專利名稱：利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物寄生線蟲的繁殖培養(yǎng)和保存方法，具體涉及一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法。
背景技術：
對于植物寄生線蟲，要研究其系統(tǒng)分類、分子生物學、功能基因組學以及蛋白質組學等基礎研究，或者在實驗室和田間進行生物學、病理學以及防治方法等基礎和應用研究，都需要大量、純化的線蟲。 然而，植物寄生線蟲大多都是專性寄生的，很難在純培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只能在相應的寄生植物上繁殖。在實際中，人們往往利用植物組織培養(yǎng)技術在White(1963)、Krusberg (1961)和Gamborg’ s B5等植物組織培養(yǎng)基或I %水瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)新鮮的植物愈傷組織、離體根或其他一些植物器官及整株植物幼苗，然后在這些植物材料上接種培養(yǎng)繁殖植物寄生線蟲；兼食真菌的植物線蟲，也可以用某些種類的真菌菌絲來培養(yǎng)(馮志新，2001)。不同類型線蟲的培養(yǎng)所采用的具體方法取決于其生物學特性。腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)和香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)都是遷移性內寄生線蟲，嚴重為害多種作物，均被我國列為檢疫性植物有害生物。對腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲，目前可利用在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的紫花苜蓿愈傷組織或真菌進行人工培養(yǎng)繁殖；對香蕉穿孔線蟲，則利用在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的紫花苜蓿愈傷組織和胡蘿卜愈傷組織或利用無培養(yǎng)基的胡蘿卜片長出的愈傷組織，進行人工培養(yǎng)繁殖。但是利用培養(yǎng)基培養(yǎng)植物愈傷組織或真菌，再接種培養(yǎng)繁殖線蟲，操作復雜，同時易發(fā)生污染導致繁殖成功率和繁殖量低，直接用無培養(yǎng)基的胡蘿卜片長出的愈傷組織繁殖和培養(yǎng)保存香蕉穿孔線蟲的方法，也因胡蘿卜含水量大、易帶內生細菌發(fā)生腐爛，存在不能長期培養(yǎng)保存等缺陷。

發(fā)明內容
為克服現有技術的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法。該方法可實現即簡單、大量人工培養(yǎng)繁殖線蟲，又長期保存線蟲資源的目的。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，包含以下步驟(I)甘薯愈傷組織的制備將新鮮健康的甘薯洗凈晾干，用酒精浸泡后，灼燒，至表皮變暗，削去表皮，切成甘薯片，放入滅菌培養(yǎng)皿中，封口，于22 28°C暗培養(yǎng)至長出甘薯愈傷組織；(2)植物寄生線蟲的消毒和接種挑取或吸取植物寄生線蟲，消毒，然后離心，去除上清，將沉淀的線蟲用無菌水混勻繼續(xù)離心，去除上清，最后將沉淀的線蟲用無菌水稀釋分散滴在甘薯愈傷組織上，封口 ；(3)植物寄生線蟲的繁殖培養(yǎng)將步驟(2)中接種了植物寄生線蟲的甘薯愈傷組織進行暗培養(yǎng)繁殖，培養(yǎng)溫度為植物寄生線蟲繁殖的適宜溫度；(4)植物寄生線蟲的保存將植物寄生線蟲連同甘薯愈傷組織于4 20°C保存；步驟(I)中所述的酒精選用工業(yè)酒精即可，其濃度優(yōu)選為質量百分比70% ；
步驟(I)中所述的浸泡的時間優(yōu)選為2min ；步驟(I)中所述的甘薯片的厚度根據培養(yǎng)皿的厚度，以距離皿蓋至少5mm為宜，優(yōu)選厚度為4_，太厚靠近皿蓋，不易于接種，太薄容易缺失水份，薯塊易干，不易于長期培養(yǎng)、繁殖率低；步驟(I)中所述的培養(yǎng)皿可以是多種規(guī)格，優(yōu)選直徑為6cm的培養(yǎng)皿；培養(yǎng)皿大太占用空間，太小則只放較小的薯塊，不利于提高線蟲的繁殖率，此外，6cm的培養(yǎng)皿便于保存；步驟(I)中所述的封口可用封口膜或者保鮮膜進行封口 ；步驟(I)中所述的暗培養(yǎng)的溫度更優(yōu)選為25°C ；步驟(I)中所述的于22 28°C暗培養(yǎng)至長出甘薯愈傷組織的時間一般為10 15天;步驟(2)中所述的植物寄生線蟲優(yōu)選為腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)或香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)；步驟(2)中所述的消毒優(yōu)選為使用質量百分比O. 2%的硫酸鏈霉素溶液處理3 12h，可以達到消毒目的，不影響其正常的繁殖發(fā)育；步驟(2)中所述的離心的條件優(yōu)選為4000rpm離心2min ；步驟(3)中所述的培養(yǎng)溫度要根據被培養(yǎng)繁殖的植物線蟲種類的生物學特性確定；因為植物寄生線蟲不同屬、種間的生物學特性存在差異，最合適的生長溫度有所不同；當所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲時，所述的培養(yǎng)溫度為20 25°C ；當所述的植物寄生線蟲為起絨草莖線蟲時，所述的培養(yǎng)溫度為17 20°C ；當所述的植物寄生線蟲為香蕉穿孔線蟲時，所述的培養(yǎng)溫度為25 30°C ；步驟(4)中所述的植物寄生線蟲優(yōu)選為在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)50天的植物寄生線蟲；步驟(4)中所述的保存的溫度如下所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲時，所述的保存的溫度為4°C ;所述的植物寄生線蟲為香蕉穿孔線蟲時，所述的保存的溫度為20°C ；上述利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，包括線蟲繼代培養(yǎng)的步驟，是在接種擴繁線蟲的甘薯愈傷組織培養(yǎng)皿中加入無菌水，然后挑出或吸取線蟲，重復步驟(2 )和(3 )即可達到繼代培養(yǎng)之目的。與現有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果目前，利用甘薯愈傷組織繁殖和培養(yǎng)保存腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)或香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)這3種植物寄生線蟲的方法尚未有報道。本專利發(fā)明利用無培養(yǎng)基培養(yǎng)的甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，操作簡單、成功率和繁殖率高，并且也可以實現對這3種線蟲的更長時間的保存。本發(fā)明的方法既可實現簡單、大量繁殖腐爛莖線蟲、起絨草莖線蟲和香蕉穿孔線蟲，又能長期培養(yǎng)保存這些線蟲，具體如下
(I)使用甘薯愈傷組織培養(yǎng)腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲，與真菌培養(yǎng)方法相比，操作方法更加簡便，培養(yǎng)材料更易獲得；培養(yǎng)一段時間的線蟲比較容易聚集在培養(yǎng)皿底部，容易收集干凈的線蟲；此外，腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲屬于植物寄生線蟲，長期在真菌上培養(yǎng)會導致其對植物寄生和致病力的退化，在甘薯愈傷組織長期培養(yǎng)則能避免此情況發(fā)生。(2)使用無需培養(yǎng)基培養(yǎng)的甘薯愈傷組織培養(yǎng)腐爛莖線蟲和起絨草莖線蟲，與用培養(yǎng)基培養(yǎng)的苜蓿愈傷組織培養(yǎng)這兩種線蟲的方法相比，操作步驟簡單，對人員操作要求低，省時、省力，且成功率高。主要表現在1)本發(fā)明不需要配制培養(yǎng)基；2)甘薯愈傷組織一般在7天就可以長出，10 15天則可以在薯塊上長滿薯塊，但用培養(yǎng)基培養(yǎng)的苜蓿愈傷組織需要I個月；3)甘薯的切片規(guī)則，有一個愈傷組織平面，容易接種線蟲，而苜蓿愈傷組織不規(guī)則，不易接種線蟲；4)用培養(yǎng)基培養(yǎng)的苜蓿愈傷組織需要在非常嚴格的無菌條件下操作，很容易污染，而本發(fā)明操作簡單，較少發(fā)生污染；5)這兩種線蟲在無培養(yǎng)基培養(yǎng)的甘薯愈傷組織上繁殖率高。(3)使用甘薯愈傷組織培養(yǎng)香蕉穿孔線蟲，與胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)香蕉穿孔線蟲相比，甘薯相比胡蘿卜，含水量較少，較少滋生細菌，甘薯愈傷組織培養(yǎng)成功率高、不易腐爛、能長期培養(yǎng)保存。胡蘿卜含水量較高，內部易感染細菌，很容易在切片消毒后在未長出愈傷組織前出現壞死斑或腐爛，不能用以培養(yǎng)線蟲，浪費人力和物力；而培養(yǎng)出的愈傷組織接種香蕉穿孔線蟲后，也因含水量較高，而較快腐爛，因此不能在同一塊胡蘿卜愈傷組織上長期培養(yǎng)保存香蕉穿孔線蟲，需要較頻繁的將香蕉穿孔線蟲轉接到新的胡蘿卜愈傷組織上進行續(xù)培養(yǎng)保存，因此工作量大。


圖I是切好的薯片照片圖。圖2是2周后長出愈傷組織的甘薯薯片照片圖。圖3是使用甘薯愈傷組織培養(yǎng)腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor) 50天的甘薯愈傷組織癥狀照片圖，其中培養(yǎng)皿底部箭頭所指為腐爛莖線蟲聚集形成的白色物質。圖4是接種培養(yǎng)腐爛莖線蟲50d后放入4°C冰箱保存I年的甘薯愈傷組織照片圖， 其中培養(yǎng)皿底部箭頭所指為腐爛莖線蟲聚集形成的白色物質。圖5是接種香蕉穿孔線蟲75d后的甘薯愈傷組織癥狀照片圖，其中培養(yǎng)皿底部箭頭所指為香蕉穿孔線蟲聚集形成的白色網狀物。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖進一步解釋本發(fā)明，實施例中如無特殊說明，均為本領域常規(guī)實驗技術手段。腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)種群分離自國內感病甘薯(采集地點山東省蒙陰縣聯(lián)城鄉(xiāng)季家城子村)，公眾可從華南農業(yè)大學植物線蟲研究室獲得；參考文獻為劉一帆，徐春玲，張超，蘇秀敏，謝輝.2011.從混合線蟲樣品和植物組織中直接檢測香蕉穿孔線蟲的ITS-PCR方法·中國農業(yè)科學，44(19) :3991_3998。起絨草莖線蟲(D. dipsaci)種群來自從進口郁金香上截獲的線蟲，公眾可從華南農業(yè)大學植物線蟲研究室獲得；參考文獻為趙立榮，徐春玲，胡學難，鐘國強，武目濤.2011.截獲的鱗球莖莖線蟲的檢驗鑒定.植物檢疫，25 (5) :45-470香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)的種群寄主為紅掌(Anthuriumandraeanum),公眾可從華南農業(yè)大學植物線蟲研究室獲得；參考文獻為劉一帆，徐春玲，張超，蘇秀敏，謝輝.2011.從混合線蟲樣品和植物組織中直接檢測香蕉穿孔線蟲的ITS-PCR方法·中國農業(yè)科學，44(19) :3991_3998。實施例I腐爛莖線蟲在甘薯愈傷組織上的繁殖和保存具體步驟如下( I)甘薯愈傷組織的制備選取健康、比較細長和規(guī)則的甘薯薯塊(廣薯128)，洗凈晾干；用質量百分比70%的酒精浸泡2min，然后在超凈工作臺中燒掉表面的酒精，用滅菌的削皮刀削去甘薯表皮，然 后用刀切成4_左右的薄片，薄片單個放入無菌培養(yǎng)皿中(圖1)，用保鮮膜封口，25°C恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，直至長出愈傷組織備用(一般7d即有愈傷，10 15天可長滿薯塊)(圖2)。(2)腐爛莖線蟲的分離將有癥狀甘薯薯塊切開，用小刀切取部分有癥狀的甘薯組織，使用貝曼漏斗法分離線蟲[謝輝.2005.植物線蟲分類學(第二版).北京高等教育出版社，P38-40]。(3)腐爛莖線蟲的消毒和接種挑取20條線蟲，用挑針挑入裝有Iml O. 2% (質量百分含量)硫酸鏈霉素的I. 5mlEppendorf管中，消毒3h以上,4 OOOrpm離心2min,去除上清,用無菌水清洗兩次,在超凈工作臺上，去除上清液，吸取離心管中的線蟲懸浮液，接種到甘薯愈傷組織表面，用保鮮膜封好，在25°C條件下培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。(4)腐爛莖線蟲在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)一段時間后線蟲的收集計數和保存將接種腐爛莖線蟲的甘薯愈傷組織在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50d (圖3)，分離線蟲或者直接把培養(yǎng)皿放到4°C冰箱保存?zhèn)溆?。具體分離收集計數方法是腐爛莖線蟲線蟲培養(yǎng)50d后，首先用清水洗下培養(yǎng)皿及愈傷組織表面的線蟲，定容40ml，每次取Iml計算蟲及卵量；然后把愈傷組織放入攪拌器中，加入適量的水進行攪拌。攪拌3次，每次10s，每次間隔5s，然后將攪拌的懸浮液通過100和500目的組合篩，用自來水反復沖洗，再用洗瓶沖洗500目篩上的線蟲及卵至小燒杯中,把線蟲懸浮液定容40ml，取Iml統(tǒng)計線蟲及卵的數量。重復3次，以3次的平均值作為每個愈傷組織中的蟲量，然后以此計算腐爛莖線蟲的繁殖倍數。線蟲的繁殖倍數=分離的線蟲總量/接種線蟲量。20條腐爛莖線蟲接種在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)50天后，繁殖的蟲量平均為35937±1537. 3條、卵量平均為23467±1703個，繁于倍數平均達2976±168。由此可以看出用本發(fā)明的方法培養(yǎng)腐爛莖線蟲，具有極高的繁殖結果。用甘薯愈傷組織培養(yǎng)的接種有腐爛莖線蟲的培養(yǎng)皿可以放在4°C冰箱中保存?zhèn)溆?，可以保存半年到I年，保存I年后的腐爛莖線蟲(圖4)還可以繼續(xù)接種甘薯愈傷組織，對其進行繁殖培養(yǎng)和保存。實施2起絨草莖線蟲在甘薯愈傷組織上的繁殖和保存具體步驟如下( I)甘薯愈傷組織的制備見實施例I。
(2)起絨草莖線蟲的分離將有癥狀的病塊根用剪刀剪碎，使用貝曼漏斗法跟病根周圍的基質一起分離，方法同實施例I。(3)起絨草莖線蟲消毒、接種培養(yǎng)挑取25條雌蟲，除接種后培養(yǎng)皿放入18°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)外，其它消毒和接種方法同實施例I。(4)起絨草莖線蟲在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)一定時間后線蟲的收集、計數具體方法見實施例I。25條起絨草莖線蟲接種在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)50天后，繁殖的蟲量平均為21267±1272條、卵量平均為9053±564個，繁于倍數平均達1516±53. 2。
用甘薯愈傷組織培養(yǎng)的接種有起絨草莖線蟲的培養(yǎng)皿可以放在4°C冰箱中保存?zhèn)溆?，可以保存半年。保存半年后的起絨草莖線蟲還可以繼續(xù)接種甘薯愈傷組織，對其進行培養(yǎng)繁殖和保存。實施例3香蕉穿孔線蟲在甘薯愈傷組織上的繁殖和保存具體步驟如下( I)甘薯愈傷組織的制備見實施例I。(2)香蕉穿孔線蟲的分離將有癥狀的病根組織用剪刀剪碎，使用貝曼漏斗法跟病根周圍的基質一起分離，方法同實施例I。(3)香蕉穿孔線蟲消毒、接種培養(yǎng)挑取25條雌蟲，其它消毒和接種方法同實施例I。(4)香蕉穿孔線蟲在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)一定時間后線蟲的收集、計數具體方法見實施例I。25條香蕉穿孔線蟲接種在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)50天后，繁殖的蟲量平均為21836±1459. 2條、卵量平均為4032±762· I個，繁于倍數平均達1035±76. 9。用甘薯愈傷組織培養(yǎng)的接種有香蕉穿孔線蟲的培養(yǎng)皿可以放在20°C溫箱中保存?zhèn)溆?，可以保?個月以上，保存75d后的香蕉穿孔線蟲(圖5)還可以繼續(xù)接種甘薯愈傷組織，對其進行培養(yǎng)繁殖和保存。以上實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，用于解釋本發(fā)明的技術方案，但不對本發(fā)明做任何形式上的限制，在其他未背離本發(fā)明實質的前提下所作的任何改變例如修飾、替代、組合、簡化等方式均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟(1)甘薯愈傷組織的制備將新鮮健康的甘薯洗凈晾干，用酒精浸泡后，灼燒，至表皮變暗，削去表皮，切成甘薯片，放入滅菌培養(yǎng)皿中，封口，于22 28°C暗培養(yǎng)至長出甘薯愈傷組織；(2)植物寄生線蟲的消毒和接種挑取或吸取植物寄生線蟲，消毒，然后離心，去除上清，將沉淀的線蟲用無菌水混勻繼續(xù)離心，去除上清，最后將沉淀的線蟲用無菌水稀釋分散滴在甘薯愈傷組織上，封口 ；(3)植物寄生線蟲的繁殖培養(yǎng)將步驟(2)中接種了植物寄生線蟲的甘薯愈傷組織進行暗培養(yǎng)繁殖，培養(yǎng)溫度為植物寄生線蟲繁殖的適宜溫度；(4)植物寄生線蟲的保存將植物寄生線蟲連同甘薯愈傷組織于4 20°C保存。
2.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(I)中所述的酒精為質量百分比70%的工業(yè)酒精；步驟(I)中所述的浸泡的時間為 2min。
3.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(I)中所述的甘薯片厚度為4mm ;步驟(I)中所述的培養(yǎng)皿的直徑為6cm ;步驟 (I)中所述的封口可用封口膜或者保鮮膜進行封口；步驟(I)中所述的于22 28°C暗培養(yǎng)至長出甘薯愈傷組織的時間為10 15天。
4.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(2)中所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor)、起絨草莖線蟲(D. dipsaci)或香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)。
5.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(2)中所述的消毒為使用質量百分比O. 2%的硫酸鏈霉素溶液處理3 12h。
6.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(2)中所述的離心的條件為4000rpm離心2min。
7.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(3)中所述的培養(yǎng)溫度具體如下當所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲時，所述的培養(yǎng)溫度為20 25°C ;當所述的植物寄生線蟲為起絨草莖線蟲時，所述的培養(yǎng)溫度為 17 20°C ;當所述的植物寄生線蟲為香蕉穿孔線蟲時，所述的培養(yǎng)溫度為25 30°C。
8.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(4)中所述的植物寄生線蟲為在甘薯愈傷組織上培養(yǎng)50天的植物寄生線蟲。
9.權利要求I所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于步驟(4)中所述的保存的溫度如下所述的植物寄生線蟲為腐爛莖線蟲或起絨草莖線蟲時，所述的保存的溫度為4°C ;所述的植物寄生線蟲為香蕉穿孔線蟲時，所述的保存的溫度為20°C。
10.權利要求I 9任一項所述的利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法，其特征在于包括線蟲繼代培養(yǎng)的步驟，具體為在接種擴增繁殖線蟲的甘薯愈傷組織培養(yǎng)皿中加入無菌水，然后挑出或吸取線蟲，重復權利要求I的步驟(2)和(3)即可達到繼代培養(yǎng)之目的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用甘薯愈傷組織繁殖培養(yǎng)和保存植物寄生線蟲的方法。本發(fā)明通過以下步驟實現新鮮甘薯經洗凈、表面消毒、削皮和切片放入培養(yǎng)皿后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲得甘薯愈傷組織；取經消毒處理的植物寄生線蟲接種到甘薯愈傷組織上；分別放在各自適宜溫度的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)繁殖；培養(yǎng)一段時間后，將植物寄生線蟲連同甘薯愈傷組織于4～20℃保存。本發(fā)明方法可實現即簡單、大量人工培養(yǎng)繁殖植物寄生線蟲，又能長期保存植物寄生線蟲資源的目的。
文檔編號A01H4/00GK102972355SQ20121051807
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權日2012年12月5日
發(fā)明者謝輝, 徐春玲, 李宇, 丁莎, 李克梅 申請人:華南農業(yè)大學