專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治核桃炭疽病方面的應(yīng)用的制作方法
一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治核桃炭疸病方面的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其用途。
背景技術(shù)：
炭疽病是危害核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病害之一。世界各核桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。 主要危害果實(shí)、葉片、幼樹、嫩梢和芽，潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病時(shí)間短、爆發(fā)性強(qiáng)，一般病果率達(dá) 20 40%，嚴(yán)重者高達(dá)80%以上，落果率達(dá)50%以上。在收果前l(fā)(T20d迅速使果實(shí)發(fā)黑變爛， 嚴(yán)重影響核桃產(chǎn)量和品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
對(duì)于該病的防治，國外根據(jù)種植區(qū)、種植目的不同使用藥劑不同。苗圃和綠地以 Banner MAXX、代森錳鋅、波爾多液為主，人工林以多果定(Dodine)為主，多果定是目前唯一一個(gè)登記注冊(cè)的可以用在可食堅(jiān)果樹上防治炭疽病的殺菌劑。國內(nèi)防治炭疽病比較粗放，主要以退津特、甲基托布津、百菌清、波爾多液、仲丁胺、霉疫凈為主。長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑，導(dǎo)致病菌抗藥性增強(qiáng)，只有加大用藥劑量以控制病害，從而增加了生產(chǎn)成本和農(nóng)藥殘留量。核桃一般種植在山區(qū)、丘陵，大多數(shù)是水分涵養(yǎng)區(qū)域，如果大量使用化學(xué)農(nóng)藥，極易污染土壤，水分，對(duì)城市及當(dāng)?shù)赜盟彩菢O大的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)核桃炭疽病進(jìn)行生物防治是必然趨勢(shì)。利用拮抗微生物防治核桃病害有望成為代替化學(xué)藥劑的一種安全、無毒及有效的新方法。拮抗微生物不僅可以防病，而且還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，對(duì)改善林地生態(tài)系統(tǒng)，保持林間生物多樣性，以及維護(hù)林田生態(tài)平衡實(shí)現(xiàn)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展將起到重要作用。全球生物農(nóng)藥的產(chǎn)量以每年10%-20%的速度遞增。目前，全世界生物農(nóng)藥產(chǎn)品已經(jīng)超過100多種，其中90% 是微生物殺蟲劑，微生物殺菌劑相對(duì)較少。尤其是利用解淀粉芽孢桿菌防治核桃炭疽病還未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌菌株SDF-005，它可以用作生物農(nóng)藥，用來防治核桃炭疽病，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種采用解淀粉芽孢桿菌SDF-005制備的發(fā)酵液和菌劑。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株 SDF-005，所述菌株的保藏編號(hào)為CGMCC No. 6672。
本發(fā)明所提供的菌株為解淀粉芽孢桿菌SDF-005，是從山東省濟(jì)南市南部山區(qū)核桃林根際土壤中，采用稀釋分離法分離獲得的，已于2012年10月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 6672。其具有以下微生物學(xué)特性菌體桿狀，革蘭氏陽性菌，周生鞭毛，兼性厭氧。NA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落圓形，平展，乳白色，表面不規(guī)則，中間有3圓環(huán)形突起，邊緣整齊。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。該菌株的16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果如SEQ-I所示，該菌株的atpA基因序列測(cè)定結(jié)果如SEQ-2所示。
本發(fā)明提供了解淀粉芽孢桿菌SDF-005的培養(yǎng)方法或繁殖方法普通培養(yǎng)采用NA 培養(yǎng)基保存，實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)采用NYBD液體培養(yǎng)基。所述NA培養(yǎng)基配方蛋白胨10g、牛肉膏3g、瓊脂15g，蒸餾水IOOOmL ；NYBD配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，水lOOOmL，pH 7. 3。大量發(fā)酵培養(yǎng)配方(重量百分含量)黃豆粉3. 0%，玉米粉3. 0%， 輕質(zhì)碳酸鈣O. 2%，氯化鈉O. 1%，其余為水，pH 7. 5。
另一方面，本發(fā)明提供一種解淀粉芽孢桿菌SDF-005可濕性粉劑，它由下述重量份的原料制成，解淀粉芽孢桿菌SDF-005菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖0. 5_60、淀粉0.5-30、羧甲基纖維素0. 02-10、濕潤劑10040. 5_30、分散劑NNO 0. 5_20，所述可濕性粉劑中解淀粉芽孢桿菌SDF-005含量為0. 1-100億活菌/g。將上述原料混合均勻，控制加工溫度0-50°C，在氣流粉碎機(jī)或其它高目粉碎機(jī)，粉碎到150篩目以上水分控制在6-8% (質(zhì)量百分含量)，PH控制在7-7.5。
所述解淀粉芽孢桿菌SDF-005發(fā)酵液和菌粉通過包括以下步驟的方法制得
(I)將保存的解淀粉芽孢桿菌SDF-005轉(zhuǎn)移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱26°C恒溫培養(yǎng)2-3d ；
(2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的解淀粉芽孢桿菌SDF-005用無菌水以體積比1:10 稀釋，吸取lmL，置于NYBD液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)f 2d得到種子液；
(3)按3. 0%比例(體積比)將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26°C，培養(yǎng)時(shí)間36h，通風(fēng)比I :0. 8。發(fā)酵完成后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液菌數(shù)可達(dá)80億/g。
(4)將解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液與基質(zhì)(選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種)進(jìn)行混合均勻，干燥，經(jīng)干燥后發(fā)酵液菌數(shù)可達(dá)220億/g。所述發(fā)酵液與發(fā)酵液基質(zhì)的質(zhì)量比為1:8 10。
該微生物菌劑可以用作生物農(nóng)藥，用于防治核桃炭疽病。因此，又一方面，本發(fā)明提供解淀粉芽孢桿菌SDF-005或者其發(fā)酵液或者本發(fā)明的菌劑用于防治核桃炭疽病中的用途。
本發(fā)明還提供一種用于防治核桃炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的核桃施用解淀粉芽孢桿菌SDF-005或者其發(fā)酵液或者根據(jù)本發(fā)明的菌劑。
本發(fā)明還提供一種用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向植物施用解淀粉芽孢桿菌SDF-005或者其發(fā)酵液或者本發(fā)明的菌劑。
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SDF-005具有菌株新穎、高效、活體菌含量高的特點(diǎn)，其可濕性粉劑防治核桃炭疽病效果顯著，防治效果達(dá)到78. 22%，且核桃生長(zhǎng)健壯， 無藥害產(chǎn)生。同時(shí)具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，因而在生物防治核桃炭疽病中具有重要應(yīng)用前景。


圖I為以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的SDF-005菌系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是示例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例I 解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) SDF-005 (CGMCC No. 6672)的分離與鑒定
I.分離
本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌是從山東省濟(jì)南市南部山區(qū)核桃林根際土壤中采用土壤稀釋分離法分離獲得的，分離方法為
(I) 土樣采集從土壤表層到15cm處取樣200g，一個(gè)地點(diǎn)采幾個(gè)樣本，混合過粗篩，取25g作分離用；
(2)培養(yǎng)基平板制備將NA培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)和PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基融化，分別倒入滅菌培養(yǎng)皿，冷卻，制成NA和PDA平板；
(3)稱取Ig 土樣于滅菌試管中，加IOOmL無菌水，振蕩，制成10_2 土壤懸浮液，靜置5min，按10倍梯度稀釋到10_7 ；
(4)取上述土壤懸浮液O. 5mL,加到培養(yǎng)基平板上，用彎玻棒涂勻。置于培養(yǎng)箱 26 °C恒溫培養(yǎng)5-7d。
(5)將單個(gè)菌落在NA培養(yǎng)基上劃線，得到單菌落，轉(zhuǎn)移至NA試管斜面培養(yǎng)基中，至 26 °C恒溫培養(yǎng)。
(6)以核桃炭疽病菌為靶標(biāo)菌，采用對(duì)峙培養(yǎng)法，篩選到一株對(duì)核桃炭疽病菌具有較強(qiáng)抑制活性的菌株，編號(hào)SDF-005。
所述NA培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g、牛肉膏3g、瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 3 ;所述PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯(去皮切塊)200g,葡萄糖20g，瓊脂14g，蒸餾水1000mL。
2.菌株鑒定
(I)微生物學(xué)特性SDF-005菌株桿狀、具周生鞭毛，長(zhǎng)為6-11 μ m，寬0. 9-1. 6 μ m，革蘭氏染色陽性。菌株在NA和NB培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)48h后，菌落圓形，平展，呈乳白色， 表面不規(guī)則，中間有圓環(huán)形突起，邊緣不整齊，不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)形成菌膜，液體顏色棕黃色，渾濁，有沉淀。菌株表現(xiàn)菌株好氧生長(zhǎng)。
供試菌株SDF-005在所處理的各種溫度下，均可正常生長(zhǎng)；強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境不適宜該菌株生長(zhǎng)，pH5 9條件下，菌株可以正常生長(zhǎng)；NaCl濃度在2% 10%之間，菌株生長(zhǎng)性狀一致。氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)弱陽性，能利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)生尿素酶分解尿素，不產(chǎn)H2S, VP試驗(yàn)陽性，能利用苦杏仁甘、ZT，其它特性見下表I :
表1SDF-005菌株的生理生化特性
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株SDF-005,所述菌株的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6672。
2.權(quán)利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌菌株SDF-005在防治核桃炭疽病方面的用途。
3.一種包含權(quán)利要求I所述解淀粉芽孢桿菌菌株SDF-005的菌劑。
4.如權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征是，所述菌劑為可濕性粉劑。
5.如權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征是，所述可濕性粉劑由下述重量份的原料制成，解淀粉芽孢桿菌SDF-005菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖O. 5_60、淀粉O. 5_30、羧甲基纖維素O. 02-10、濕潤劑1004 O. 5-30、分散劑NNO O. 5_20，所述可濕性粉劑中解淀粉芽孢桿菌SDF-005含量為O. 1-100億活菌/g。
6.如權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征是，所述解淀粉芽孢桿菌SDF-005菌粉由下述方法制成， Cl)將解淀粉芽孢桿菌SDF-005轉(zhuǎn)移至NA試管斜面中，置于培養(yǎng)箱26°C恒溫培養(yǎng)2-3d ； (2)在無菌條件下，將培養(yǎng)好的解淀粉芽孢桿菌SDF-005用無菌水以體積比1:10稀釋，吸取lmL，置于NYBD液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)f 2d得到種子液； (3)按3.0%的體積比將種子液接種到大量發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26°C，培養(yǎng)時(shí)間36h，通風(fēng)比I :0. 8 ;所述大量發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)為黃豆粉3. 0%，玉米粉3. 0%，輕質(zhì)碳酸鈣O. 2%，氯化鈉O. 1%，其余為水，pH 7. 5 ； (4)將解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液與基質(zhì)進(jìn)行混合均勻，干燥；所述發(fā)酵液與發(fā)酵液基質(zhì)的質(zhì)量比為1:8 10。
7.如權(quán)利要求6所述的菌劑，其特征是，所述NA培養(yǎng)基為蛋白胨10g、牛肉膏3g、瓊脂15g，蒸餾水IOOOmL ;所述NYBD培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化鈉5g,水 IOOOmL, pH 7. 3。
8.如權(quán)利要求6所述的菌劑，其特征是，所述基質(zhì)選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種。
9.權(quán)利要求3-8中任意一項(xiàng)所述的菌劑在防治核桃炭疽病方面的用途。
10.一種用于防治核桃炭疽病的方法，其特征是，向具有炭疽病的核桃施用權(quán)利要求I的解淀粉芽孢桿菌SDF-005或者其發(fā)酵液或者權(quán)利要求3-8中任意一項(xiàng)所述的菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治核桃炭疽病方面的應(yīng)用。該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株SDF-005，保藏編號(hào)為CGMCC No.6672。該菌株或者用它制備的發(fā)酵液或者用它制備的菌劑可以用作生物農(nóng)藥，用于防治核桃炭疽病。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌SDF-005具有菌株新穎、高效、活體菌含量高的特點(diǎn)，其可濕性粉劑防治核桃炭疽病效果顯著，防治效果達(dá)到78.22%，且核桃生長(zhǎng)健壯，無藥害產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102925386SQ20121041075
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者牛贍光, 王清海, 劉幸紅, 段春華 申請(qǐng)人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院