酸和醒的分離。使用水中0.1 %甲酸作為溶劑A和乙腈-水(98:2,ν/ν)中0.1 %甲酸作為溶劑B的流動(dòng)相組成的梯度洗脫來分離分析物。洗脫的梯度為0-5分鐘13% B, 5-7分鐘50% B, 7-8分鐘50% B以及8-11分鐘13% B，流速0.55mL分鐘―1。HPLC系統(tǒng)通過1: 7柱后分流與安捷倫6210飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜(MS)聯(lián)用。在陽離子模式下使用電噴霧電離(ESI)進(jìn)行分析。在全掃描模式中以光譜.秒―1和使用以下參數(shù)的1.176秒.光譜―1的循環(huán)時(shí)間進(jìn)行[M+H]+離子的檢測:毛細(xì)管電壓3500V，碎裂電壓(fragmentor)165V，錐孔電壓(skimmer) 50V和OCTRF170V，干燥氣流速9L分鐘―1，噴霧器壓力15psig，干燥氣溫度325°C。在相同的HPLC和MS系統(tǒng)中使用相同的HPLC柱進(jìn)行C6C1酚醇的分離。使用水中0.1 %甲酸作為溶劑A和乙腈-水(98:2，ν/ν)中0.1 %甲酸作為溶劑B的流動(dòng)相組成的梯度洗脫來分離分析物。洗脫條件與上述相同。在陽離子模式下使用常壓化學(xué)電離(APCI)進(jìn)行分析。除了以下參數(shù)以外如上述進(jìn)行[M-H2CHH]+離子的檢測:毛細(xì)管電壓3200V，電暈電流4 μ Α，干燥氣體流速12L分鐘―1，噴霧器壓力30psig，蒸發(fā)器溫度350°C。通過與在50% (ν/ν)甲醇-水中制備的真實(shí)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較進(jìn)行化合物的定量。
[0125]木質(zhì)素分析
[0126]使用Soxhlet設(shè)備通過依 次用甲苯:乙醇(2:1, ν/ν)、乙醇和水提取球磨的材料來制備球磨的成熟衰老莖的不含提取物的樣品(CWR) (Sluiter等，2008)。在CWR上進(jìn)行使用標(biāo)準(zhǔn)克拉松方案(Dence，1992)和硫代酸解方案(Lapierre等，1995 ；1999)的木質(zhì)素含量的確定。通過GC-MS以其三甲基-甲硅烷基化的衍生物鑒定木質(zhì)素衍生的單體。所有的木質(zhì)素分離重復(fù)進(jìn)行。
[0127]總糖分析和半纖維素糖分析
[0128]對于總糖水解，球磨的成熟衰老莖(50mg)的CRW在30°C下在500 μ LH2SO4 (72%,w/v)中溶脹60分鐘，并且在加入去離子水(14mL)之后在120°C下在稀H2SO4 (4%，w/v)中高壓滅菌I小時(shí)。樣品被冷卻至室溫并且用預(yù)稱重的GF/C玻璃微纖維過濾器(沃特曼(Whatman))過濾。收集濾液并且在HPAEC-PAD分析之前用去離子水稀釋100倍。對于半纖維素水解，在120°C下球磨的成熟干燥的莖的CRW(5mg)在Iml的2M三氟乙酸(TFA)中水解I小時(shí)。通過在真空下干燥來去除TFA并且在HPAEC-PAD分析前在去離子水(ImL)中重懸殘留物。
[0129]HPAEC-PAD 分析
[0130]通過水解物質(zhì)的HPAEC-PAD來確定單糖組成。在PA20柱(戴安公司(Dionex))上以0.5mL分鐘―1的流速進(jìn)行層析。在每個(gè)樣品(20 μ L)注射之前，用200mM NaOH洗滌柱10分鐘，然后用IOmM NaOH平衡10分鐘。洗脫程序由第0-1.5分鐘的IOmM Na0H-5mM NaOH線性梯度，然后第1.5-20分鐘是用5mM NaOH等度洗脫以及第20-43分鐘升高至800mM NaOH的線性梯度組成。使用按照生產(chǎn)商說明書使用設(shè)定在波形A上的脈沖電流分析儀(金電極)檢測單糖。運(yùn)行包括 L-Fuc、L-Rha、L-Ara、D-Gal、D-Glc、D-Xyl、D-GalA 和 D-GlcA(西格瑪-艾爾德里奇公司)的單糖標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)曲線來驗(yàn)證相應(yīng)的因子。使用AN0VA，之后徒吉檢驗(yàn)(Tukey’ s test)來實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0131 ] FT-拉曼和FT-1R光譜分析
[0132]在來自3個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的球磨成熟衰老莖的CWR(2mg)上進(jìn)行FT-拉曼光譜。用裝備有1064nm 二極管激光器(Bruk`er光學(xué)產(chǎn)品公司(Bmoker Optics Inc.))的BmokerMultiRAM FT-拉曼系統(tǒng)收集拉曼光譜。每個(gè)樣品獲得5個(gè)光譜，光譜分辨率為4cm—1，使用50mW的激光能量和256光點(diǎn)(scan)來實(shí)現(xiàn)良好的信噪比。進(jìn)行對于獲得的光譜的白光校對以校正光學(xué)期間對于光譜的影響。在200-35000^1范圍內(nèi)的光譜是平滑的并且用OPUS軟件校正基線。分別使用1555-1690CHT1和lOlO-lHScnT1范圍內(nèi)測量的積分強(qiáng)度來確定木質(zhì)素和多糖(纖維素和半纖維素)含量。對于FT-1R光譜，在來自五周齡植物的莖的基底區(qū)域的50-μπι厚部分的木質(zhì)部和束間纖維組織上進(jìn)行分析。對于野生型和IRX5: HCHL (品系2)，分析了來自3種不同植物的5-6個(gè)部分。從對著木質(zhì)部導(dǎo)管和束間纖維的50 μπιχ50 μ m窗口中收集FT-1R光譜，并且如上述進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(斯氏t檢驗(yàn))(Mouille 等，2003)。
[0133]纖維素分解的木質(zhì)素(CEL)分離和尺寸排阻色譜法(SEC)
[0134]從野生型和IRX5: HCHL(品系2)植物中純化CEL木質(zhì)素。I克的球磨成熟衰老莖與50mM NaCl (30ml)混合并且在4°C下過夜孵育。在離心(2，800g，10分鐘)后，依次通過用80%乙醇(3次)、丙酮(I次)、氯仿-甲醇(I: l，v/v，l次)和丙酮(I次)超聲(20分鐘)提取生物質(zhì)。每500mg樣品用PMlOO球磨機(jī)(雷太克公司)在600Am下用含有ZrO2*球軸承(IOXlOmm)的二氧化鋯容器(50mL)振動(dòng)對所得的CWR球磨3小時(shí)(10分鐘開/10分鐘關(guān)的循環(huán))。球磨的細(xì)胞壁(490mg野生型和480mg IRX5: HCHL)被轉(zhuǎn)移到離心管(50mL)中并且在30°C下在混合旋轉(zhuǎn)下用粗纖維素酶(綠木酶(Cellulysin);卡巴開公司(Calbiochem) ；60mg g—1樣品)在NaOAc ρΗ5.0緩沖液(30mL)中在3天內(nèi)消化4次。所得的CEL用去離子水洗滌3次并且凍干過夜。野生型回收的CEL為131mg(27.3%)而IRX5: HCHL回收的為101mg(20.6% )。對于SEC分析，在分析級1-甲基-2-吡咯烷酮-DMSOd: I, ν/ν)中制備1% (w/v)CEL木質(zhì)素溶液并且在40°C下超聲3小時(shí)。
[0135]如其它地方所述，使用分析技術(shù)SEC UV-F和SEC UV-A來確定溶解的木質(zhì)素的多分散性(George等，2011，已提交)。使用裝備了 FL(G1321A)和DA(G1315D)檢測器的安捷倫1200系列二元LC系統(tǒng)(G1312B)。通過在80°C下以0.5mL分鐘―1的流速使用NMP的流動(dòng)相用Mixed-D柱(5mm粒度,300mm x7.5mm內(nèi)徑,200-400，OOOu的線性分子量范圍，聚合物實(shí)驗(yàn)室(Polymer Laboratories))實(shí)現(xiàn)分離。在300nm(UV_A)處檢測從柱上洗脫的物質(zhì)的吸收。激發(fā)250nm和發(fā)射450nm被用于UV-F檢測。強(qiáng)度由面積標(biāo)準(zhǔn)化并且在用聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)校正系統(tǒng)之后確定分子質(zhì)量的估值。
[0136]細(xì)胞壁預(yù)處理和糖化
[0137]對于熱水、稀釋的酸或稀釋的堿預(yù)處理，球磨成熟衰老莖(IOmg)分別與340 μ L的水、340 μ L 的 H2SO4(1.2%,w/v)或 340 μ L 的 NaOH(0.25%,w/v)混合，在 30°C下孵育 30 分鐘并且在120°C下高壓滅菌I小時(shí)。 在室溫下冷卻之后，用稀釋的酸和稀釋的堿預(yù)處理的樣品分別用5N NaOH(25 μ L)和1.25NHC1 (25 μ L)中和。通過加入635 μ L的含有80g πι1四環(huán)素、5% w/w纖維素酶復(fù)合物NS50013和0.5% w/w葡糖苷酶NS50010 (諾維澤姆公司(Novozymes))的ρΗ6.2的IOOmM檸檬酸鈉緩沖液引發(fā)糖化。在5(TC下振搖(800mm)孵育72小時(shí)之后，離心樣品(20，000g，3分鐘)并且收集10 μ L的上清用于使用DNS試驗(yàn)和作為標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液的還原糖測量(Miller，1959)。
[0138]轉(zhuǎn)錄組研究
[0139]在含有對應(yīng)于22，089個(gè)來自擬南芥的基因的24，576基因特異性標(biāo)簽(GST)的完整擬南芥轉(zhuǎn)錄組微陣列上實(shí)施微陣列分析(Crowe等,2003 ;Hilson等,2004)。分離并單獨(dú)分析來自3個(gè)獨(dú)立生物重復(fù)樣的RNA樣品。對于每個(gè)生物重復(fù)樣，收集來自3個(gè)植物的主花序梗(前兩個(gè)節(jié)間)的RNA。對于每次比較，對于每個(gè)生物重復(fù)樣實(shí)施有熒光抑制的技術(shù)重復(fù)(例如，每次比較9個(gè)雜交)。在Cy3-dUTP或Cy5-dUTP存在下進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄(帕金埃爾默生物科學(xué)產(chǎn)品公司(PerkinElmer-NEN Life Science Products)),并且如Lurin等(2004)所述實(shí)施載玻片的雜交和掃描。
[0140]微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0141]如前述(Gagnot等，2008)由基于染料交換的標(biāo)準(zhǔn)化(例如，4個(gè)試驗(yàn)，含有24，576個(gè)GST和384個(gè)對照)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為了鑒定差異表達(dá)的基因，我們對log比率進(jìn)行配對t測試，假定log比率的變化對于所有基因是相似的。有極端變化(太小或太大)的點(diǎn)被排除。通過Bonfeironi法調(diào)整原始P值，其控制誤差率判斷族(I類錯(cuò)誤等于5%)以最小化在多重比較情況中的假陽性(Ge等，2003)。如前述，Bonferroni P值≤0.05的基因被認(rèn)為差異表達(dá)(Gagnot等,2008)。
[0142]數(shù)據(jù)存儲
[0143]來自該文的微陣 列數(shù)據(jù)按照微陣列試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(MIME)的最小信息被存儲在GEO(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/geo/)和 CATdb(http://urgv.evry.1nra.fr/CATdb/)上。
[0144]I1.結(jié)果
[0145]在擬南芥莖中細(xì)菌HCHL酶的表達(dá)
[0146]用β -葡萄糖醛酸糖苷酶(CTS)作為報(bào)告基因來驗(yàn)證IRX5啟動(dòng)子的組織特異性活性。基本在莖的木質(zhì)部導(dǎo)管中檢測Gus活性。在長時(shí)間的孵育之后，莖束間纖維也顯示出強(qiáng)的GUS活性，并且在幼苗、長角果、玫瑰花結(jié)和莖生葉的維管系統(tǒng)中觀察到更中度的染色。除了花柱和花藥以外，在其它器官或組織中沒有觀察到活性(圖9)。設(shè)計(jì)編碼來自熒光假單胞菌ΑΝ103的HCHL的密碼子優(yōu)化的序列并且克隆在IRX5啟動(dòng)子的下游用于擬南芥莖的木質(zhì)化組織的優(yōu)先表達(dá)。通過在Tl代中的RT-PCR來驗(yàn)證5個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的主莖中HCHL轉(zhuǎn)錄物的存在(圖2Α)。在Τ2代中鑒定IRX5: HCHL構(gòu)建體的植物純合體，并且其用于分析莖中HCHL蛋白表達(dá)和活性。使用“常規(guī)抗體’ ’的Western印跡分析允許在5個(gè)選擇的轉(zhuǎn)基因品系的莖提取物中檢測HCHL(圖2B ;EudeS等，2010)。另外，可在這些品系的莖中檢測HCHL活性，使用阿魏酰-輔酶A作為底物，范圍為0.025-0.16pkat香草醛yg—1蛋白，其中在野生型植物的蛋白提取物中沒有觀察到可檢測的活性(表1)。選擇顯示最高和最低水平的HCHL活性的2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系以及展示中間活性水平的2個(gè)品系用于詳細(xì)分析。
[0147]IRX5: HCHL品系的生長特征和組織解剖
[0148]從早期的玫瑰花結(jié)階段直到衰老，IRX5: HCHL植物具有與野生型視覺上相似的生長和發(fā)育 特征(圖10)。然而，與對照植物相比，來自品系IRX5: HCHL(4)和IRX5: HCHL(5)的成熟衰老莖稍短(短22%和13% )并且具有較低的干重產(chǎn)率(降低30%和16%)，其中來自品系IRX5: HCHL(I)和IRX5: HCHL (2)的這些特征明顯不同(表II)。用光學(xué)顯微鏡檢查5周齡的IRX5: HCHL植物的莖組織。用MSule和間苯三酚-HCl試劑染色的橫向莖切片，其分別是木質(zhì)素中S-單元和羥基肉桂醛單元的指示，顯示了轉(zhuǎn)基因和野生型植物之間相似的圖案(圖3A和3B)。相似地，在用甲苯胺藍(lán)O染色的莖切片中的木質(zhì)素沒有揭示出基因型之間的任意定量差異(圖3C)。然而，在品系IRX5: HCHL(4)的一些莖切片中觀察到一些塌縮的木質(zhì)部結(jié)構(gòu)，但是在其它品系的切片中沒有(圖3C)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明在IRX5: HCHL植物中木質(zhì)素含量沒有大幅降低。
[0149]IRX5: HCHL品系積累C6C1可溶性酚類
[0150]提取來自5周齡野生型和IRX5: HCHL植物的莖的甲醇可溶性部分并且通過LC-MS分析。聚焦在HCHL活性的直接產(chǎn)物的羥基苯甲醛，以及可能的衍生物如羥基苯甲酰醇和羥基苯甲酸及其葡萄糖偶聯(lián)物上進(jìn)行分析。在IRX5: HCHL莖可溶性提取物中檢測到痕量的4-羥基苯甲醛(HBAld)、3，4-二羥基苯甲醛(3，4-DHBAld)和4-羥基苯甲酸(HBA)，但在野生型中沒有(表1II)。值得注意的是，在IRX5: HCHL植物可溶性提取物中檢測到大得多的量的4-羥基苯甲酸葡糖苷(HBAGlc)和4-羥基苯甲酸葡萄糖酯(HBAGE)(對于HBAGlc范圍為0.48-0.57mg g<FW而對于HBAGE范圍為0.96-1.65mg g<FW)，其中在野生型提取物中存在痕量的這些HBA-葡萄糖偶聯(lián)物(表1II)。
[0151]考慮到其它可溶性C6C1酚類可被糖基化，實(shí)施對于該可溶部分的酸水解以從偶聯(lián)的形式中釋放苷元。這個(gè)過程將使得HBAGE和HBAG收集集合回歸至不可檢測的水平，并且同時(shí)增加樣品中游離HBA的含量(表1V)。在IRX5: HCHL品系中HBA含量范圍為1.59-2.49mg g^FW，其表示與野生型樣品中觀察值相比113-179倍的增加，并且表明在轉(zhuǎn)基因品系中積累的HBA的88-94%被糖基化。除了 HBA以外，其它在酸處理的提取物中定量的C6C1酚類包括香草醛(Van)、5_羥基香草醛(50H_Van)、丁香醛(Syrald)、5_羥基香草酸(50H-VA)和丁香酸(SyrA)，這些僅僅在IRX5: HCHL提取物中被檢測到，以及HBAld、3，4-DHBAld、3，4-二羥基苯甲酸(3，4-DHBA)和香草酸(VA)，與野生型相比，這些分別在IRX5: HCHL提取物中平均有14、119、1.6和40倍的更高豐度。
[0152]IRX5: HCHL品系顯示出細(xì)胞壁結(jié)合C6C1酚類中的富集。
[0153]從野生型和IRX5: HCHL植物的成熟衰老莖中得到的不含提取物的細(xì)胞壁殘留物(CffR)經(jīng)過溫和堿水解來釋放松散結(jié)合的酚類。這個(gè)過程從細(xì)胞壁樣品中釋放一些HBAld、3，4-HBAld、Van、50H-Van、SyrAld、HBA、VA 和 SyrA，這些使用 LC-MS 分析來定量。在野生型細(xì)胞壁中未檢測到的50H-Van在IRX5: HCHL樣品的細(xì)胞壁中存在并且與野生型相比，在IRX5: HCHL植物的細(xì)胞壁中HBAld、SyrAlcUHBA、VA和SyrA分別平均增加約2、6、68、2和5倍(表V)。這些結(jié)果表明在IRX5: HCHL植物中較大量的C6C1酚類與細(xì)胞壁松散結(jié)合。另一方面，使用這個(gè)過程從細(xì)胞壁中釋放的阿魏酸酯和香豆酸酯的量在轉(zhuǎn)基因和野生型樣品之間沒有區(qū)別。
[0154]IRX5: HCHL植物莖的光譜分析
[0155]未顯示出缺陷木質(zhì)部結(jié)果并且生物質(zhì)產(chǎn)率與野生型植物相似的品系IRX5: HCHL(2)被選擇用于進(jìn)一步分析。使用傅里葉變換拉曼(FT-拉曼)光譜來確定從IRX5: HCHL植物的衰老的莖中得到的CWR的化學(xué)組成。數(shù)據(jù)顯示，與野生型相比，在IRX5: HCHL植物中的木質(zhì)素含量和多糖(纖維素和半纖維素)的量沒有顯著差異(圖4A)。另外，在5周齡IRX5: HCHL和野生型植物的橫向莖切片的木質(zhì)化組織(木質(zhì)部和束間纖維)上進(jìn)行傅里葉變換紅外(FT-1R)光譜分析揭示了兩種基因型之間的差異(圖4B)。特別地，在光譜中觀察到在分配給木質(zhì)素的不同彎曲或拉伸的條帶的顯著變化(Agarwal和 Atalla, 2010, Fackl er 等，2010)。例如，在波長 1589cm 1 和 1506cm 1 (芳環(huán)拉伸)、1464cm—1 (C-H基團(tuán)變形)、1425cm—1 (甲氧基C-H基團(tuán)變形)、1379cm—1 (芳族骨架振動(dòng)與在平面上C-H基團(tuán)變形結(jié)合)和126801^1 (帶有C = O基團(tuán)拉伸的芳環(huán)呼吸(breathing))處的吸收在纖維中被改變，其中在條帶1367(311^(甲氧基C-H基團(tuán)變形)處觀察到木質(zhì)部細(xì)胞壁的最顯著差異?？傊?，光譜分析表明了在表達(dá)HCHL的植物中木質(zhì)素的組成修飾。
[0156]在IRX5: HCHL植物莖中單糖含量和組成
[0157]在來自品系IRX5: HCHL(2)和野生型植物的成熟衰老莖的總細(xì)胞壁多糖的硫酸水解后確定單糖組成。雖然兩個(gè)基因型有相似量的總單糖，與野生型植物相比，IRX5: HCHL植物顯示出在葡萄糖上的減少(-12% )以及在木糖(+22% )和阿拉伯糖(+16%)上的增加(表VI)。另外，使用三氟乙酸從CWR釋放的半纖維素單糖顯示與野生型相比，在這個(gè)水解中定量的糖的總量在IRX5: HCHL莖中高出23%，對應(yīng)于較高的木糖(+23% )和阿拉伯糖含量(+22% )(表VI)。
[0158]納入到IRX5: HCHL植物的木質(zhì)素的非常見C6C1單體
[0159]在CWR上確定在來自野生型和IRX5: HCHL(2)植物的成熟衰老莖的木質(zhì)素含量和單體組成。在兩個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng) 中，克拉松木質(zhì)素(KL)是相同的并且對于野生型和IRX5: HCHL植物占CWR約20% (表VII)。通過硫代酸解，一種從包含在不穩(wěn)定連接β _0_4鍵中的木質(zhì)素單元中產(chǎn)生巰乙酸化(thioethylated)單體的化學(xué)降解方法來評價(jià)木質(zhì)素單體組成。數(shù)據(jù)顯示與野生型相比，在硫代酸解之后在兩個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)的IRX5: HCHL植物中從CWR釋放的常規(guī)H、G和S單體的總量(或總產(chǎn)率)減少25%和16%，表明在轉(zhuǎn)基因中這三種單體木質(zhì)醇中較少地以β-0-4鍵交聯(lián)(表VII)?？紤]到野生型和IRX5: HCHLCffR的相同KL值，這些數(shù)據(jù)表明在轉(zhuǎn)基因植物中木質(zhì)素單體之間較高頻率的硫代酸解耐受性鍵。從該木質(zhì)素部分中回收的G和S單元的相對量沒有變化，野生型和轉(zhuǎn)基因樣品顯示出0.34-0.36的S/G，然而，在IRX5: HCHL植物中H單元的摩爾頻率明顯更高(表VII)。此外，與野生型植物相比，在IRX5: HCHL植物中由硫代酸解釋放的非常規(guī)單元如VaruSyrald和SyrA分別顯示平均1.44,2.08和1.65倍的增加。有趣的是，從轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)素中釋放出兩種新的木質(zhì)素單元，其被鑒定為C6C1香草醇(Vanalc)和丁香醇(Syralc)(表VIII)。另一方面，在兩種基因型之間松柏醛端基(Cald)和VA不變(表VIII)?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示與野生型相比，通過硫代酸解從IRX5: HCHL莖細(xì)胞壁釋放的單體之間較高量的C6C1苯酚端基。
[0160]IRX5: HCHL植物的木質(zhì)素具有降低的分子量
[0161]用尺寸排阻色譜法(SEC)確定從野生型和IRX5: HCHL(2)莖中純化的細(xì)胞裂解木質(zhì)素多分散性。通過監(jiān)測溶解的木質(zhì)素的UV-A吸收(SEC UV-A3J和UV-F熒光(SECUV-Fex250/em450)得到的洗脫曲線揭示出野生型和IRX5: HCHL植物之間的差異(圖6)。首先，由于在7分鐘和9分鐘之間洗脫的最大木質(zhì)素部分的明顯損失，在轉(zhuǎn)基因中對應(yīng)在7分鐘和13.5分鐘之間的最大質(zhì)量峰嚴(yán)重降低。相似地，之后洗脫的在13.5分鐘和19.5分鐘之間的第二峰中的較小分子量材料在IRX5: HCHL樣品中更豐富(使用UV-A和UV-F監(jiān)測增加27%和16% )。最后，使用UV-F在19.5分鐘和26.5分鐘之間檢測到的最小木質(zhì)素部分的量在轉(zhuǎn)基因中增加55% (圖6)。這些結(jié)果證明在從IRX5: HCHL植物中純化的木質(zhì)素中較小的鏈和降低的聚合度。
[0162]IRX5: HCHL品系顯示增加的糖化效率
[0163]為了檢測由在木質(zhì)化組織中HCHL酶的表達(dá)造成的木質(zhì)素尺寸降低對于細(xì)胞壁可消化性的影響，對衍生自用熱水、稀釋的堿和稀釋的酸預(yù)處理的成熟衰老莖的生物質(zhì)進(jìn)行糖化試驗(yàn)。在用纖維素酶和葡糖苷酶孵育72小時(shí)之后，與野生型相比，預(yù)處理的IRX5: HCHL植物的生物質(zhì)釋放更多的還原糖(圖7)。具體地，不同IRX5: HCHL品系觀察到的糖化效率的改善在熱水后范圍為34% -77%，在稀釋的堿后為43% -71%并且在稀釋的酸預(yù)處理后為15% -31% (圖7)。
[0164]III.討論
[0165]在植物中HCHL的表達(dá)原先被認(rèn)為在植物體內(nèi)產(chǎn)生有價(jià)值的和溶解性的化合物如Van和HBA。然而，由于強(qiáng)的異位HCHL表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因煙草和甘蔗中觀察到相反的表型如萎黃和衰老的葉、矮小、低劃分產(chǎn)生、雄性不育、塌縮的木質(zhì)部導(dǎo)管以及生物質(zhì)的減少(Mayer等，2001 ；Merali等，2007 ;McQualter等，2005)。在這個(gè)研究中，發(fā)明人選擇次生細(xì)胞壁纖維素合成酶的啟動(dòng)子來在擬南芥莖的木質(zhì)化組織中優(yōu)選表達(dá)HCHL(圖9)。成功地，由IRX5: HCHL構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物不是矮化的或不育的，并且幼玫瑰花結(jié)葉沒有顯示出降低的表皮熒光，其為苯丙素-衍生的可溶性酚類集合中改變的征兆。雖然兩個(gè)IRX5: HCHL品系顯示減少的生物質(zhì)，并 且在一種當(dāng)中，顯示由較強(qiáng)HCHL活性和細(xì)胞壁完整性的可能修飾造成的一些偶發(fā)的塌縮的木質(zhì)部導(dǎo)管，但是一些其它IRX5: HCHL品系與野生型植物的相當(dāng)?shù)摹?br> [0166]正如期望的，轉(zhuǎn)基因品系顯示增加量的可溶性C6C1醛(HBAld、3，4_DHBAld和Van)，其在羥基苯甲酰-輔酶A、3，4- 二羥基苯甲酰-輔酶A和阿魏酰-輔酶A切割之后由HCHL活性產(chǎn)生。HCHL沒有針對芥子(sinapoyl)-輔酶A的活性，這表明Syrald是Van的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其得到新的中間體50H-Van的鑒定的支持(Mitra等，1999 ;圖11)。相似地，本文所示的數(shù)據(jù)不能排除在苯環(huán)的C-3位置上依次羥基化和甲氧基化之后，3，4-DHBald和Van中的一些在衍生自HBAld的轉(zhuǎn)基因品系中積累。有趣的是，編碼單加氧酶的集中基因在表達(dá)HCHL的植物中被上調(diào)，但是沒有已知或預(yù)測的O-甲基轉(zhuǎn)移酶顯示改變表達(dá)水平(表1X )。在轉(zhuǎn)基因品系中可溶性芳族的分析也顯示C6-C1醛被氧化為它們相應(yīng)的酸的形式。這種轉(zhuǎn)化可能是對于減少這些化學(xué)反應(yīng)性化合物的量的響應(yīng)，由于來自短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)、醛酮還原酶(AKR)和醛脫氫酶(ALDH)家族的幾個(gè)基因在表達(dá)HCHL的植物中被上調(diào)(圖11 ;Kirch等，2004 ;Kavanagh等，2008)。具體地，AKR4C9 (At3g37770)編碼已知代謝一類羥基苯甲醛的酶(Simpson等，2009)。另外，可溶性C6C1酚類主要以偶聯(lián)物的形式在轉(zhuǎn)基因品系中積累，由于我們顯示葡萄糖偶聯(lián)物(酚基葡糖苷和葡萄糖酯)占HBA可溶性集合的約90%，大概是由于如前述的其它C6C1酚類的液泡儲存(Eudes等，2008)。這種C6C1酸葡糖苷積累與在表達(dá)HCHL的煙草、甜菜、曼陀羅和甘蔗植物中所觀察到的相符(Mayer等，2001 ；Mitra等，2002 ；McQualter等，2005 ；Rahman等，2009)。有趣的是，HCHL植物的表達(dá)分析揭示了Μ)Ρ-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)家族的7個(gè)上調(diào)的基因并且在它們當(dāng)中UGT75B1和UGT73B4之前顯示催化葡萄糖酯化和苯甲酸酯的酚基葡糖基化(表1X ；Lim等，2002 ；Eudes等，2008)。
[0167]另外，該研究顯示在溫和堿水解時(shí)從衰老莖的不含提取物的細(xì)胞壁部分中釋放出一些C6C1酚類。與野生型相比，在IRX5: HCHL品系的“松散細(xì)胞壁-結(jié)合’’部分中測量到較高量的HBAld、50H-Van、SyrAld、HBA、VA和SyrA。雖然，涉及的連接的類型還未清楚，先從擬南芥葉和根的細(xì)胞壁中提取松散連接的C6C1酚類(Tan等，2004 ；Forcat等，2010)。
[0168]來自表達(dá)HCHL的植物的木質(zhì)素顯示增加的C6C1酚類的含量。值得注意的是，對于在硫代酸解后釋放的木質(zhì)素單體的分析`鑒定出兩種新型單元(Vanalc和Syralc)并且顯示出大量的SyralcUVan和SyrA。這表示部分的C6C1醛被轉(zhuǎn)化為醇和酸并且證明在木質(zhì)素中它們以β-0-4-連接的C6C1單體端基被納入到木質(zhì)素中(圖11)。由于缺少苯丙素端尾，當(dāng)納入到木質(zhì)素末端鏈中時(shí)這些新的單體木質(zhì)醇應(yīng)阻礙聚合物的進(jìn)一步聚合并且作用為縮合終止子或終止劑分子。有趣的是，轉(zhuǎn)基因植物也顯示出較高含量的常規(guī)H-單元(+30%)，其優(yōu)選分布為木質(zhì)素中的端基并且在成木質(zhì)素尺寸和結(jié)構(gòu)的改變(Lapierre, 2010 ；Ziebell等，2010)。另外，過量產(chǎn)生C6C1單體木質(zhì)醇并且具有與野生型植物相似的木質(zhì)素含量的植物顯示出較低的硫代酸解釋放的單體木質(zhì)醇，表明用于聚合物延伸的在木質(zhì)素末端鏈中自由苯丙素端尾的可及性的降低。也表明較高的碳-碳連接和增加的木質(zhì)素縮合度。
[0169]假定在木質(zhì)素中端基單元的較高納入會阻礙更常見的鏈延伸并且最終降低木質(zhì)素支化和聚合度。這種假設(shè)進(jìn)一步得到在過量產(chǎn)生這些“終止劑’’分子的植物中木質(zhì)素多分散性的分析的支持，其顯示高分子量的明顯降低和低分子量的明顯增加，因此支持較小的木質(zhì)素鏈長度。這些觀察對于理解來自HCHL品系的生物質(zhì)對于多糖酶促水解的較高易感性是相關(guān)的。雖然，通過細(xì)胞壁的幾個(gè)特征確定生物質(zhì)的糖化效率，在不同的預(yù)處理后觀察到的糖化效率的改善表明較低分叉的木質(zhì)素會減少細(xì)胞壁多糖(纖維素和半纖維素)的交聯(lián)和包埋并且有利于它們與水解酶的可及性。這個(gè)假設(shè)由以下實(shí)施支持，即在過量產(chǎn)生這些C6C1單體的植物的細(xì)胞壁中總糖含量不變。
[0170]可推測出在植物體內(nèi)能使用木質(zhì)化“終止劑’ ’分子的過量表達(dá)來修飾木質(zhì)素結(jié)果以減少木質(zhì)纖維素生物是的頑固性。由于這個(gè)方法不需要任意特定的遺傳背景，其應(yīng)易于轉(zhuǎn)化到各種能源作物中。限制這些木質(zhì)化“終止劑’’分子在支承木質(zhì)化組織(例如，厚壁組織(schlerenchyma)纖維)中的生物合成并且避免在傳導(dǎo)組織(例如，導(dǎo)管)中強(qiáng)產(chǎn)生應(yīng)該限制了對植物發(fā)育和生物質(zhì)產(chǎn)生不利影響的風(fēng)險(xiǎn)。
[0171]實(shí)施例2:在水稻中細(xì)菌HCHL的表達(dá)
[0172]這個(gè)例子說明在單子葉植物，水稻中細(xì)菌HCHL的表達(dá)。用實(shí)施例1所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化水稻植物。水稻品系經(jīng)過人工改造(圖12)表達(dá)HCHL基因，如RT-PCR所證明(圖13)。另外，水稻品系的評價(jià)證明它們積累PHBA(對羥基苯甲酸酯)(圖14)，其由HCHL從對-香豆酰-輔酶A的轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生。
[0173]這個(gè)實(shí)驗(yàn)還證明來自雙子葉植物的次生細(xì)胞壁啟動(dòng)子pIRX5(在這個(gè)實(shí)施例中為擬南芥)能夠用于單子葉植物(在這個(gè)實(shí)施例中為水稻)。
[0174]應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解據(jù)此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請的主旨和權(quán)益以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。通過引用將本文引用的所有發(fā)表物、專利、登錄號和專利申請全部納入本文用于所有目的。
[0175]參考文獻(xiàn)
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[0270]SEQ ID NO:2
[0271]編碼SEQ ID NO:1的多核苷酸序列(由GenScript進(jìn)行密碼子優(yōu)化)
[0272]ATGTCTACTTACGAGGGAAGATGGAAGACTGTTAAGGTTGAGATCGAGGATGGAATCGCTTTCGTTATCCTCAACAGACCTGAGAAGAGAAACGCTATGTCTCCTACTCTCAACAGAGAGATGATCGATGTTCTCGAGACTCTCGAGCAGGATCCTGCTGCTGGAGTTCTCGTTCTCACTGGAGCTGGAGAGGCTTGGACTGCTGGTATGGATCTCAAGGAGTACTTCAGAGAGGTTGATGCTGGACCTGAGATCCTCCAGGAGAAGATCAGAAGAGAGGCTTCTCAGTGGCAGTGGAAGCTCCTCAGAATGTACGCTAAGCCTACTATCGCTATGGTTAACGGATGGTGCTTCGGAGGAGGATTCTCTCCTCTCGTTGCTTGCGATCTCGCTATCTGCGCTGATGAGGCTACTTTCGGACTCTCTGAGATCAACTGGGGAATCCCTCCTGGAAACCTCGTTTCTAAGGCTATGGCTGATACTGTTGGACATAGACAGTCTCTCTACTACATCATGACTGGAAAGACTTTCGGAGGACAGAAGGCTGCTGAGATGGGACTCGTTAACGAGTCTGTTCCTCTCGCTCAGCTCAGAGAGGTTACTATCGAGCTCGCTAGAAACCTCCTCGAGAAGAACCCTGTTGTTCTCAGAGCTGCTAAGCATGGATTCAAGAGATGCAGAGAGCTCACTTGGGAGCAGAACGAGGATTACCTCTACGCTAAGCTCGATCAGTCTAGACTCCTCGATACTGAGGGAGGAAGAGAGCAGGGTATGAAGCAGTTCCTCGATGATAAGTCTATCAAGCCTGGACTCCAGGCTTACAAGAGA[0273]SEQ ID NO:3
[0274]含有IRX5啟動(dòng)子(pIRX5)的多核苷酸序列
[0275]ATGAAGCCATCCTCTACCTCGGAAAAACTTGTTGCGAGAAGAAGACATGCGATGGCATGGATGCTTGGATCTTTGACATTGATGACACTCTTCTCTCAACCATTCCTTACCACAAGAGCAACGGTTGTTTCGGGTAAATAAACTAAACTTAACCATATACATTAGCCTTGATTCGGTTTTTGGTTTGATTTATGGATATTAAAGATCCGAATTATATTTGAACAAAAAAAAATGATTATGTCACATAAAAAAAAATTGGCTTGAATTTTGGTTTAGATGGGTTTAAATGTCTACCTCTAATCATTTCATTTGTTTTCTGGTTAGCTTTAATTCGGTTTAGAATGAAACCGGGATTGACATGTTACATTGATTTGAAACAGTGGTGAGCAACTGAACACGACCAAGTTCGAGGAATGGCAAAATTCGGGCAAGGCACCAGCGGTTCCACACATGGTGAAGTTGTACCATGAGATCAGAGAGAGAGGTTTCAAGATCTTTTTGATCTCTTCTCGTAAAGAGTATCTCAGATCTGCCACCGTCGAAAATCTTATTGAAGCCGGTTACCACAGCTGGTCTAACCTCCTTCTGAGGTTCGAATCATATTTAATAACCGCATTAAACCGAAATTTAAATTCTAATTTCACCAAATCAAAAAGTAAAACTAGAACACTTCAGATAAATTTTGTCGTTCTGTTGACTTCATTTATTCTCTAAACACAAAGAACTATAGACCATAATCGAAATAAAAACCCTAAAAACCAAATTTATCTATTTAAAACAAACATTAGCTATTTGAGTTTCTTTTAGGTAAGTTATTTAAGGTTTTGGAGACTTTAAGATGTTTTCAGCATTTATGGTTGTGTCATTAATTTGTTTAGTTTAGTAAAGAAAGAAAAGATAGTAATTAAAGAGTTGGTTGTGAAATCATATTTAAAACATTAATAGGTATTTATGTCTAATTTGGGGACAAAATAGTGGAATTCTTTATCATATCTAGCTAGTTCTTATCGAGTTTGAACTCGGGTTATGATTATGTTACATGCATTGGTCCATATAAATCTATGAGCAATCAATATAATTCGAGCATTTTGGTATAACATAATGAGCCAAGTATAACAAAAGTATCAAACCTATGCAGGGGAGAAGATGATGAAAAGAAGAGTGTGAGCCAATACAAAGCAGATTTGAGGACATGGCTTACAAGTCTTGGGTACAGAGTTTGGGGAGTGATGGGTGCACAATGGAACAGCTTCTCTGGTTGTCCAGTTCCCAAGAGAACCTTCAAGCTCCCTAACTCCATCTACTATGTCGCCTGATTAAATCTTATTTACTAACAAAACAATAAGATCAGAGTTTCATTCTGATTCTTGAGTCTTTTTTTTCTCTCTCCCTCTTTTCATTTCTGGTTTATATAACCAATT`CAAATGCTTATGATCCATGCATGAACCATGATCATCTTTGTGTTTTTTTTTCCTTCTGTATTACCATTTTGGGCCTTTGTGAAATTGATTTTGGGCTTTTGTTATATAATCTCCTCTTTCTCTTTCTCTACCTGATTGGATTCAAGAACATAGCCAGATTTGGTAAAGTTTATAAGATACAAAATATTAAGTAAGACTAAAGTAGAAATACATAATAACTTGAAAGCTACTCTAAGTTATACAAATTCTAAAGAACTCAAAAGAATAACAAACAGTAGAAGTTGGAAGCTCAAGCAATTAAATTATATAAAAACACTAACTACACTGAGCTGTCTCCTTCTTCCACCAAATCTTGTTGCTGTCTCTTGAAGCTTTCTTATGACACAAACCTTAGACCCAATTTCACTCACAGTTTGGTACAACCTCAGTTTTCTTCACAACAAATTCAAACATCTTACCCTTATATTACCTCTTTATCTCTTCAATCATCAAAACACATAGTCACATACATTTCTCTACCCCACCTTCTGCTCTGCTTCCGAGAGCTCAGTGTACCTCGCC
[0276]SEQ ID NO:4
[0277]星箭頭菌_E_37_ZP_01746375 (氨基酸序列)
[0278]MTATEATLPANDPDLS⑶NVAVAFEDGIAWVKLNRPEKRNAMSVSLAEDMNVVLDKLEIDDRCGVLVLTGEGSAFSAGMDLKDFFRATDGVSDVERMRAYRSTRAWQWRTLMHYSKPTIAMVNGWCFGGAFTPLICCDLAISSDDAVYGLSEINWGIIPGGVVSKAISTLMSDRQALYYVMTGEQFGGQEAVKLGLVNESVPADKLRERTVELCKVLLEKNPTTMRQARMAYKYIREMTffEESAEYLTAKGDQTVFVDKEKGREQGLKQFLDDKTYRPGLGAYKR
[0279]SEQ ID NO:5
[0280]紅色糖多孢菌_NRRL_2338_YP_001105000 (氨基酸序列)
[0281]MSTPTTDPGTTTTPWGDTVLVDFDDGIAWVTLNRPEKRNAMNPAMNDEMVRTLDALEADPRCRVMVLTGAGESFSAGMDLKEYFREVDQTADPSVQIRVRRASAEWQWKRLAHWSKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVACDLAISDEEARYGLSEINWGIPPGGVVSRALAAAVSQRDALYFIMTGETFDGRRAEGMRLVNEAVPAERLRERTRELALKLASTNPVVLRAAKVGYKIAREMPWEQAEDYLYAKLEQSQFLDAERGREKGMAQFLDDKSYRPGLSAYSTD
[0282]SEQ ID NO:6
[0283]S01ibacter_usitatus_Ellin6076_YP_821552 (氨基酸序列)
[0284]MDQYEEKffQTVKVEVDAEGIAWVIFNRPAKRNAMSPTLNREMAQVLETLELDAAAKVLVLTGAGESWSAGMDLKEYFREVDGQPESHQEKIRREASLWQWKLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGAFSPLVACDLAIADEKAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAVADTMGHRKALHYIMTGETFTGAQAAEMGLVNAAVPTSELREATRTLALKLASKNPVILRAAKHGFKRCRELTWEQNEDYLYAKLDQALHRDPEDARAEGMKQFLDEKSIKPGLQSYKRS
[0285]SEQ ID NO:7
[0286]青枯雷爾氏菌_GMI1000_NP_521786(氨基酸序列)
[0287]MATYEGRffNTVKVDVEDGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNREMIDVLETLELDGDAQVLVLTGAGESWSAGMDLKEYFRETDGQPEMQERIRRDCSQWQWKLLRFYSKPTIAMVNGWCFGGAFSPLVACDLAIAADDAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAVADTMGHRAALHYIMTGETFTGREAAEMGLVNRSVPRERLREAVTELAGKLLAKNPVVLRYAKHGFKRCRELSWEQNEDYLYAKVDQSNHRDPEKGRQHGLKQFLDDKTIKPGLQTYKRA
[0288]SEQ ID NO:8
[0289]白紋黃單胞菌_YP_003377516 (氨基酸序列)
[0290]MSNYQDRWQTVQVQIDAGVAWVTLNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLETLELDSAAEVLVLTGAGESWSAGMDLKEYFREIDGKEEIVQERMRRDCSQWQWRLLRFYSKPTIAAVNGWCFGGAFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAVADTMGHRNAMLYIMTGRTFTGTEAAQMGLVNASVPRAQLRAEVTKLAQELQQKNPVVLRFAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKVDQSNHRDPEKGRQQGLKQFLDDKTIKPGLQTYKR
[0291]SEQ ID NO:9
[0292]鮑氏不動(dòng)桿菌_ATCC_17978_YP_001084143 (氨基酸序列)
[0293]MKMSYENRWETVDVKVEDGIAWVTLNRPEKKNAMSPTLNREMIDVLETLELDQNAKVLVLTGA⑶SWTAGMDLKEYFREVDTQPEIFQERIRRD SCRWQWQLLRMYSKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRASLYYIMTGKTFSGKEAETMGLVNKSVPLAQLKAEVTELANCLLEKNPVVLRTAKNGFKRCRELTWDQNEDYLYAKLDQCIHRDTENGRQEGLKQFLDEKSIKPGLQSYKRTG
[0294]SEQ ID NO:10
[0295]不動(dòng)桿菌屬_ADPI_YP_046390 (氨基酸序列)
[0296]MTYDKRWETVDVQVEHGIAWVTLNRPHKKNAMSPTLNREMIDVLETLELDSEAKVLVLTGAGDSWTAGMDLKEYFREVDAQPEIFQERIRRDSCRWQWQLLRMYSKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRASLYYIMTGKTFTGKEAEAMGLINKSVPLAQLKAEVTELAQCLVEKNPVVLRTAKNGFKRCRELTffDQNEDYLYAKLDQCNHRDTEGGRQEGLKQFLDEKSIKPGLQSYKRTG
[0297]SEQ ID NO:11
[0298]需鹽色鹽桿菌_DSM_3043_YP_572340 (氨基酸序列)
[0299]MSDYTNRffQTVKVDVEDGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLETIELDQDAHVLVLTGEGESFSAGMDLKEYFREIDASPEIVQVKVRRD ASTWQWKLLRHYAKPTIAMVNGWCFGGAFSPLVACDLAIAADESVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYIMTGETFTGPQAADMGLVNQSVPRAELRETTHKLAATLRDKNPVVLRAAKTGFKMCRELTffEQNEEYLYAKLDQAQQLDPEHGREQGLKQFLDDKSIKPGLESYRR
[0300]SEQ ID NO: 12
[0301]新洋蔥伯克霍爾德氏菌_AU_1054_ZP_04942909 (氨基酸序列)[0302]MSKYDNRWQTVEVKVEAGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNREMLEVLDAVEFDDEAKVLVLTGAGAAffTAGMDLKEYFREIDGGSDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYNKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADDAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRRALHYIMTGDTFTGAEAAEMGLVNSSVPLAELRDATIALAARLMDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKTIKPGLQAYKR
[0303]SEQ ID NO:13
[0304]不明確伯克霍爾德氏菌_MC40_6_YP_776799 (氨基酸序列)
[0305]MSKYDNRWQTVEVNVEAGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNQEMLQVLDAIEFDDDAKVLVLTGAGSAWTAGMDLKEYFREIDGGSDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYNKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRRALHYIMTGDTFTGVEAAEMGLVNSSVPLAGLRDATIALAARLMDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKAIKPGLQAYKR
[0306]SEQ ID NO:14
[0307]洋蔥伯克霍爾德氏菌_AMMD_YP_776799 (氨基酸序列)
[0308]MSKYDNRWQTVEVNVEAGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNQEMLQVLDAIEFDDDAKVLVLTGAGSAWTAGMDLKEYFREIDGGSDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYNKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRRALHYMIODTFTGVEAAEMGLVNSSVPLAGLRDATIALAARLMDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKAIKPGLQAYKR
[0309]SEQ ID NO: 15 [0310]泰國伯克霍爾德氏菌(Burkholderiathailandensis)_MSMB43_ZP_02468311 (氨基酸序列)
[0311 ] MSKYDNRWQTVEVKVEAGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNQEMLQVLDAIEFDDDAKVLVLTGAGTAWTAGMDLKEYFREIDGGPDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYGKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRCALHYIMTGDTFTGVEAADMGLVNRSVPLAELRDATIALAARLIDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKAIKPGLQAYKR
[0312]SEQ ID NO: 16
[0313]尤伯納伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaubonensis)_Bu_ZP_02382374(氨基酸序列)
[0314]MSKYENRWQTVEVKVEAGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNQEMLQVLDAIEFDDDAKVLVLTGAGAAWTAGMDLKEYFREIDGGPDALQEKVRRDASEWQWRRLRMYGKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRRALHYIMTGDTFTGVEAADMGLVNRSVPLAELRDATIALAARLIDKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQCEDYLYAKLDQAQLRDPERGREQGLKQFLDDKAIKPGLQAYKR
[0315]SEQ ID NO: 17
[0316]維涅蘭德固氮菌_Av0P_YP_002798614 (氨基酸序列)
[0317]MNKYEGRWKTVIVEIEGGIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNREMRDVLETLEQDPAARVLVLTGAGSAffTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREACEWQWKLLRMYAKPTVAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAICADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYIMTGKTFDGRQAAEMGLVNQSVPLAQLRETVATLCQDLLDKNPVVLRAAKNGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQ SRLLDEEGGREEGMRQFLDEKSIKPGLQAYKR
[0318]SEQ ID NO: 18
[0319]惡臭假單胞菌_KT2440_NP_745498 (氨基酸序列)
[0320]MSKYEGRWTTVKVELEAGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNREMVDVLETLEQDADAGVLVLTGAGESffTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREASQffQffKLLRLYAKPTIAMVNGffCFGGGF SPLVACDLAICANEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQSLYYIMTGKTFDGRKAAEMGLVNDSVPLAELRETTRELALNLLEKNPVVLRAAKNGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQSRLLDTTGGREQGMKQFLDDKSIKPGLQAYKR
[0321]SEQ ID NO:19
[0322]熒光假單胞菌_SBw25_YP_002872871 (氨基酸序列)
[0323]MSNYEGRWTTVKVEIEEGIAWVILNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLETLEQDPAAGVLVLTGAGEAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREASQWQWKLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAICADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQSLYYIMTGKTFGGQKAAEMGLVNESVPLAQLREVTIELARNLLEKNPVVLRAAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQSRLLDTEGGREQGMKQFLDDKSIKPGLQAYKR
[0324]SEQ ID NO:20
[0325]丁香假單胞菌_NP_792742 (氨基酸序列)
[0326]MSKYEGRWTTVKVEIEQGIAWVILNRPEKRNAMSPTLNREMIDVLETLEQDPEAGVLVLTGAGEAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRREASQWQWKLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAICADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQSLYYIMTGKTFDGKKAAEMGLVNESVPLAQLRQVTIDLALNLLEKNPVVLRAAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQSRLLDKEGGREQGMKQFLDDKSIKPGLEAYKR
[0327]SEQ ID NO:21
[0328]羅氏真養(yǎng)菌(Ralstoniaeutropha)_JMP 134—YP_299062 (氨基酸序列)`[0329]MANYEGRWKTVKVSVEEGIAWVMFNRPEKRNAMSPTLNSEMIQVLEALELDADARVVVLTGAGDAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRRDACQWQWKLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALHYMTCDTFTGQQAAAMGLVNKSVPRSQLREHVLELAGKLLEKNPVVLRAAKHGFKRSRELTffEQNEDYLYAKLDQAQLRDPEHGREQGLKQFLDDKSIKPGLQAYKRA
[0330]SEQ ID NO:22
[0331]莢殼伯克霍爾德氏菌_BGR1—YP_002908688 (氨基酸序列)
[0332]MSYEGRWTTVKVTVEAGIGWVVLNRPEKRNAMSPTLNKEMIDVLETLELDDEAQVLVLTGE⑶AWTAGMDLKEYFREVDAASDVVQERIRRDASRWQWQLLRMYSKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYIMTGDTFTGKQAAQMGLVNQSVPRAALREATVALAAKLLDKNPVVLRNAKHGFKRSRELTffEQNEDYLYAKLDQANYRDKEGGREKGLKQFLDDKSIKPGLQAYKR
[0333]SEQ ID NO:23
[0334]植物令伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaphytofirmans)_PsJN_YP_001887778 (氨基酸序列)
[0335]MSYEGRWKTVKVDVAEGIAWVSFNRPEKRNAMSPTLNKEMIEVLEAVELDAEAQVLVLTGEGDAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRRDACRWQWQLLRMYSKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEATFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYIMTGETFTGQEAAQMGLVNKSVPRAELREATRALAGKLLEKNPVVLRAAKHGFKRCRELTffDQNEDYLYAKLDQAQLRDPEGGREQGLKQFLDDKAIKPGLQTYKR
[0336]SEQ ID NO:24
[0337]鼻疽伯克霍爾德氏菌_ATCC_23344—YP_105383 (氨基酸序列)
[0338]MSYEGRWKTVEVIVDGAIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNAEMIDVLEAIELDPEARVLVLTGEGEAWTAGMDLKEYFREIDAGPEILQEKIRRDASRWQWQLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYIMTGETFTGAQAAQMGLVNRSVPRAQLRDAVRALAAKLLDKNPVVLRNAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQAQLRDPEHGREQGLKQFLDDKTIKPGLQAYRR
[0339]SEQ ID NO:25
[0340]類鼻疽伯克霍爾德氏菌_Pasteur_ZP_01765668 (氨基酸序列)
[0341]MSYEGRWKTVEVIVDGAIAWVTLNRPDKRNAMSPTLNAEMIDVLEAVELDPEARVLVLTGEGEAWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRRDASRWQWQLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYIMTGETFTGAQAAQMGLVNRSVPRAQLRDAVRALAAKLLDKNPVVLRNAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQAQLRDPEHGREQGLKQFLDDKTIKPGLQAYRR
[0342]SEQ ID NO:26
[0343]多噬伯克霍爾德氏菌_ATCC_17616—YP_001583186(氨基酸序列)
[0344]MSYEGRWKTVKVAVEGGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNAEMIDVLEAIELDPEAQVLVLTGE⑶AWTAGMDLKEYFREVDAGPEILQEKIRRDASRWQWQLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHRQALYYMTCDTFTGQQAAQMGLVNKSVPRAQLRDEVRALAAKLLDKNPVVIRNAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQANYRDPEGGREQGLKQFLDEKSIKPGLQAYKR
[0345]SEQ ID NO:27
[0346]越南伯克霍爾德氏菌_G4_YP_001116289(氨基酸序列)
[0347]MGYEGRWKTVK VEVAGGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNTEMIDVLEAIELDADAQVLVLTGE⑶AWTAGMDLKEYFREIDAGPEILQEKIRRDASRWQWQLLRMYAKPTIAMVNGWCFGGGFSPLVACDLAIAADEAVFGLSEINWGIPPGNLVSKAMADTVGHREALYYMTCDTFTGQQAARMGLVNKSVPRAQLRDEVRALAAKLLDKNPVVIRNAKHGFKRCRELTffEQNEDYLYAKLDQANYRDPEGGREQGLKQFLDDKSIKPGLQAYKR
[0348]SEQ ID NO:28
[0349]鞘脂單胞桿菌(Sphingobiumjaponicum)_UT26s_YP_003543683 (氨基酸序列)
[0350]MSEYLTEGPDLSRTCVDVMFDEGIAWVTLNRPEKRNAMSPTLNSEMLAILEQLELDPRCGVVVLTGAGDSFSAGMDLKEYFRETDGLPPAQVRRIRQTAQAWQWRTLQHFGKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVACDLAIAANEAVFGLSEINWGIIPGGNVTKAIQERLRPQDAALYIMTGRNFTGEKAAQMGLVAEAVPLTDLRDHTRALALELLSKNPVVLNAAKIALKKVADMTWDVAEDYLVAKGAQTRVADKTDGRNKGITQFLDEKSYKPGLEGYRRDK
[0351]SEQ ID NO:29
[0352]地毯草黃單胞菌_NP_641235 (氨基酸序列)
[0353]MNEHDVVSVRIENRIAWVKFARPDKRNAMSPALNRRMMDVLDELEFDDNVGVLVLGGEGTAWSAGMDLKEYFRETEAQGLRGVRRSQRESYGWFRRLRWYQKPTIAMVNGWCFGGGFGPLFACDLAIAADEAQFGLSEINWGILPGGGVTKVAVELLSMRDAMWMTLTGEMVDGKKAAEWRLVNESVPLERLEARTREVAELLLRKNPVALKYAKDAVRRVGTMTYDEAEDYLVRMQEAANSFDNNARKEGIRQFIDEKSYKPGLGEYDLSKHSA
[0354]SEQ ID NO:30
[0355]野油菜黃單胞菌_ATCC_33913_NP_636201 (氨基酸序列)
[0356]MNEHDVVSVHVENRIAWVKFARPDKRNAMSPALNRRMLDVLDELEFDDNVGVLVLGGEGTAWSAGMDLKEYFRETEAQGLRGVRRSQRESYGWFRRLRWYQKPTIAMVNGWCFGGGFGPLFACDLAIAADEAQFGLSEINWGILPGGGVTKVAVELLSMRDAMWMTLTGELVDGRKAAEWRLVNESVPLERLETRTREVAELLLKKNPVALKYAKDAVRRVGTMTYDEAEDYLVRMQEAANSFDNNARKEGIRQFIDEKRYKPGLGAYEPDAGTN
[0357]SEQ ID NO:31
[0358]固氮螺菌屬_B510_YP_003451575 (氨基酸序列)[0359]MTQQQAAARTGTAEDVVTVELDNGVAWVTLNRPDKRNAMNPALNARMHGVLDDLEVDDRCQVLVLTGAGESFSAGMDLKEYFRETEAKGHMATRRAQRDSYGWWRRLRWFEKPSIAMVNGWCFGGAFSPLFACDLAVAADEAQFGLSEINWGIIPGGNVTKVVADLMS QREAMYYILTGETFDGRKAAEMKLVNFSVPHAELRAKVRAIADNLLEKNPQTLKAAKDAFKRVVEMPFDAAEDYLVVRQESLNYLDKSEGRKQGIKQFIDDKTYRPGLGAYKR
[0360]SEQ ID NO:32
[0361 ] 葡萄土壤桿菌_S4_YP_002549228 (氨基酸序列)
[0362]MTVAEKSDADTVLVDIEDRIAFVTFNRPEKRNAMNPALNIRMAEVLEELEADDRCGVLVLRGAGTSWSAGMDLQQYFRDNDDKPRHATLKSRRQSGGWWQRLTYFEKPTIAMVNGWCFGGAFNPLVACDLAIAANEATFGLSEINWGILPGGNVTRAVAEVMNHRDSLYYIMTGEPFGGEKARDMGLVNESVPLEELETRVRKLCASLLEKNPVTMKAAKDTFKRVRNMPffELADDYIYAKLEQMLLLDKTRGRDEGLKQFLDDKTYRPGLGAYKRK
[0363]SEQ ID NO:33
[0364]埃特里根瘤菌巴西變種(Rhizobiumetli Brasil)_5_YP_001985541 (氨基酸序列)
[0365]MTENTSPVLVEFDGGIAFVTLNRPEKRNAMNPALNARMLEVLDELE⑶ERCGVLVLRGAGQSWSAGMDLKEYFRDNDDKPRDATLKARRQSGGWWGRLMYFEKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVSCDLAIAAEEANFGLSEINWGILPGGNVTRAVAEVMRHRDALYYIMTGELFGGRKAAEMGLVNEAVPLVDLETRVRKICASLLEKNPVTLKAAKDTYKRVRNLPffDLADDYIYAKLEQMLFLDKTKGRDEGLKQFLDDKTYQPGLGAYKRGR
[0366]SEQ ID NO:34
[0367]豌豆根瘤菌三葉草生物變種_WSM1325_YP_002973001 (氨基酸序列)
[0368]MTEDKSPVLVEFDSGIAFVTLNRPEKRNAMNPALNIRMLEVLDELE⑶ERCGVLVLRGAGESWSAGMDLKEYFRDNDDKPRDVTLKARRQSGNWWGRLMYFEKPTIAMVNGWCFGGAFTPLVSCDLAIMEEANFGLSEINWGILPGGNVTRAVAEVMRHRDALYYIMTGELFGGRKAAEMGLVNEAVPLAELEPRVRKICASLLEKNPVTLKAAKDTYKRVRNLPffDLADDYIYAKLEQMLFLDKTKGRDEGLKQFLDDKTYQPGLGAYKRGR
[0369]SEQ ID NO:35
[0370]IRx5 的氨基酸序列(GenBank 登錄號 AF458083_1)
[0371]mepntmasfddehrhssfsakickvcgdevkdddngqtfvachvcvypvckpcyeyersngnkccpqcntlykrhkgspkiagdeenngpddsddelnikyrqdgssihqnfaygsengdynskqqcrpngrafsstgsvlgkdfeaerdgytdaewkervdkwkarqekrglvtkgeqtnedkeddeeeeIldaearqplwrkvpissskispyrivivlrIvilvfffrfriltpakdayplwlisviceiwfalswildqfpkwfpinretyIdrlsmrferdgeknklapvdvfvstvdplkeppiitantiI silavdypvnkvscyvsddgasmlIfdtlsetsefarrwvpfckkynveprapefyfsekidylkdkvqttfvkdrramkreyeefkvrinalvakaqkkpeegwvmqdgtpwpgnntrdhpgmiqvylgkegafdidgneIprlvyvsrekrpgyahhkkagamnamvrvsavltnapfmlnldcdhyinnskairesmcflmdpqlgkklcyvqfpqrfdgidhndryanrnivffdinmrgldgiqgpvyvgtgcvfnrpalygyeppvsekrkkmtcdcwpswiccccgggnrnhhkskssdssskkksgiksllsklkkknkkksddktmssysrkrsateaifdledieeglegydeleksslmsqknfekrfgmspvfiastlmengglpeatntsslikeaihviscgyeektewgkeigwiygsvtediltgfrmhcrgwksvycmpkrpafkgsapinlsdrlhqvlrwalgsveiffsrhcplwyawggklkilerlayintivypftsipllayctipavclltg kfiiptinnfasiwflalflsiiatailelrwsgvsindlwrneqfwviggvsahlfavfqgllkvlfgvdtnftvtskgasdeadefgdlylfkwttllippttliilnmvgvvagvsdainngygswgplfgklffafwvivhlypflkglmgrqnrtptivvlwsillasifslvwvridpflpkqtgpllkqcgvdc
【權(quán)利要求】
1.一種包括與啟動(dòng)子可操作地連接的異源羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的工程改造的植物。
2.如權(quán)利要求1所述的工程改造的植物，其特征在于，所述啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求2所述的工程改造的植物，其特征在于，所述次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子是IRX5啟動(dòng)子。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述HCHL是熒光假單胞菌 HCHL。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述植物是單子葉植物。
6.如權(quán)利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述植物是雙子葉植物。
7.如權(quán)利要求1、2或3所述的工程改造的植物，其特征在于，所述植物選自擬南芥、楊樹、桉樹、7K稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘鹿、松樹、苜猜、小麥、大豆、大麥、草皮草、煙草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳樹和短柄草。
8.一種來自權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的植物細(xì)胞。
9.來自權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的植物的部分。
10.來自權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的植物的種子、花、葉或果實(shí)。
11.包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的植物或權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的植物的部分的生物質(zhì)?！?br> 12.一種包括編碼羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)和異源啟動(dòng)子的多核苷酸的分離的表達(dá)盒，所述啟動(dòng)子可操作地與所述多核苷酸序列連接，其中所述啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子。
13.如權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述HCHL是熒光假單胞菌HCHL。
14.如權(quán)利要求12或13所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述啟動(dòng)子是IRX5啟動(dòng)子。
15.包含權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述表達(dá)盒的植物細(xì)胞。
16.一種工程改造具有降低木質(zhì)化的植物的方法，所述方法包含: (1)將編碼羥基肉桂?；?輔酶A水合酶-裂解酶(HCHL)的多核苷酸導(dǎo)入植物中，其中在所述植物中的所述多核苷酸與啟動(dòng)子可操作地連接；以及 (2)在所述HCHL表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物，從而降低所述植物中的木質(zhì)化。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子對于所述植物是異源的。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子對于所述植物是內(nèi)源的。
19.如權(quán)利要求16、17或18所述的方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子是次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述次生細(xì)胞壁特異性啟動(dòng)子是IRX5啟動(dòng)子。
21.如權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述HCHL是熒光假單胞菌HCHL。
22.如權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述植物是單子葉植物。
23.如權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述植物是雙子葉植物。
24.如權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述植物選自擬南芥、楊樹、桉樹、7jC稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒、甘蔗、松樹、苜蓿、小麥、大豆、大麥、草皮草、煙草、大麻、竹子、油菜、向日葵、柳樹和短柄草。
25.一種得到可溶性糖的方法，所述方法包含將權(quán)利要求11所述的生物質(zhì)在糖化反應(yīng)中孵 育。
【文檔編號】A01H5/00GK103827299SQ201280044622
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月13日
【發(fā)明者】D·洛克, A·G·尤德斯 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會