專利名稱：可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應(yīng)用的制作方法
可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于腫瘤模型及其建立與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌是威脅我國人民健康的頭號(hào)殺手。據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《2010年中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》，我國2009年惡性腫瘤在所有疾病死亡原因中居首位，統(tǒng)計(jì)資料顯示死亡率排名前十位的惡性腫瘤中，肺癌居首位，為我國的社會(huì)發(fā)展帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，肺癌的治療和基礎(chǔ)研究取得了較大發(fā)展，但目前肺癌藥物的基礎(chǔ)和臨床前研究尚欠缺一種能更方便的評(píng)估藥物療效的可靠的體內(nèi)、體外研究平臺(tái)，這嚴(yán)重制約了肺癌的基礎(chǔ)和臨床前研究。肺癌動(dòng)物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前臨床前藥物實(shí)驗(yàn)最常用的模型。 移植型肺癌模型是將人肺癌細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)傳代生長，移植的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、 染色體數(shù)量、同工酶水平等將保持不變，對(duì)臨床抗癌藥物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮將肺癌細(xì)胞或組織塊接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、后肢等)建立肺癌模型。此模型建模簡單易行，成瘤率高，易監(jiān)視腫瘤生長情況， 所以常用來作抗癌藥物篩選的動(dòng)物模型，同時(shí)該模型還具有動(dòng)物來源方便、移植腫瘤細(xì)胞生長迅速、倍增時(shí)間短、耗費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)。但目前應(yīng)用的移植型肺癌模型對(duì)藥物療效的評(píng)估多需采取解剖的方法進(jìn)行評(píng)估，操作復(fù)雜，受人為操作的影響因素大，不便于臨床前研究。如果能夠建立一種整體可視化肺癌模型，能夠直接進(jìn)行體外成像監(jiān)測評(píng)估腫瘤的生長轉(zhuǎn)移情況，可以對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行觀察，將大大便利肺癌的臨床前研究，同時(shí)也能減少人為因素的干擾，提高評(píng)估的準(zhǔn)確性。
熒光素酶報(bào)告基因(Luc)的應(yīng)用便利了肺癌整體可視化動(dòng)物模型的構(gòu)建。熒光素酶報(bào)告基因根據(jù)來源不同主要分為細(xì)菌熒光素酶(Bacterial luciferase, BL)、螢火蟲熒光素酶(firefly Iuciferase1FL)以及海星、發(fā)光魚、發(fā)光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。BL是由2個(gè)多肽亞基組成的異二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約為79xl03。在還原性黃素(FMNH)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時(shí)，發(fā)射出藍(lán)綠光(45(T490nm)。FL由單一的多肽鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量為(60 64) XlO3, 在Mg2+、ATP、O2存在時(shí)催化D-熒光素(D-Luciferin)氧化脫羧發(fā)光(55(T580nm)。螢火蟲的熒光素-熒光素酶系統(tǒng)是最早建立的發(fā)光模型之一，該發(fā)光系統(tǒng)采用熒光素底物發(fā)光的形式，不需要激發(fā)光，具有較高的靈敏度，此外，螢火蟲熒光素酶發(fā)出的光組織吸收少，有利于深部組織成像，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量呈線性相關(guān)。通過基因工程方法構(gòu)建熒光素酶的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到癌細(xì)胞中，使其表達(dá)螢火蟲熒光素酶，進(jìn)而利用表達(dá)熒光素酶的癌細(xì)胞接種至動(dòng)物即可構(gòu)建整體可視化腫瘤模型，可通過體外成像的方法，對(duì)動(dòng)物體進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物。
慢病毒感染較其他轉(zhuǎn)染方式具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，具有感染譜廣、效率高、可感染非分4裂細(xì)胞、并可使目的基因穩(wěn)定整合至宿主基因組因而能夠長期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等特點(diǎn)，是一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應(yīng)用，與傳統(tǒng)的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物，結(jié)果更加可靠，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型，所述腫瘤模型通過采用基因重組技術(shù)和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌LLC細(xì)胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤克隆細(xì)胞株，然后采用重組的LLC細(xì)胞接種于小鼠構(gòu)建而成。
本發(fā)明的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，包括
(I)以前期構(gòu)建的攜帶有螢火蟲熒光素酶基因的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出熒光素酶的cDNA，通過基因克隆的方法插入慢病毒真核表達(dá)載體PRRL-CMV質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 Luc-PRRL-CMV 表達(dá)質(zhì)粒
設(shè)計(jì)螢火蟲熒光素酶基因特異性引物
(該引物為上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下游引物CCTGTC GACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；
熒光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構(gòu)建使用該特異性引物PCR擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒抽提后運(yùn)用基因重組方法將熒光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達(dá)載體PRRL-CMV空質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；
質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切和測序證實(shí)構(gòu)建的表達(dá)載體的正確性；
(2)慢病毒感染方法將熒光素酶外源基因?qū)敕伟┘?xì)胞株的步驟
大腸桿菌擴(kuò)增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質(zhì)粒，并純化測定濃度；將
熒光素酶慢病毒載體的包裝熒光素酶慢病毒表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)?；旌虾?，用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以產(chǎn)生含有螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；
病毒感染以人肺腺癌LLC為母細(xì)胞，用上述病毒上清進(jìn)行感染；
擴(kuò)增建系進(jìn)行細(xì)胞亞克隆篩選，檢測單克隆細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況，篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的重組細(xì)胞株并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
(3)腫瘤皮下注射方法
將得到的重組人肺腺癌細(xì)胞經(jīng)消化后重懸于氯化鈉溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接種(2Χ IO6)該重組人肺腺癌細(xì)胞，監(jiān)測細(xì)胞皮下增殖情況，即得到可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型。
所述步驟(I)中的基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為采用Xba I和 Sal I雙酶切。
所述步驟(2)中的熒光素酶慢病毒表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)粒的質(zhì)量比為1:3、 1:6 或 1:9。
所述慢病毒包裝質(zhì)粒包括第三代慢病毒復(fù)制所需要的三個(gè)基因gag、pol和rev。
所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)染試劑為MV40轉(zhuǎn)染試劑。
所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細(xì)胞有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆篩選；通過熒光測定儀或活細(xì)胞成像儀檢測單克隆細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況。
所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質(zhì)量百分比濃度為O. 9%。
所述步驟(3)中通過游標(biāo)卡尺測量和活體成像儀監(jiān)測細(xì)胞皮下增殖情況。
本發(fā)明的裸鼠模型應(yīng)用于觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。
所選用的動(dòng)物除了裸鼠，也可以為SCID鼠。
有益.效果
本發(fā)明與傳統(tǒng)的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物，結(jié)果更加可靠，具有良好的應(yīng)用前景。


圖IA為螢火蟲熒光素酶Luciferase慢病毒載體示意圖IB為質(zhì)粒酶切鑒定圖2為Luciferase慢病毒載體的包裝；其中，A為目的基因質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:3轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，B為目的基因質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:6轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，C為目的基因質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:9轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
圖3為包裝后的慢病毒上清感染LLC細(xì)胞；其中，A為感染后48h ;B為感染后72h ； C為感染后96h ；
圖4為穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的LLC細(xì)胞單克隆篩選；其中,A為Luciferase活性定量分析(RLU)，B為活細(xì)胞成像；
圖5為穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的LLC細(xì)胞體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)；其中,A為活體動(dòng)物成像， B為活體動(dòng)物成像定量分析，C為腫瘤生長曲線；
圖6為小鼠LLC細(xì)胞熒光素酶腫瘤模型的應(yīng)用；其中，A為治療后第12天活體成像，B為活體成像定量分析，C為治療后不同天數(shù)腫瘤生長曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例I
步驟I.熒光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構(gòu)建
在設(shè)計(jì)螢火蟲突光素酶(Firefly-Luciferase)基因特異性引物后，以攜帶 Luciferase基因質(zhì)粒為模板(碧云天公司)，PCR擴(kuò)增出Luciferase cDNA。將擴(kuò)增的 Luciferase基因成功插入PCR-Blunt載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞后質(zhì)粒小抽，XbaI 和SalI雙酶切后割膠純化回收Luciferase基因片段，將該片段與慢病毒真核表達(dá)載體 PRRL-CMV空質(zhì)粒(Backbone)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞后質(zhì)粒小抽，雙酶切鑒定和測序結(jié)果均證明Luciferase-PRRL-CMV表達(dá)載體構(gòu)建成功，經(jīng)測序證實(shí)序列完全正確(約 1700bp ) (ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGC GAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGT GGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAA ACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTG GCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGT ATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCA TGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAAC GAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGG ATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCA ACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGC TACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTA TAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACC TAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTC CACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGA CAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGG GTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACA AACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCAT CGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGC AACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTC GTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAA GCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCG AGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA)(見圖 I)，然后大規(guī)模抽提質(zhì)粒，測定濃度后置_80°C備用。
步驟2.熒光素酶慢病毒載體的包裝與病毒滴度測定
大腸桿菌擴(kuò)增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質(zhì)粒，并純化測定濃度。
熒光素酶慢病毒載體用MV40轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞制備獲得。
將Luciferase-PRRL-CMV質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒分別按1: 3、1: 6、1:9轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，結(jié)果顯示Luciferase-PRRL-CMV質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒按1:6轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞效果最佳(見圖2)。在轉(zhuǎn)染48和72小時(shí)后收集293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞碎片后置_80°C 備用。用GFP-PRRL-CMV質(zhì)粒載體作為陽性對(duì)照。HIVp24ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度。
步驟3.熒光素酶慢病毒上清感染肺腺癌細(xì)胞系
將人LLC肺腺癌細(xì)胞在含10wt%小牛血清和lwt%雙抗的高糖DMEM中傳代培養(yǎng)。 取指數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，O. 25被％胰蛋白酶(含EDTA)消化，精確計(jì)數(shù)后按2 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔種植于六孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)7(Γ80%時(shí)，稀釋polybrene至培養(yǎng)基，使其終濃度為8 μ g/ ml，然后用熒光素酶慢病毒上清以最佳滴度感染LLC肺腺癌細(xì)胞，同時(shí)用GFP慢病毒上清做陽性對(duì)照，分別在感染后48h、72h和96h用倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)情況，正常傳代培養(yǎng)后用熒光測定儀和活細(xì)胞成像儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光素酶表達(dá)情況。以GFP為陽性對(duì)照，慢病毒上清感染LLC細(xì)胞后48h即可觀察到大部分細(xì)胞呈GFP陽性表達(dá)，72h增強(qiáng)增多，96h達(dá)最佳狀態(tài)(見圖3 )，用該條件進(jìn)行Luciferase-PRRL-CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染得到的細(xì)胞可用于高表達(dá)熒光素酶的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選。
步驟4.穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的肺腺癌細(xì)胞系的篩選和建立
用有限稀釋法先在IOcm培養(yǎng)皿種植不同濃度的熒光素酶慢病毒感染后LLC肺腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)至單細(xì)胞克隆形成后，鏡下挑取48個(gè)單克隆細(xì)胞至96孔板繼續(xù)克隆培養(yǎng)(每個(gè)單克隆細(xì)胞設(shè)復(fù)孔)，用熒光測定儀和活細(xì)胞成像儀分別檢測48個(gè)單克隆細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的表達(dá)，選取熒光素酶表達(dá)強(qiáng)、細(xì)胞生長情況良好的細(xì)胞克隆(如圖4中3號(hào)單細(xì)胞克隆) 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用于腫瘤模型的制作。
步驟5.穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的肺腺癌細(xì)胞腫瘤模型的建立
將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的LLC肺腺癌細(xì)胞(Luc-LLC)培養(yǎng)于含10wt%小牛血清和 lwt%雙抗的高糖DMEM中，37°C、5%volC02培養(yǎng)條件下傳代擴(kuò)增。取指數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，O.25被％胰蛋白酶(含EDTA)消化，醫(yī)用O. 9被％氯化鈉溶液重懸，離心洗滌，精確計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度備用。選取6 8周齡雌性C57BL/6J小鼠皮下接種Luc-LLC細(xì)胞(3 X IO6個(gè) /200μ1)。于SPF條件下正常飼養(yǎng)并定期觀察體內(nèi)成瘤情況。在接種后的第5、10、15、20、 25天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長軸(a)和短軸(b)，按公式V=0. 5xab2，計(jì)算腫瘤體積(mm3)； 在接種后的第7、14、21天用小動(dòng)物活體成像儀(德國BERTHOLD，NightOWL II LB983)檢測體內(nèi)腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度(photon/sec/cm2/steridian),用O. 4%戍巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，再按15mg/kg體重腹腔注射D-突光素鉀鹽(D-Luciferin Potassium Salt)工作液，10-15分鐘后，將裸鼠仰臥于小動(dòng)物活體成像儀載物臺(tái)上進(jìn)行圖像采集和分析，可以觀察到構(gòu)建的表達(dá)Luciferase的LLC細(xì)胞的C57BL/6J小鼠體內(nèi)腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度隨生長天數(shù)逐漸增強(qiáng)，且腫瘤生長曲線顯示腫瘤發(fā)光強(qiáng)度與腫瘤體積曲線正相關(guān)(見圖5)。
步驟6.待構(gòu)建的Luc-LLC C57BL/6J小鼠腫瘤模型腫瘤體積達(dá)IOOmm3左右將動(dòng)物隨機(jī)分組用于藥物治療。
分組治療如下(I)生理鹽水對(duì)照組；(2)Trap組(腫瘤部位對(duì)側(cè)皮下注射，lmg/kg 小鼠，每三天注射一次)；(3) Gemcitabine組(腹腔注射,60mg/kg小鼠，每三天注射一次)； (4) Trap和Gemcitabine聯(lián)合治療組(皮下注射Trap, lmg/kg小鼠，每三天注射一次；腹腔注射Gemcitabine,60mg/kg小鼠，每三天注射一次)。各組持續(xù)治療3周，分別在治療的第 3、6、9、12、15天測量腫瘤體積，并在第12天用活體成像儀檢測腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度，以此確定腫瘤的生長和藥物治療效果。活體成像定量分析結(jié)果顯示，對(duì)照組和治療組間腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度不同，且與治療后不同天數(shù)腫瘤生長曲線正相關(guān)，說明LLC細(xì)胞熒光素酶腫瘤模型能夠用來反映抗腫瘤藥物的治療效果(見圖6)。
權(quán)利要求
1.一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型，其特征在于所述腫瘤模型通過采用基因重組技術(shù)和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌LLC細(xì)胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤克隆細(xì)胞株，然后采用重組的LLC細(xì)胞接種于小鼠構(gòu)建而成。
2.一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，包括 (1)設(shè)計(jì)螢火蟲熒光素酶基因特異性引物；使用該特異性引物PCR擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒抽提后運(yùn)用基因重組方法將熒光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達(dá)載體PRRL-CMV空質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切和測序證實(shí)構(gòu)建的表達(dá)載體的正確性； (2)大腸桿菌擴(kuò)增熒光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質(zhì)粒，并純化測定濃度；將熒光素酶慢病毒表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)?；旌虾?，用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以產(chǎn)生含有螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；以人肺腺癌LLC為母細(xì)胞，用上述病毒上清進(jìn)行感染；進(jìn)行細(xì)胞亞克隆篩選，檢測單克隆細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況，篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的重組細(xì)胞株并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； (3)將得到的重組人肺腺癌細(xì)胞經(jīng)消化后重懸于氯化鈉溶液中，在裸鼠皮下接種該重組人肺腺癌細(xì)胞，監(jiān)測細(xì)胞皮下增殖情況，即得到可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述步驟(I)中的特異性引物為 上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG ； 下游引物CCTGTCGACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC ； 基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為采用Xba I和Sal I雙酶切。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中的熒光素酶慢病毒表達(dá)載體與慢病毒包裝質(zhì)粒的質(zhì)量比為 1:3、1:6 或 1:9。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述慢病毒包裝質(zhì)粒包括第三代慢病毒復(fù)制所需要的三個(gè)基因gag、pol 和 rev。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中的轉(zhuǎn)染試劑為MV40轉(zhuǎn)染試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細(xì)胞有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆篩選；通過熒光測定儀或活細(xì)胞成像儀檢測單克隆細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質(zhì)量百分比濃度為0. 9%。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的建立方法，其特征在于所述步驟(3)中通過游標(biāo)卡尺測量和活體成像儀監(jiān)測細(xì)胞皮下增殖情況。
10.一種如權(quán)利要求I所述的可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型的應(yīng)用，其特征在于所 述腫瘤模型應(yīng)用于觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于評(píng)估藥物治療效果的Luc-LLC腫瘤模型及其建立與應(yīng)用，所述腫瘤模型通過采用基因重組技術(shù)和慢病毒感染將螢火蟲熒光素酶基因引入人肺腺癌LLC細(xì)胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤克隆細(xì)胞株，然后采用重組的LLC細(xì)胞接種于小鼠構(gòu)建而成。本發(fā)明與傳統(tǒng)的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，并且可進(jìn)行活體觀察而不損傷動(dòng)物，結(jié)果更加可靠，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01K67/02GK102972339SQ20121044484
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者房健民, 周爽, 楊洋, 李棟 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院