專利名稱：控制害蟲(chóng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制害蟲(chóng)的方法，特別是涉及一種用在植物中表達(dá)的CrylF蛋白來(lái)控制大螟為害植物的方法。
背景技術(shù)：
大螟(Sesamia inferens)屬鱗翅目夜蛾科,為雜食性害蟲(chóng)，除為害玉米外,還為害水稻、甘蔗、高梁等禾本科作物，廣泛分布于我國(guó)中部與東南部，特別是陜西、河南以南的大部稻區(qū)。大螟幼蟲(chóng)蛀入作物莖內(nèi)為害,可造成枯心苗或整株死亡,其蛀孔一般較大,并有大量蟲(chóng)糞排出莖外，以低洼地及麥套玉米地發(fā)生重，且夏玉米發(fā)生重于春玉米。
玉米和高粱是中國(guó)重要的糧食作物，每年因大螟造成的糧食損失巨大，更甚者影響到當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治大螟，人們通常采用的主要防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。
農(nóng)業(yè)防治是把整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲(chóng)、環(huán)境因素、創(chuàng)造一個(gè)有利于作物生長(zhǎng)而不利于大螟發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。如利用處理大螟越冬寄主、改革耕作制度、種植抗大螟品種、種植誘集田和間作等措施降低大螟的為害。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局限性，不能作為應(yīng)急措施，在大螟爆發(fā)時(shí)就顯得無(wú)能為力。
化學(xué)防治即農(nóng)藥防治，是利用化學(xué)殺蟲(chóng)劑來(lái)殺滅害蟲(chóng)，是大螟綜合治理的重要組成部分，它具有快速、方便、簡(jiǎn)便和高經(jīng)濟(jì)效益的特點(diǎn)，特別是大螟大發(fā)生的情況下，是必不可少的應(yīng)急措施，它可以在大螟造成為害前將其消滅。目前化學(xué)防治方法主要有顆粒劑、撒毒土、藥液噴霧、封垛熏蒸秸桿垛內(nèi)越冬成蟲(chóng)等。但化學(xué)防治也有其局限性，如使用不當(dāng)往往會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對(duì)人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
生物防治是利用某些有益生物或生物代謝產(chǎn)物來(lái)控制害蟲(chóng)種群數(shù)量，以達(dá)到降低或消滅害蟲(chóng)的目的。其特點(diǎn)是對(duì)人、畜安全，對(duì)環(huán)境污染少，對(duì)某些害蟲(chóng)可達(dá)到長(zhǎng)期控制的目的；但是效果常不穩(wěn)定，并且不論大螟發(fā)生輕重均需同樣投資進(jìn)行。
為了解決農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲(chóng)害。CrylF殺蟲(chóng)蛋白是眾多殺蟲(chóng)蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的不溶性伴孢結(jié)晶蛋白。
CrylF蛋白被昆蟲(chóng)攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲(chóng)中腸的堿性pH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲(chóng)的消化過(guò)程，最終導(dǎo)致其死亡。
已證明轉(zhuǎn)CrylF基因的植株可以抵抗小地老虎等鱗翅目(Lepidoptera)害蟲(chóng)的侵害，然而，至今尚無(wú)關(guān)于通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)CrylF蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)控制大螟對(duì)植物為害的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種控制害蟲(chóng)的方法，首次提供了通過(guò)產(chǎn)生表達(dá)CrylF蛋白的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)控制大螟對(duì)植物為害的方法，且有效克服現(xiàn)有技術(shù)農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等技術(shù)缺陷。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種控制大螟害蟲(chóng)的方法，包括將大螟害蟲(chóng)與 CrylF蛋白接觸。
優(yōu)選地,所述CrylF蛋白為CrylFa蛋白。
進(jìn)一步地,所述CrylFa蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylFa蛋白的植物細(xì)胞中,所述大螟害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述植物細(xì)胞與所述CrylFa蛋白接觸。
更進(jìn)一步地,所述CrylFa蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylFa蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中,所述大螟害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylFa蛋白接觸，接觸后所述大螟害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大螟為害植物的控制。
所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
所述對(duì)大螟為害植物的控制不因種植地點(diǎn)的改變而改變。
所述對(duì)大螟為害植物的控制不因種植時(shí)間的改變而改變。
所述植物可以來(lái)自玉米、水稻、高粱、麥、粟、棉花、蘆葦、甘蔗、茭白、蠶豆或油菜。
所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylFa蛋白的多核苷酸的植物。
優(yōu)選地，所述CrylFa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。所述CrylFa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述植物還可以產(chǎn)生至少一種不同于所述CrylFa蛋白的第二種核苷酸。
進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過(guò)氧化物酶。
優(yōu)選地,所述第二種核苷酸可以編碼CrylAb蛋白、CrylAc蛋白、CrylBa蛋白或 Vip3A蛋白。
更進(jìn)一步地，所述第二種核苷酸包括SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中重要基因的dsRNA。
在本發(fā)明中，CrylF蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Cry 類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的殺蟲(chóng)毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物 (第I親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)CrylF蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。通過(guò)第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此在本發(fā)明中可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中特定基因的表達(dá)。
大螟(Sesamiainf erens)與小地老虎(Agrotis ypsilon Rottemberg)同屬鱗翅目夜蛾科，為雜食性害蟲(chóng)，但明顯嗜好禾本科，最常為害玉米、水稻、高粱、甘蔗等。盡管如此，大螟與小地老虎在生物學(xué)上是清晰的、截然不同的兩個(gè)物種，至少存在以下主要區(qū)別
I、分布區(qū)域不同。大螟廣泛分布于我國(guó)中部與東南部，特別是陜西、河南以南的大部稻區(qū)及西南玉米產(chǎn)區(qū)；除中國(guó)外，大螟在東南亞種植水稻、玉米及甘蔗的國(guó)家也有分布， 包括越南、老撾、印度等。而小地老虎是世界性的害蟲(chóng)，在我國(guó)各地也均有分布，尤以雨量豐富、氣候濕潤(rùn)的長(zhǎng)江流域和東南沿海發(fā)生量大，東北地區(qū)多發(fā)生在東部和南部濕潤(rùn)地區(qū)。
2、為害習(xí)性不同。大螟屬鉆蛀性害蟲(chóng)，幼蟲(chóng)蛀入作物莖內(nèi)為害，可造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般較大，并有大量蟲(chóng)糞排出莖外，多夾在葉鞘和莖桿之間，受害后的葉片、 葉鞘部都變?yōu)辄S色；剛孵化出的幼蟲(chóng)，不分散，群集葉鞘內(nèi)側(cè)，蛀食葉鞘和幼莖；幼蟲(chóng)3齡以后，分散遷害鄰株，可轉(zhuǎn)害5-6株不等，此時(shí)是大螟的嚴(yán)重為害期，早春10°C以上的溫度來(lái)得早，則大螟發(fā)生早；靠近村莊的低洼地及麥套玉米地發(fā)生重；春玉米發(fā)生偏輕，夏玉米發(fā)生較重。而小地老虎屬地下害蟲(chóng)，1-2齡幼蟲(chóng)晝夜均可群集于幼苗頂心嫩葉處取食為害；3 齡后分散，幼蟲(chóng)行動(dòng)敏捷、有假死習(xí)性、對(duì)光線極為敏感、受到驚擾即卷縮成團(tuán)，白天潛伏于表土的干濕層之間，夜晚出土從地面將幼苗植株咬斷拖入土穴、或咬食未出土的種子，幼苗主莖硬化后改食嫩葉和葉片及生長(zhǎng)點(diǎn)，食物不足或?qū)ふ以蕉瑘?chǎng)所時(shí)，有遷移現(xiàn)象；高齡幼蟲(chóng)剪苗率高，取食量大。
3、形態(tài)特征不同。
I)卵形態(tài)不同大螟的卵扁圓形，初白色后變灰黃色，表面具細(xì)縱紋和橫線，聚生或散生，常排成2-3行；而小地老虎的卵成饅頭形，具縱橫隆線，初產(chǎn)乳白色，漸變黃色，孵化前卵一頂端具黑點(diǎn)。
2)幼蟲(chóng)形態(tài)不同大螟末齡幼蟲(chóng)體長(zhǎng)約30mm，粗4頭紅褐色至暗褐色，腹部背面淡紫紅色，共5-7齡；而小地老虎幼蟲(chóng)圓筒形，老熟幼蟲(chóng)體長(zhǎng)37-50_，頭部褐色，具黑褐色不規(guī)則網(wǎng)紋，體灰褐至暗褐色，體表粗糙、布大小不一而彼此分離的顆粒，背線、亞背線及氣門(mén)線均黑褐色，前胸背板暗褐色，黃褐色臀板上具兩條明顯的深褐色縱帶，胸足與腹足黃褐色。
3)蛹形態(tài)不同大螟的蛹長(zhǎng)13-18mm，粗壯，紅褐色，腹部具灰白色粉狀物，臀棘有 3根鉤棘；而小地老虎的蛹長(zhǎng)18-24_，赤褐有光，口器與翅芽末端相齊，均伸達(dá)第4腹節(jié)后緣，腹部第4-7節(jié)背面前緣中央深褐色，且有粗大的刻點(diǎn)，兩側(cè)的細(xì)小刻點(diǎn)延伸至氣門(mén)附近，第5 - 7節(jié)腹面前緣也有細(xì)小刻點(diǎn)，腹末端具短臀棘I對(duì)。
4)成蟲(chóng)形態(tài)不同大螟成蟲(chóng)雌蛾體長(zhǎng)15mm，翅展約30mm，頭部、胸部淺黃褐色，腹部淺黃色至灰白色；觸角絲狀，前翅近長(zhǎng)方形，淺灰褐色，中間具小黑點(diǎn)4個(gè)排成四角形；雄蛾體長(zhǎng)約12mm,翅展27mm,觸角柿齒狀；而小地老虎成蟲(chóng)體長(zhǎng)17-23_、翅展40_54_ ,頭、 胸部背面暗褐色，足褐色，前足脛、跗節(jié)外緣灰褐色，中后足各節(jié)末端有灰褐色環(huán)紋，前翅褐色，前緣區(qū)黑褐色，外緣以內(nèi)多暗褐色，基線淺褐色，黑色波浪形內(nèi)橫線雙線，黑色環(huán)紋內(nèi)有一圓灰斑，腎狀紋黑色具黑邊、其外中部有一楔形黑紋伸至外橫線，中橫線暗褐色波浪形， 雙線波浪形外橫線褐色，不規(guī)則鋸齒形亞外緣線灰色、其內(nèi)緣在中脈間有三個(gè)尖齒，亞外緣線與外橫線間在各脈上有小黑點(diǎn)，外緣線黑色，外橫線與亞外緣線間淡褐色，亞外緣線以外黑褐色，后翅灰白色，縱脈及緣線褐色，腹部背面灰色。
4、生長(zhǎng)習(xí)性和發(fā)生規(guī)律不同。大螟一年發(fā)生2-4代，隨海拔的升高而減少，隨溫度的升高而增加。如云貴高原年生2-3代，江蘇、浙江年生3-4代，江西、湖南、湖北、四川年生 4代，福建、廣西及云南開(kāi)遠(yuǎn)年生4-5代，廣東南部、臺(tái)灣年生6-8代。在溫帶以老熟幼蟲(chóng)在寄生殘?bào)w(如茭白、水稻等作物莖桿或根茬)內(nèi)或近地面的土壤中越冬，次年3月中旬(氣溫高于10°C)開(kāi)始化蛹，15°C時(shí)羽化，4月上旬交尾產(chǎn)卵，3-5天達(dá)高峰期，4月下旬為孵化高峰期。成蟲(chóng)白天潛伏，常棲息在株間，傍晚開(kāi)始活動(dòng)，趨光性較弱，壽命5天左右。雌蛾交尾后2-3天開(kāi)始產(chǎn)卵，3-5天達(dá)高峰期，喜在玉米苗上和地邊產(chǎn)卵，多集中在玉米莖桿較細(xì)、葉鞘抱合不緊的植株靠近地面的第2節(jié)和第3節(jié)葉鞘的內(nèi)側(cè)，可占產(chǎn)卵量的80%以上。每雌可產(chǎn)卵240粒，卵歷期一代為12天，2、3代為5-6天；幼蟲(chóng)期一代約30天，二代約28天，三代約32天；蛹期為10-15天。雌蛾飛翔力弱，產(chǎn)卵較集中，靠近蟲(chóng)源的地方，蟲(chóng)口密度大， 為害重。而小地老虎一年發(fā)生3-4代，老熟幼蟲(chóng)或蛹在土內(nèi)越冬；早春3月上旬成蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)，一般在3月中下旬和4月上中旬會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)發(fā)蛾盛期；成蟲(chóng)白天不活動(dòng)，傍晚至前半夜活動(dòng)最盛，喜歡吃酸、甜、酒味的發(fā)酵物和各種花蜜，并有趨光性，幼蟲(chóng)共分6齡，1、2齡幼蟲(chóng)先躲伏在雜革或植株的心葉里，晝夜取食，這時(shí)食量很小，為害也不十分顯著；3齡后白天躲到表土下，夜間出來(lái)為害；5、6齡幼蟲(chóng)食量大增，每條幼蟲(chóng)一夜能咬斷菜苗4-5株，多的達(dá)10株以上；幼蟲(chóng)3齡后對(duì)藥劑的抵抗力顯著增加；3月底到4月中旬是第I代幼蟲(chóng)為害的嚴(yán)重時(shí)期；發(fā)生世代從10月到第2年4月都見(jiàn)發(fā)生和為害；西北地區(qū)二到三代，長(zhǎng)城以北一般年二到三代，長(zhǎng)城以南黃河以北年三代，黃河以南至長(zhǎng)江沿岸年四代，長(zhǎng)江以南年四到五代，南亞熱帶地區(qū)年六至七代；無(wú)論年發(fā)生代數(shù)多少，在生產(chǎn)上造成嚴(yán)重為害的均為第一代幼蟲(chóng)；南方越冬代成蟲(chóng)二月份出現(xiàn)，全國(guó)大部分地區(qū)羽化盛期在3月下旬至4月上、中旬，寧夏、內(nèi)蒙古為4月下旬；小地老虎成蟲(chóng)多在下午3時(shí)至晚上10時(shí)羽化，白天潛伏于雜物及縫隙等處，黃昏后開(kāi)始飛翔、覓食，3-4天后交配、產(chǎn)卵；卵散產(chǎn)于低矮葉密的雜草和幼苗上、少數(shù)產(chǎn)于枯葉、土縫中，近地面處落卵最多，每雌產(chǎn)卵800-1000粒、多達(dá)2000粒；卵期約5天左右，幼蟲(chóng)6齡、個(gè)別7-8齡，幼蟲(chóng)期在各地相差很大，但第一代約為30-40天；幼蟲(chóng)老熟后在深約5cm 土室中化蛹，蛹期約9-19天；高溫對(duì)小地老虎的發(fā)育與繁殖不利，因而夏季發(fā)生數(shù)量較少，適宜生存溫度為15°C -25°C ;冬季溫度過(guò)低，小地老虎幼蟲(chóng)的死亡率增高；凡地勢(shì)低濕，雨量充沛的地方，發(fā)生較多；頭年秋雨多、土壤濕度大、雜草叢生有利于成蟲(chóng)產(chǎn)卵和幼蟲(chóng)取食活動(dòng)，是第二年大發(fā)生的預(yù)兆；但降水過(guò)多，濕度過(guò)大，不利于幼蟲(chóng)發(fā)育， 初齡幼蟲(chóng)淹水后很易死亡；成蟲(chóng)產(chǎn)卵盛期土壤含水量在15-20%的地區(qū)為害較重；沙壤土， 易透水、排水迅速，適于小地老虎繁殖，而重黏土和沙土則發(fā)生較輕。
綜合上述，可確定大螟與小地老虎是兩種害蟲(chóng)，且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，無(wú)法交配產(chǎn)生后代。
本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對(duì)序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個(gè)核苷酸，一次讀三個(gè)可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開(kāi)放閱讀框(ORF)閱讀來(lái)形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和 PNA (肽核酸)。
本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明CrylFa基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明CrylFa基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說(shuō)這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)诔Ｒ?guī)的 “高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件， 例如，大約在45°C條件下用6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用 2. OXSSC洗滌，這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0父55(、501到高度嚴(yán)格條件的約0.2\55(、501。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65 0C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地， 本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0. 5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4發(fā)生特異性雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和1XSSC、0. 1%SDS各洗膜I次。
因此，具有抗蟲(chóng)活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4 雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65% 或 70% 同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的殺蟲(chóng)活性特征的部分和/片段(包括與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲(chóng)活性的等價(jià)蛋白的核苷酸序列。所述“等價(jià)蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗大螟害蟲(chóng)的生物活性的蛋白。
本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長(zhǎng)度可存在變化，但長(zhǎng)度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲(chóng)毒素。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以修飾基因和容易的構(gòu)建基因變異體。例如，本領(lǐng)域熟知制造點(diǎn)突變的技術(shù)。又例如美國(guó)專利號(hào)5605793描述了在隨機(jī)斷裂后使用DNA重裝配產(chǎn)生其它分子多樣性的方法?？梢允褂蒙虡I(yè)化核酸內(nèi)切酶制造全長(zhǎng)基因的片段，并且可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶諸如Bal31或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性內(nèi)切酶獲取編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些毒素的活性片段。
本發(fā)明可以從B. t.分離物和/或DNA文庫(kù)衍生出等價(jià)蛋白和/或編碼這些等價(jià)蛋白的基因。有多種方法獲取本發(fā)明的殺蟲(chóng)蛋白。例如，可以使用本發(fā)明公開(kāi)和要求保護(hù)的殺蟲(chóng)蛋白的抗體從蛋白質(zhì)混合物鑒定和分離其它蛋白。特別地，抗體可能是由蛋白最恒定和與其它B. t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通過(guò)免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或western印跡方法使用這些抗體專一地鑒定有特征活性的等價(jià)蛋白?？墒褂帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)程序容易的制備本發(fā)明中公開(kāi)的蛋白或等價(jià)蛋白或這類蛋白的片段的抗體。然后可以從微生物中獲得編碼這些蛋白的基因。
由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。 這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實(shí)質(zhì)上不影響殺蟲(chóng)活性的序列，亦包括保留殺蟲(chóng)活性的片段。
本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個(gè)甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個(gè)殘基長(zhǎng)。
保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill在 1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見(jiàn)的互換有 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)地，這種取代可以在對(duì)分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見(jiàn)，Cunningham 和 Wells, 1989, Science 244 1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，檢測(cè)所得突變分子的抗蟲(chóng)活性，從而確定對(duì)該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過(guò)其三維結(jié)構(gòu)的分析來(lái)測(cè)定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測(cè)定(參見(jiàn)，如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith 等，1992，J. Mol. Biol 224:899-904 ;Wlodaver 等，1992， FEBS Letters 309 :59_64)。
在本發(fā)明中，CrylF蛋白包括但不限于 CrylFa2、CrylFa3> CrylFb3> CrylFb6 或 CrylFb7蛋白，或者與上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且對(duì)大螟具有殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)片段或功能區(qū)域。
因此，與序列I和/或2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和 /或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。
本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列， 內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述CrylF蛋白的調(diào)節(jié)序列。
所述啟動(dòng)子為植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子的示例包括但不限于，來(lái)源于花椰菜花葉病毒的 35S啟動(dòng)子、Ubi啟動(dòng)子、水稻G0S2基因的啟動(dòng)子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組織特異的啟動(dòng)子，即該啟動(dòng)子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過(guò)常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定)，如PEP羧化酶啟動(dòng)子。備選地， 植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動(dòng)子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲(chóng)啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長(zhǎng)條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動(dòng)子。
所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號(hào)序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對(duì)受體蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的 CTPP靶向液泡。
所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列 (AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV) 增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹(shù)黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。
對(duì)于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子I、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對(duì)于雙子葉植物應(yīng)用而言， 所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-I內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級(jí)泛素”內(nèi)含子。
所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號(hào)序列，包括但不限于，來(lái)源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于豌豆 ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列和來(lái)源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列。
本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì)相連序列來(lái)說(shuō)需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動(dòng)子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示啟動(dòng)子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動(dòng)子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開(kāi)放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的。可以“有效連接”的核酸序列包括但不限于提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。
本發(fā)明中所述的“殺蟲(chóng)”是指對(duì)農(nóng)作物害蟲(chóng)是有毒的。更具體地，目標(biāo)昆蟲(chóng)是大螟害蟲(chóng)。
本發(fā)明中CrylF蛋白對(duì)大螟害蟲(chóng)具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是高粱和玉米， 在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含編碼CrylF蛋白的核苷酸序列，大螟害蟲(chóng)通過(guò)攝食植物組織與該蛋白接觸，接觸后大螟害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制并最終導(dǎo)致死亡。抑制是指致死或亞致死。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對(duì)化學(xué)或生物殺蟲(chóng)劑的需要(所述化學(xué)或生物殺蟲(chóng)劑為針對(duì)CrylF蛋白所靶向的大螟害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑)。
植物材料中殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICP)的表達(dá)水平可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進(jìn)行檢測(cè)，例如通過(guò)應(yīng)用特異引物對(duì)組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直接特異性檢測(cè)產(chǎn)生的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的量。
可以應(yīng)用不同的試驗(yàn)測(cè)定植物中ICP的殺蟲(chóng)效果。本發(fā)明中目標(biāo)昆蟲(chóng)主要為大螟。
本發(fā)明中，所述CrylF蛋白可以具有序列表中SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。除了包含CrylF蛋白的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
此外，包含編碼本發(fā)明CrylF蛋白的核苷酸序列的表達(dá)盒在植物中還可以與至10少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如 EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對(duì)除草劑茅草枯的抗性基因、對(duì)氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲(chóng)活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入植物，如將編碼所述CrylF蛋白的基因或表達(dá)盒或重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、 直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
本發(fā)明提供了一種控制害蟲(chóng)的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、內(nèi)因防治。現(xiàn)有技術(shù)主要是通過(guò)外部作用即外因來(lái)控制大螟害蟲(chóng)的為害，如農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治；而本發(fā)明是通過(guò)植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死大螟的CrylF蛋白來(lái)控制大螟害蟲(chóng)的，即通過(guò)內(nèi)因來(lái)防治。
2、無(wú)污染、無(wú)殘留?，F(xiàn)有技術(shù)使用的化學(xué)防治方法雖然對(duì)控制大螟害蟲(chóng)的為害起到了一定作用，但同時(shí)也對(duì)人、畜和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)了污染、破壞和殘留；使用本發(fā)明控制大螟害蟲(chóng)的方法，可以消除上述不良后果。
3、全生育期防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制大螟害蟲(chóng)的方法都是階段性的，而本發(fā)明是對(duì)植物進(jìn)行全生育期的保護(hù)，轉(zhuǎn)基因植物(CrylF蛋白)從發(fā)芽、生長(zhǎng)，一直到開(kāi)花、結(jié)果， 都可以避免遭受大螟的侵害。
4、全植株防治?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制大螟害蟲(chóng)的方法大多是局部性的，如葉面噴施；而本發(fā)明是對(duì)整個(gè)植株進(jìn)行保護(hù)，如轉(zhuǎn)基因植物(CrylF蛋白)的葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥、花絲等都是可以抵抗大螟侵害的。
5、效果穩(wěn)定。現(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲(chóng)劑需要直接噴施到作物表面，因此造成有活性的結(jié)晶蛋白(包括CrylF蛋白)在環(huán)境中被降解；本發(fā)明是使所述CrylF蛋白在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，有效地避免了生物殺蟲(chóng)劑在自然界不穩(wěn)定的缺陷，且本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物 (CrylF蛋白)的防治效果在不同地點(diǎn)、不同時(shí)間、不同遺傳背景也都是穩(wěn)定一致的。
6、簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)。現(xiàn)有技術(shù)使用的生物殺蟲(chóng)劑在環(huán)境中易被降解，因此需要重復(fù)生產(chǎn)和重復(fù)應(yīng)用，并為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)困難，大大地增加了成本；本發(fā)明只需種植能夠表達(dá)CrylF蛋白的轉(zhuǎn)基因植物即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財(cái)力。
7、效果徹底?，F(xiàn)有技術(shù)使用的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用；而本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物(CrylF蛋白)可以造成初孵大螟幼蟲(chóng)的大量死亡，且對(duì)小部分存活幼蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)度造成極大的抑制，3天后幼蟲(chóng)基本仍處于初孵狀態(tài)或介于初孵-陰性對(duì)照狀態(tài)之間，都是明顯的發(fā)育不良，且已停止發(fā)育，轉(zhuǎn)基因植物大體上只受到輕微損傷。
下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖I為本發(fā)明控制害蟲(chóng)的方法的含有CrylFa-Ol核苷酸序列的重組克隆載體 DBNOl-T構(gòu)建流程圖2為本發(fā)明控制害蟲(chóng)的方法的含有CrylFa-Ol核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100014構(gòu)建流程圖3為本發(fā)明控制害蟲(chóng)的方法的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種大螟的抗蟲(chóng)效果圖4為本發(fā)明控制害蟲(chóng)的方法的轉(zhuǎn)基因水稻植株接種大螟的抗蟲(chóng)效果圖。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明控制害蟲(chóng)的方法的技術(shù)方案。
第一實(shí)施例、CrylFa基因的獲得和合成
I、獲得CrylFa核苷酸序列
CrylFa-Ol殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(605個(gè)氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: I所示；編碼相應(yīng)于所述CrylFa-Ol殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(605個(gè)氨基酸)的CrylFa-Ol核苷酸序列(1818個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:3所示；CrylFa_02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(1148個(gè)氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；編碼相應(yīng)于所述CrylFa_02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(1148個(gè)氨基酸)的CrylFa-02核苷酸序列(3447個(gè)核苷酸)，如序列表中 SEQ ID NO:4 所示。
2、獲得CrylAb和Vip3A核苷酸序列
編碼CrylAb殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(615個(gè)氨基酸)的CrylAb核苷酸序列 (1848個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:5所示；編碼Vip3A殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(789 個(gè)氨基酸)的Vip3A核苷酸序列(2370個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:6所示。
3、合成上述核苷酸序列
所述CrylFa-Ol核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 3所示)、所述CrylFa-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:4所示)、所述CrylAb核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 5所示)和所述Vip3A核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:6所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的5’端還連接有 AscI酶切位點(diǎn)，所述CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的3’端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)；合成的所述CrylFa-02核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)， 所述CrylFa-02核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的3’端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)；合成的所述 CrylAb核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的5’端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述CrylAb核苷酸序列(SEQ ID N0:5)的3’端還連接有SwaI酶切位點(diǎn)；合成的所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的5’端還連接有ScaI酶切位點(diǎn)，所述Vip3A核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)。
第二實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
I、構(gòu)建含有CrylF基因的重組克隆載體
將合成的CrylFa-Ol核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA, CAT :A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到重組克隆載體 DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖I所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為L(zhǎng)acZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子；T7為Τ7 RNA聚合酶啟動(dòng)子；CryIFa-OI為CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ；MCS為多克隆位點(diǎn))。
然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞 (Transgen, Beijing, China, CAT :CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10μ I質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-D-半乳糖苷)和X-gal (5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB 液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH 調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50禮葡萄糖，？!18.0)懸??；加入15(^1新配制的溶液11 (0. 2M NaOH, 1% SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液 III (4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm 條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、 轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8. O)溶 解沉淀；于溫度 37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 提取的質(zhì)粒經(jīng)AscI和BamHI酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述CrylFa-Ol核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列正確插入。
按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylFa-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，CrylFa-02為CrylFa-02核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN02-T中所述CrylFa-02核苷酸序列正確插入。
按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述CrylAb核苷酸序列連入克隆載體PGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，CrylAb為CrylAb核苷酸序列 (SEQ ID N0:5)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN03-T中所述CrylAb核苷酸序列正確插入。
按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述Vip3A核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，Vip3A為Vip3A核苷酸序列(SEQ ID N0:6)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN04-T中所述Vip3A核苷酸序列正確插入。
2、構(gòu)建含有CrylF基因的重組表達(dá)載體
用限制性內(nèi)切酶AscI和BamHI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達(dá)載體 DBNBC-01 (載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的CrylFa-Ol核苷酸序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-01的AscI和BamHI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100014，其構(gòu)建流程如圖2所示 (Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界；Ubi :玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 7); CrylFa-Ol =CrylFa-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO: 3) ；Nos :胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:8) ；PMI :磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:9) ；LB :左邊界)。
將重組表達(dá)載體DBN100014用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100014)，42°C水浴 30秒；37°C水浴I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng));然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH 至7. 5 )上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨IOg/ L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶AscI和BamHI酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100014在AscI和BamHI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:3所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列。
按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100014的方法，將AscI和BamHI、NcoI和SwaI分別酶切重組克隆載體DBNOl-T和DBN03-T切下的所述CrylFa-Ol核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100012。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100012中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5所示核苷酸序列，即CrylFa-Ol核苷酸序列和CrylAb核苷酸序列。
按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100014的方法，將AscI和BamHI、ScaI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBN02-T和DBN04-T切下的所述CrylFa-02核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-OI，得到重組表達(dá)載體DBN100276。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100276中的核苷酸序列含有為序列表中SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6所示核苷酸序列，即CrylFa-02核苷酸序列和Vip3A核苷酸序列。
3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
對(duì)己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100014、DBN100012和DBN100276用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404 (Invitrgen, Chicago,USA ;Cat. No :18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為 100 μ L農(nóng)桿菌LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴 10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin) 的LB平板上直至長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶AhdI 和XbaI對(duì)重組表達(dá)載體DBN100014和DBN100012酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，用限制性內(nèi)切酶 AhdI和AatII對(duì)重組表達(dá)載體DBN100276酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體 DBN100014.DBN100012 和 DBN100276 結(jié)構(gòu)完全正確。
第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入CrylF基因的玉米植株的獲得及驗(yàn)證
I、獲得轉(zhuǎn)入CrylF基因的玉米植株
按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無(wú)菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實(shí)施例中3所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100014、 DBN100012和DBN100276中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動(dòng)子序列、CrylFa-Ol 核苷酸序列、CrylFa-02核苷酸序列、CrylAb核苷酸序列、Vip3A核苷酸序列、PMI基因和 Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、 轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylFa_02_Vip3A核苷酸序列的玉米植株；同時(shí)以野生型玉米植株作為對(duì)照。
對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)rylFa-Ol核苷酸序列、CrylFa-Ol-CryIAb核苷酸序列和/ 或CrylFa-02-Vip3A核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個(gè)細(xì)胞(步驟I :侵染步驟)，在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=O. 4-0. 6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L，pH5. 3))中以啟動(dòng)接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期(3天)(步驟2 : 共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素 300mg/L、鹿糖 20g/L、葡萄糖 10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個(gè)選擇性的“恢復(fù)”步驟。在 “恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L,pH5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3 :恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒(méi)有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長(zhǎng)著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4 :選擇步驟)。 優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖 5g/L、甘露糖12. 5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5 :再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。
篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C 下培養(yǎng)分化。分化出來(lái)的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，ρΗ5· 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm 高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20°C下培養(yǎng)8小時(shí)。
2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入CrylF基因的玉米植株
分別取轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylFa-02-Vip3A核苷酸序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品， 用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA,通過(guò)Taqman探針突光定量PCR方法檢測(cè)CrylF基因、CrylAb基因和Vip3A基因的拷貝數(shù)。同時(shí)以野生型玉米植株作為對(duì)照， 按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
檢測(cè)CrylF基因、CrylAb基因和Vip3A基因拷貝數(shù)的具體方法如下
步驟11、分別取轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylFa-01-CrylAb 核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylFa-02-Vip3A核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)；
步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；
步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測(cè)定上述樣品的基因組DNA濃度；
步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為 80_100ng/μ I ；
步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過(guò)鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是
以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)CrylFa-Ol核苷酸序列
引物I (CFl) :CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
引物2 (CRl) ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；
探針I(yè) (CPl) :CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；
以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)CrylAb核苷酸序列
引物3 (CF2) TGGTGGAGAACGCATTGAAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
引物4 (CR2) GCTGAGCAGAAACTGTGTCAAGG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
探針2 (CP2) CGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTG 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)CrylFa-02核苷酸序列
引物5 (CF3) CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
引物6 (CR3) ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；
探針3 (CP3) CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 18 所示；
以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)Vip3A核苷酸序列
引物7 (CF4) ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 19 所示；
引物8 (CR4) :GCTGCCAGTGGATGTCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 20 所示；
探針4 (CP4) :CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC 如序列表中 SEQ ID NO: 21 所示；
PCR反應(yīng)體系為
jumpStart Taq Ready Mix (Sigma)10μ150x引物/探針混合物Ιμ 基因組DNA3μ!水(CldH2O)6μΙ
所述50Χ引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50 μ I和860 μ I I X TE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
PCR反應(yīng)條件為
步驟溫度時(shí)間2195 0C5分鐘2295 0C30秒2360 0C1分鐘24回到步驟22,重復(fù)40次
利用SDS2. 3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CrylFa-Ol核苷酸序列、CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列和 CrylFa-02-Vip3A核苷酸序列均己整合到所檢測(cè)的玉米植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入 CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入 CrylFa-02-Vip3A核苷酸序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝CrylF基因、CrylAb基因和 /或Vip3A基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
第四實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)檢測(cè)1
I、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的含量檢測(cè)
本實(shí)驗(yàn)中涉及的溶液如下
萃取緩沖液8g/LNaCl, O. 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4.12H20，O. 2g/L KCl, 5. 5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH 7. 4 ；
洗滌緩沖液PBST 8g/L NaCl，0· 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4.12H20，0. 2g/L KCl， 0. 5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH 7. 4 ；
終止液IMHCl。
分別取3mg轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入CrylFa-01-CrylAb核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入CrylFa-02-Vip3A核苷酸序列的玉米植株的新鮮葉片作為樣品， 液氮研磨后加入800 μ I所述萃取緩沖液，4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心lOmin，取上清液用所述萃取緩沖液稀釋40倍，取80 μ I稀釋后的上清液用于ELISA檢測(cè)。用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)試劑盒(ENVIRLOGIX公司，CrylFa試劑盒、CrylAb試劑盒和Vip3A試劑盒)對(duì)樣品中殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)(CrylFa蛋白、CrylAb蛋白和Vip3A蛋白)量占葉片鮮重的比例進(jìn)行檢測(cè)分析，具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
同時(shí)以野生型玉米植株和經(jīng)Taqman鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株作為對(duì)照，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。轉(zhuǎn)入CrylFa-Ol核苷酸序列的共3個(gè)株系(SI、S2和S3)，轉(zhuǎn)入 CrylFa-Ol-CrylAb核苷酸序列的共3個(gè)株系(S4、S5和S6)，轉(zhuǎn)入CrylFa_02_Vip3A核苷酸序列的共3個(gè)株系(S7、S8和S9)，經(jīng)Taqman鑒定為非轉(zhuǎn)基因的(NGM1)共I個(gè)株系，野生型的(CKl)共I個(gè)株系；從每個(gè)株系選3株進(jìn)行測(cè)試，每株重復(fù)6次。
表I、轉(zhuǎn)基因玉米植株的CrylFa蛋白表達(dá)量測(cè)定平均結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，包括將大螟害蟲(chóng)與CrylF蛋白接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述CrylF蛋白為CrylFa 蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylFa蛋白的植物細(xì)胞中，所述大螟害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述植物細(xì)胞與所述CrylFa蛋白接觸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白存在于產(chǎn)生所述CrylFa蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中，所述大螟害蟲(chóng)通過(guò)攝食所述轉(zhuǎn)基因植物的組織與所述CrylFa蛋白接觸，接觸后所述大螟害蟲(chóng)生長(zhǎng)受到抑制并最終導(dǎo)致死亡，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大螟為害植物的控制。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物可以處于任意生育期。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物的組織可以為葉片、莖桿、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述對(duì)大螟為害植物的控制不因種植地點(diǎn)的改變而改變。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述對(duì)大螟為害植物的控制不因種植時(shí)間的改變而改變。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述植物可以來(lái)自玉米、水稻、高粱、麥、粟、棉花、蘆葦、甘蔗、茭白、蠶豆或油菜。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述CrylFa蛋白的多核苷酸的植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至10任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述CrylFa蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求3至12任一項(xiàng)所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述植物還可以產(chǎn)生至少一種不同于所述CrylFa蛋白的第二種核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼Cry類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過(guò)氧化物酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸可以編碼CrylAb蛋白、CrylAc蛋白、CrylBa蛋白或Vip3A蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的控制大螟害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述第二種核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中重要基因的dsRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種控制大螟害蟲(chóng)的方法，包括將大螟害蟲(chóng)與Cry1F蛋白接觸。本發(fā)明通過(guò)植物體內(nèi)產(chǎn)生能夠殺死大螟的Cry1F蛋白來(lái)控制大螟害蟲(chóng)；與現(xiàn)有技術(shù)使用的農(nóng)業(yè)防治方法、化學(xué)防治方法和生物防治方法相比，本發(fā)明對(duì)植物進(jìn)行全生育期、全植株的保護(hù)以防治大螟害蟲(chóng)的侵害，且無(wú)污染、無(wú)殘留，效果穩(wěn)定、徹底，簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)。
文檔編號(hào)A01G13/00GK102972243SQ201210533580
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者韓超, 龐潔, 康越景, 劉海利, 張?jiān)浦? 張成偉, 許春蘋(píng), 魏玫, 黃金存, 田康樂(lè), 王乾欽 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心