專利名稱：一株用于防治煙蚜的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株用于防治煙蚜的菌株，即一株來自海洋褐藻的小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina)菌株，以及從該菌株中得到的次生小分子化合物的混合物；本發(fā)明的菌株和其代謝產(chǎn)物可應(yīng)用在煙蚜防治方面。
背景技術(shù)：
隨著人們對(duì)自身健康和生存環(huán)境關(guān)注程度的日益增強(qiáng)，傳統(tǒng)的害蟲化學(xué)防治措施所帶來的弊端，已經(jīng)引起人們的極大重視?；瘜W(xué)農(nóng)藥泛濫使用導(dǎo)致環(huán)境中農(nóng)藥殘留的增加，病蟲抗藥性的增強(qiáng)和病蟲的再度猖獗等問題最為突出。隨著世界各國對(duì)化學(xué)農(nóng)藥所帶來的種種社會(huì)問題、環(huán)境問題、以及人類健康問題的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，越來越多的化學(xué)農(nóng)藥被限制使用或禁止使用。生物農(nóng)藥作為一種低毒、低殘留，并且病蟲害不易產(chǎn)生抗藥性 的新型農(nóng)藥，自然就成為現(xiàn)代農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)關(guān)注并試圖開發(fā)的熱點(diǎn)，其研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化也成為國家的戰(zhàn)略需求。微生物農(nóng)藥是生物農(nóng)藥的重要一類，包括農(nóng)用抗生素和活體微生物農(nóng)藥。微生物農(nóng)藥是從天然產(chǎn)物中分離純化出來的，可以直接作用于病蟲害防治，也可以作為先導(dǎo)化合物合成新的農(nóng)藥。這些農(nóng)藥既可以保留原有生物活性物質(zhì)的低毒、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了某些天然產(chǎn)物的穩(wěn)定性差、活性不高等不足，使得生物活性物質(zhì)的潛力得到充分挖掘。真菌是開發(fā)微生物農(nóng)藥的重要資源，世界各國投入了大量的科研力量予以研究。目前已經(jīng)注冊的以陸生真菌或其代謝產(chǎn)物為有效成分的生物農(nóng)藥達(dá)70余種，這些微生物農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于防治植物病害、蟲害和田間雜草。我國在應(yīng)用和基礎(chǔ)研究方面也取得了十分突出的成績。盡管我國當(dāng)前生物農(nóng)藥的產(chǎn)量僅占農(nóng)藥總產(chǎn)量的9%，但從人類長遠(yuǎn)利益角度考慮和農(nóng)藥發(fā)展趨勢來看，生物農(nóng)藥的發(fā)展?jié)摿κ志薮?。海洋真菌來源于海洋環(huán)境，并不是陸地生物的寄生菌，在直接以微生物活體作為有效殺蟲劑或殺菌成分的生物農(nóng)藥開發(fā)模式面前，海洋真菌于陸地真菌相比，沒有優(yōu)勢可言，但在以微生物代謝為有效成分的農(nóng)藥開發(fā)模式下，海洋真菌卻具有很大優(yōu)勢。海洋真菌的生存環(huán)境比較苛刻(高鹽、高壓、缺氧、低營養(yǎng)、無光照等)，為求得生存空間，它們在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特的次生代謝物質(zhì)，特別是海洋動(dòng)植物共附生真菌，為爭取自身的最大生存，通過分泌具有各種生物活性的代謝物來積極地參與動(dòng)植物的代謝活動(dòng)，在動(dòng)植物的抗感染、抗吞噬的生態(tài)防衛(wèi)中發(fā)揮了重要的作用，被認(rèn)為是篩選抗生素的最佳對(duì)象。從海洋真菌中分離得到的新化合物70%-80%具有各種各樣的生物活性，也已引起化學(xué)家和生物學(xué)家的極大關(guān)注，種類包括萜類、肽類、生物堿、酮類以及酯類化合物，其中有很多是某些殺蟲劑、殺菌劑的有效成分或前體物質(zhì)。關(guān)于海洋真菌次生代謝物的功能與用途，研究者較多的關(guān)注于治療人類疾病的醫(yī)用藥物的開發(fā)，海洋真菌代謝物農(nóng)用殺蟲、殺菌功能的研究較少。煙姆Myzus persicae (Sulzer)屬同翅目姆科,是重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一,可為害煙草、十字花科蔬菜、桃樹等多種植物，同時(shí)也是黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種植物病毒的傳播媒介。目前，煙蚜的防治最有效的方法仍是化學(xué)防治，同時(shí)也有諸多有關(guān)生物防治方法的成功應(yīng)用(例如天敵煙蚜繭蜂的繁殖和釋放等)，但對(duì)于利用海洋微生物次生代謝物來探索開發(fā)煙蚜生物制劑還未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)將從生物防治方面進(jìn)行探索，篩選對(duì)煙蚜有毒殺活性的海洋真菌菌株，為將來利用這些菌株及其次生代謝產(chǎn)物開發(fā)生物制劑防治煙姆提供研究基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株用于防治煙蚜的菌株，即一株來自海洋褐藻的小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina)菌種及其在煙姆生物防治中的應(yīng)用，同時(shí)將篩選的可產(chǎn)生對(duì)煙蚜有生物活性次生代謝物的菌株應(yīng)用到煙蚜的生物防治中，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的來自海洋褐藻的小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina) mfzl9菌株，已于2012年11月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為=CGMCC NO. 6859。mfzl9菌株的生長溫度范圍為25 30°C，最佳生長溫度為28°C ;最適pH值為
10.O ;使用的培養(yǎng)基為PDA海水培養(yǎng)基。本發(fā)明篩選的mfzl9菌株用于防治煙蚜，也可用來制備具有防治煙蚜功能的制
品O本發(fā)明的mfzl9菌株的代謝產(chǎn)物，其制備方法如下I)首先將mfzl9菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液中培養(yǎng)基去掉，獲得的菌體中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃?。粚⑤腿∫盒D(zhuǎn)蒸發(fā)后制成浸膏；2)取DlOl大孔吸附樹脂，先用去離子水洗凈，再用無水乙醇洗至液體不渾濁；將處理后的DlOl大孔吸附樹脂上柱后，用氫氧化鈉洗至中性，再用鹽酸洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性后，將步驟I)制備的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去離子水混合，用大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附24 h，然后用無水乙醇梯度洗脫，洗脫液減壓濃縮獲得mfzl9菌株的代謝產(chǎn)物。上述的代謝產(chǎn)物用于防治煙蚜。本發(fā)明獲得的對(duì)煙蚜有生物活性的mfzl9菌株，可應(yīng)用于煙草上煙蚜的防治，采用微量點(diǎn)滴法對(duì)煙蚜的生物測定表明，其發(fā)酵液中次生代謝物對(duì)煙蚜的致死率最高可達(dá)92. 9%。采用GC/MS進(jìn)行化學(xué)分析和結(jié)構(gòu)鑒定后，次生代謝物包括有9種主要化合物，其中酯類化合物4種、酸類化合物2種，肼類化合物、脲類化合物、醇類化合物各I種。對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用研究表明，抑制率最高可達(dá)76. 45%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的菌株進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、小不整球殼屬 Plectosphaerella cucumerina mfzl9 菌株的篩選將從山東省青島市黃島銀沙灘采集的褐藻用70%的酒精浸泡30s，切成O. 5cm的長條，將切成長條的褐藻置于PDA培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基配制方法馬鈴薯去皮，200g切成小塊，加海水I L煮沸30min，4-6層紗布過濾，加20g葡萄糖，溶解，用蒸餾水補(bǔ)充失去的水分。固體培養(yǎng)基則加入1. 5-2%的瓊脂，121°C，高壓滅菌20min。)在28°C下進(jìn)行培養(yǎng)，單斑分離純化獲得了 mfzl9菌株。經(jīng)18s rDNA ITS基因序列分析鑒定為小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina)。二、mfzl9菌株的形態(tài)、理化參數(shù)l、mfzl9菌株的形態(tài)特征顯微鏡下觀察，mfzl9菌株菌絲分枝，有隔膜，寬約I 孢子紡錘形，有橫隔，長約6 8Mm,寬約2 3Mm,無色。2、培養(yǎng)條件
mfzl9菌株在PDA平板上培養(yǎng)后，菌落呈乳白色至淺粉色，邊緣較整齊，后期部分產(chǎn)生黑色顆粒狀的物質(zhì)。在PDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后菌體呈球狀。mfzl9菌株的最適生長溫度28°C，最佳PH值10，最佳培養(yǎng)時(shí)間8d，最適培養(yǎng)基為海水PDA培養(yǎng)基。3、次生代謝活性物質(zhì)的分離純化將篩選出的活性菌株mfzl9接種到PDA培養(yǎng)基上純化，挑取單菌落保存于試管中的培養(yǎng)基斜面上。挑取培養(yǎng)基平板上生長良好的單一菌落接種到液體PDA培養(yǎng)基中，于28°C，120 rpm，培養(yǎng)8d。用多層滅菌紗布過濾，棄去渣滓。用等量于發(fā)酵液體積的乙酸乙酯反復(fù)萃取三次，收集有機(jī)相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至浸膏，有機(jī)相濃縮溫度控制在50。。。取適量的DlOl大孔吸附樹脂先用去離子水洗凈，再用無水乙醇洗至液體不渾濁。濕法上柱，用2%鹽酸洗至中性，再用2%氫氧化鈉洗至流出液呈堿性，去離子水洗至中性，待用。將樣品液上柱，靜態(tài)吸附24小時(shí)。用無水乙醇梯度洗脫，比例(無水乙醇/水)分別為1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1、10/0。將上述洗脫液混合置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸餾，得到的物質(zhì)用少量丙酮洗脫收集，室溫蒸發(fā)，作為生物測定待測液。用毛細(xì)管滴定法對(duì)煙蚜進(jìn)行生物測定，對(duì)生測結(jié)果較好的洗脫液蒸餾所得物用丙酮洗脫液收集，用GC/MS測定成分。GC/MS測定條件色譜柱DB_5MS型彈性石英毛細(xì)管柱(30 mXO. 25 _X0. 25 μπι)。初始柱溫50°C，保持2分鐘，以5°C /min升溫至280°C，保持2min ;氣化室溫度250°C;載氣為高純He(99. 999%);柱前壓為7. 62psi，載氣流量為1. OmL/min ;進(jìn)樣量I μ L ;分流比40 :1。質(zhì)譜條件EI源為尚子源；尚子源溫度230 C ;倍增器電壓2047V ;接口溫度2800C ;溶劑延遲3min ;全掃描方式，掃描范圍IOamu 550amu。按照上述條件對(duì)濃縮提取物進(jìn)行分離鑒定，通過HPMSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)人工檢索，進(jìn)行物質(zhì)鑒定，共檢出41種物質(zhì)，通過HPMSD化學(xué)工作站，經(jīng)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照進(jìn)行物質(zhì)鑒定，共得到9種主要化合物，其中酯類化合物4種、酸類化合物2種，肼類化合物、脲類化合物、醇類化合物各I種。對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用研究表明，抑制率最高可達(dá)76. 45%。三、小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina ) mfzl9菌株在煙姆生物防治中的應(yīng)用實(shí)施例1菌株mfzl9發(fā)酵液對(duì)煙蚜的田間防效實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株mfzl9進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)，8 d后收集發(fā)酵液，經(jīng)8層紗布濾去菌體，取發(fā)酵上清液進(jìn)行田間防效實(shí)驗(yàn)。在煙田煙蚜發(fā)生高峰期，用IL噴霧器將發(fā)酵上清液均勻噴霧于煙株上部有蚜葉片正反面。噴霧前調(diào)查蟲口基數(shù)，噴霧后第1，3，7d各調(diào)查一次剩余的活蟲數(shù)量，根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算發(fā)酵上清液第l，3，7d對(duì)煙蚜的校正防效，分別為82. 98%，86. 48%，49. 21%。結(jié)果表明菌株mfzl9發(fā)酵上清液對(duì)煙蚜有一定的田間防治效果。實(shí)施例2菌株mfzl9次生代謝活性物質(zhì)對(duì)煙蚜的生物測定對(duì)菌株mfzl9進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)，8 d后收集發(fā)酵液，經(jīng)8層紗布濾去菌體，等量乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相蒸餾，得到的物質(zhì)用5 mL丙酮洗脫轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，室溫蒸發(fā)至液面不再下降時(shí)作為生測液備用。選取帶有10 15頭蚜蟲的煙葉置于培養(yǎng)皿中。用丙酮將待測液稀釋為5個(gè)濃度梯度，分別為500 μ /αΙ,250 PL/mL、125 PL/mL、62. 5PL/mL、31. 25 PL/mL，選用0. 0776 PL的毛細(xì)管微量點(diǎn)滴器，采用點(diǎn)滴法進(jìn)行點(diǎn)滴測定，設(shè)置丙酮作為對(duì)照，每處理重復(fù)4次，24 h后調(diào)查統(tǒng)計(jì)蚜蟲死亡數(shù)量，計(jì)算LC5tlt5
生物測定結(jié)果表明菌株mfzl9發(fā)酵液提取物中的活性成分對(duì)煙蚜有較高毒性，濃度越高殺蟲率也越高，在處理濃度為500 PL/mL時(shí)殺蟲率可達(dá)92. 9%。通過DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到菌株mfzl9發(fā)酵液提取物對(duì)煙蚜的LC5tl為91. 4 PL/mL，毒力回歸方程為Υ=2· 15Χ+0. 79，95% 置信限為67. 22 116. 99。上述結(jié)果表明本發(fā)明篩選的mfzl9菌株對(duì)于煙蚜具有很好的防治效果，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一株小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina) mfzl9菌株,其保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6859。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株，其生長溫度范圍為25 30°C，最佳生長溫度為28°C;最適PH值為10. O ;使用的培養(yǎng)基為PDA海水培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1所述的菌株在防治煙蚜中的應(yīng)用。
4.用于防治煙蚜的制品，其特征在于，是用權(quán)利要求1所述的菌株制備的。
5.如權(quán)利要求4所述的用于防治煙蚜的制品，其特征在于是用如下的方法制備的 O首先將權(quán)利要求1所述的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后去掉培養(yǎng)液中渣滓，獲得的發(fā)酵液中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃??；將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后制成浸膏； 2)取DlOl大孔吸附樹脂，先用去離子水洗凈，再用無水乙醇洗至液體不渾濁；將處理后的DlOl大孔吸附樹脂上柱后，用氫氧化鈉洗至中性，再用鹽酸洗至流出液呈酸性，去離子水洗至中性后，將步驟I)制備的浸膏用甲醇溶解后，再用等量去離子水混合，用大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附24 h，然后用無水乙醇梯度洗脫，洗脫液減壓濃縮獲得mfzl9菌株的代謝產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株用于防治煙蚜的菌株，為來自海洋褐藻的小不整球殼屬(Plectosphaerella cucumerina) mfz19菌株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.6859。本發(fā)明獲得的對(duì)煙蚜有生物活性的mfz19菌株，可應(yīng)用于煙草上煙蚜的防治，采用毛細(xì)管滴定法對(duì)煙蚜的生物測定表明，其發(fā)酵液中次生代謝物對(duì)煙蚜的致死率最高可達(dá)92.9％。采用GC/MS進(jìn)行化學(xué)分析和結(jié)構(gòu)鑒定后，次生代謝物包括有9種主要化合物，其中酯類化合物4種，酸類化合物兩種，肼類化合物、脲類化合物、醇類化合物各1種。對(duì)煙蚜乙酰膽堿酯酶的抑制作用研究表明，抑制率最高可達(dá)76.45%。
文檔編號(hào)A01P7/04GK103013837SQ201210539539
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者王秀芳, 任廣偉, 王新偉, 陳丹, 陳福龍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所