專(zhuān)利名稱：一種生物農(nóng)藥和昆蟲(chóng)防治方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)合成及修飾的小分子干擾RNA領(lǐng)域，具體地，是涉及一種生物農(nóng)藥和昆蟲(chóng)防治方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(dsRNA)特異性地引起基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，它是進(jìn)化上高度保守且在生物界普遍存在的一種基因調(diào)控機(jī)制。1998年在線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans中首次發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，隨后在真菌、植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。RNAi的作用機(jī)制是體外導(dǎo)入的或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄生成的長(zhǎng)鏈dsRNA 被 Dicer 家族 RNase-III 切割成 21_25nt(喊基)的 siRNA, siRNA 進(jìn)一步與 Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC(RNA-induced silencing complex),最后由RISC介導(dǎo)siRNA反義鏈與靶mRNA分子互補(bǔ)結(jié)合引起同源靶mRNA分子的特異性降解。近幾年來(lái)RNAi研究取得了突破性進(jìn)展，被《Science》雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一,并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。以特異性副除或關(guān)閉昆蟲(chóng)特定基因的表達(dá)為基本思路，探索害蟲(chóng)防治的新策略，有望成了新型生物農(nóng)藥創(chuàng)制的熱門(mén)技術(shù)。線蟲(chóng)在攝入或局部注射dsRNA后，其RNAi效應(yīng)能傳遍整個(gè)有機(jī)體甚至是傳遞到后代，此被定義為系統(tǒng)性RNAi。昆蟲(chóng)必須具有體內(nèi)傳播RNAi效應(yīng)的機(jī)制，才能有望實(shí)現(xiàn)以siRNA為主效因子的生物農(nóng)藥防治策略。昆蟲(chóng)系統(tǒng)性RNAi效應(yīng)首次在赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)中發(fā)現(xiàn)，此蟲(chóng)幼蟲(chóng)期注射Tc-ASH基因的dsRNA,在成蟲(chóng)期表現(xiàn)出缺失鬃的顯型(Tomoyasu Y, Denell RE. Larval RNAi in Tribolium(Coleoptera)for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 2004, 214:575-578),并且此昆蟲(chóng)Distalless等基因的RNAi效應(yīng)會(huì)從親代傳遞至子代(Bucher G. Parental RNAi inTribolium(Coleoptera)-Curr Biol, 2002，12:R85_R86)。目前，系統(tǒng)性 RNAi 效應(yīng)已存在如下昆蟲(chóng)中得已驗(yàn)證雙翅目昆蟲(chóng)采采蠅；鞘翅目昆蟲(chóng)赤擬谷盜；膜翅目昆蟲(chóng)蜜蜂；直翅目昆蟲(chóng)蝗蟲(chóng)；蜚蠊目昆蟲(chóng)德國(guó)小蠊；鱗翅目昆蟲(chóng)斜紋夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾、淺棕蘋(píng)果蛾；半翅目昆蟲(chóng)豌豆蚜。系統(tǒng)性RNAi效應(yīng)在昆蟲(chóng)中的廣泛性，表明siRNA在害蟲(chóng)防治方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。鱗翅目(L印idoptera)昆蟲(chóng)綱中第二大目。完全變態(tài)。幼蟲(chóng)一般稱為毛蟲(chóng)，亦稱“蛄撕”。蛹為被蛹。成蟲(chóng)稱蛾或蝶，其翅和體上密被鱗片，故名。具吸收口器，形成長(zhǎng)形而能卷起的喙；復(fù)眼大；觸角變化多，呈絲狀、羽狀或櫛狀等。全世界已知有十四萬(wàn)種左右，我國(guó)已有記載的約兩萬(wàn)種。大多數(shù)種類(lèi)與國(guó)民經(jīng)濟(jì)有重大關(guān)系，如螟蟲(chóng)、粘蟲(chóng)、松毛蟲(chóng)和菜粉蝶、小菜蛾等，為農(nóng)林植物的重要害蟲(chóng)；家蠶、柞蠶和蓖麻蠶等，是著名的資源昆蟲(chóng)。
據(jù)最近幾年的相關(guān)報(bào)道，昆蟲(chóng)通過(guò)飼喂表達(dá)dsRNA的植物或菌株，能有效的阻斷昆蟲(chóng)目標(biāo)基因的表達(dá)。毛穎波等(2007)通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，讓植物自身產(chǎn)生P450基因的dsRNA。然后,將植物喂食棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)。dsRNA從食道進(jìn)入細(xì)胞,抑制棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)P450基因的表達(dá)，致使棉鈴蟲(chóng) 對(duì)棉子酚的抗性降低。最后，對(duì)棉鈴蟲(chóng)造成致命的影響。玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera Leconte)飼喂含有 V-ATPaseA等基因的dsRNA植物飼料，幼蟲(chóng)出現(xiàn)滯育或死亡，顯著降低了此蟲(chóng)對(duì)玉米根部的危害。田宏剛等(2009)利用具有雙17啟動(dòng)子的載體L4440和RNase III缺失的HT115(DE3)菌株，構(gòu)建了誘導(dǎo)表達(dá)能產(chǎn)生seCHSA基因dsRNA的工程菌株，飼喂甜菜夜蛾，導(dǎo)致個(gè)別蟲(chóng)體出現(xiàn)畸形或死亡。RNA干擾技術(shù)已應(yīng)用于小菜蛾功能基因的研究。如Z.-X. Yang等用微注射的方法導(dǎo)入cadherin基因的dsRNA，導(dǎo)致該蟲(chóng)的死亡率和性別比率增加，并且幼蟲(chóng)期出現(xiàn)滯育現(xiàn)象。通過(guò)飼喂的方法，導(dǎo)入小菜蛾細(xì)胞色素P450 (CYP6BG1)基因的dsRNA，致使該蟲(chóng)對(duì)除蟲(chóng)菊脂類(lèi)農(nóng)藥的抗性降低(Ma, A. M. B. , Tadashi, M. , Ken M. , Toshiharu, T.RNAinterference-mediated knockdown of a cytochrome P450,CYP6BG1, from thediamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin.Insect. 2009. Biochem. Mol. Biol. 39:38 - 46.)。據(jù)此，我們認(rèn)為小菜蛾具有系統(tǒng)性RNA干擾的能力，有可能實(shí)現(xiàn)以RNA干擾技術(shù)為手段的防治策略。雖然目前的研究開(kāi)啟了 RNAi技術(shù)在害蟲(chóng)防治方面應(yīng)用的新一頁(yè)，但其中基因特異dsRNA僅來(lái)自于轉(zhuǎn)基因植物或是工程菌株，抑或是體外轉(zhuǎn)錄生成。目前制約利用RNAi技術(shù)生產(chǎn)新型生物農(nóng)藥的重大共性和關(guān)鍵技術(shù)是一、現(xiàn)有利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入作物體系防治害蟲(chóng)的技術(shù)體系和策略存在轉(zhuǎn)基因植物食品安全性問(wèn)題；二、表達(dá)dsRNA的工程菌株見(jiàn)效慢、防效低，且環(huán)境適應(yīng)性難以評(píng)估；三、dsRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成成本高、穩(wěn)定性不好等。這些問(wèn)題極大的限制了該技術(shù)在害蟲(chóng)防治領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為克服以上的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種新的昆蟲(chóng)防治方法。具體技術(shù)方案如下一種昆蟲(chóng)防治方法，主要包括將針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)特定靶標(biāo)基因的SiRNA喂食鱗翅目昆蟲(chóng)，所述siRNA為體外化學(xué)合成17-50nt的雙鏈RNA，所述靶標(biāo)基因?yàn)閅 -氨基丁酸受體基因、或?yàn)閅-氨基丁酸受體基因和乙酰膽堿酯酶基因和、或?yàn)閅-氨基丁酸受體基因和線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因、或?yàn)閅 -氨基丁酸受體基因和線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因以及乙酰膽堿酯酶基因。更優(yōu)選地，將上述siRNA直接噴霧在鱗翅目昆蟲(chóng)食用的農(nóng)作物的葉片上，讓昆蟲(chóng)自然取食。本發(fā)明所述的昆蟲(chóng)防治方法，通過(guò)體外化學(xué)合成17-50nt雙鏈RNA (siRNA)的方法，還可通過(guò)化學(xué)修飾以及與陽(yáng)離子聚合物配伍增強(qiáng)了 siRNA的穩(wěn)定性和藥效，通過(guò)自然飼喂或噴霧含有特定靶標(biāo)基因siRNA的飼料來(lái)有效的阻斷昆蟲(chóng)靶基因mRNA的表達(dá)，對(duì)昆蟲(chóng)造成致命影響。該方法制備以siRNA為主效因子的生物農(nóng)藥，具有周期短、見(jiàn)效快、無(wú)毒、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛地使用。
本發(fā)明的另一目的是提供一種生物農(nóng)藥。一種生物農(nóng)藥，以針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)特定靶標(biāo)基因的siRNA為有效成份，所述siRNA為體外化學(xué)合成17_50nt的雙鏈RNA。優(yōu)選地，所述生物農(nóng)藥還包括有陽(yáng)離子聚合物為有效成份，更優(yōu)選地，所述陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺、殼聚糖、聚賴氨酸或明膠。優(yōu)選地，所述siRNA經(jīng)化學(xué)修飾或siRNA3’末端還設(shè)有以兩個(gè)脫氧核苷的組合的懸掛堿基，所述化學(xué)修飾為2’ -甲基化，氟代，5’ -PEG，膽固醇，或多肽等。優(yōu)選地，所述siRNA包括有針對(duì)Y -氨基丁酸受體基因的siRNA為SEQ ID NO. 19和 SEQID NO. 20,SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 中的一對(duì)
或多對(duì)。更優(yōu)選地，所述siRNA為還包括有針對(duì)線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因的siRNA為SEQ IDN0.1 及 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 及 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 中的一對(duì)或多對(duì)；和/或針對(duì)乙酰膽堿酯酶基因的siRNA為SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8、SEQIDN0.9 及 SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18 中的一對(duì)或多對(duì)。優(yōu)選地，所述鱗翅目昆蟲(chóng)為小菜蛾。本發(fā)明對(duì)昆蟲(chóng)直接飼喂含有特定靶標(biāo)基因的siRNA，導(dǎo)致昆蟲(chóng)該基因mRNA水平或蛋白質(zhì)水平的變化，通過(guò)該方法對(duì)昆蟲(chóng)對(duì)應(yīng)的某一特定基因的表達(dá)進(jìn)行抑制。由于采用化學(xué)合成的方法制備17-50nt siRNA，生產(chǎn)快捷，并可以通過(guò)化學(xué)修飾和與陽(yáng)離子聚合物配伍增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性和效果，方法簡(jiǎn)便；由于把所生產(chǎn)的siRNA直接噴霧在葉片上，讓昆蟲(chóng)自然取食即可，操作簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的農(nóng)藥施藥方式，可以廣泛地推廣。因此，采用本方法抑制昆蟲(chóng)基因的表達(dá)，可以為害蟲(chóng)防治提供新的方法。進(jìn)一步通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示這是一類(lèi)高效的生物殺蟲(chóng)劑。


圖I :為實(shí)施例I中飼喂siRNA的小菜蛾幼蟲(chóng)表現(xiàn)出死亡結(jié)果示意圖；圖2 :為實(shí)施例I中的qRT-PCR結(jié)果示意圖；圖3 :為實(shí)施例I中western blot結(jié)果示意圖；圖4 :為實(shí)例I中的ATP測(cè)定結(jié)果示意圖；圖5 :為實(shí)施例3中施藥后第5天的防治效果比較示意圖；圖6 :實(shí)施例5中小菜蛾表現(xiàn)出脫皮未盡的癥狀示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述生物農(nóng)藥中的siRNA的濃度通常大于lppm，優(yōu)選大于lOppm，更優(yōu)選為50ppm-500ppm。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可根據(jù)常識(shí)，按照實(shí)際需要，配比成合適的濃度，以及選擇合適的施藥時(shí)的葉面濃度，通常，濃度越大，效果越好。陽(yáng)離子聚合物的濃度和siRNA一樣，可以根據(jù)實(shí)際需要，配比成合適的濃度，通?？纱笥趌Oppm。優(yōu)選地，在所述生物農(nóng)藥中N (陽(yáng)離子聚合物)P (siRNA)的比為I :1-100 :1。具體無(wú)需贅述。
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例一本實(shí)例特別提供了小菜蛾線粒體復(fù)合物III IFe-S亞基基因的siRNA，通過(guò)自然飼喂此靶標(biāo)基因siRNA后對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)如小菜蛾造成了致命的影響。本實(shí)例是用于防治鱗翅目昆蟲(chóng)小菜蛾(Plutella xylostella)的方法。通過(guò)喂食含有沉默線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因(GeneBank登錄號(hào)為EU815629)的siRNA，從而阻斷昆蟲(chóng)線粒體電子傳遞，抑制昆蟲(chóng)ATP的形成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)昆蟲(chóng)的有效治理。線粒體復(fù)合物III又稱泛醌細(xì)胞色素C還原酶(Ubiquinol-cytochrome creductase),由9_11個(gè)亞基組成,包括兩個(gè)細(xì)胞色素b(b562和b566)、一個(gè)細(xì)胞色素Cl和一個(gè)Fe-S蛋白。其中Fe-S蛋白亞基負(fù)責(zé)將一個(gè)電子從還原型輔酶Q傳遞給細(xì)胞色素Cl，并將一個(gè)質(zhì)子釋放到膜間隙，以此產(chǎn)生膜電位用于ATP的形成(Trumpower B L. Cytochrome bclcomplexes ofmicroorganisms. Microbiological reviews, 1990，54:101-29)。本實(shí)施例的生物學(xué)原理就是通過(guò)沉默昆蟲(chóng)線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因mRNA，進(jìn)而阻斷昆蟲(chóng)線粒體電子傳遞，抑制ATP的形成，從而來(lái)達(dá)到害蟲(chóng)防治的目的。將化學(xué)合成的siRNA用DEPC稀釋后均勻涂布于甘藍(lán)葉面，通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)進(jìn)行自然飼喂涂有針對(duì)線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因siRNA的甘藍(lán)葉片，從而在阻斷昆蟲(chóng)特定基因如小菜蛾線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因的表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該昆蟲(chóng)的有效治理。此干擾效果可通過(guò)檢測(cè)昆蟲(chóng)mRNA或蛋白水平的改變來(lái)確定，如可通過(guò)檢測(cè)小菜蛾線粒體復(fù)合物III IFe-S亞基mRNA表達(dá)情況和其蛋白表達(dá)情況，抑或是小菜蛾幼蟲(chóng)ATP的合成情況，來(lái)確定干擾效果。如實(shí)驗(yàn)表明，小菜蛾取食其線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基的siRNA后，該基因mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，表現(xiàn)出電子傳遞受阻，最終因無(wú)法正常合成ATP而死亡。所述方法主要包括以下步驟(一)昆蟲(chóng)特定功能基因的選擇考慮到昆蟲(chóng)復(fù)合物III Fe-S亞基基因在線粒體電子傳遞中的關(guān)鍵作用，因此本發(fā)明選擇該特定功能的基因?yàn)槌聊瑢?duì)象，其基因序列參見(jiàn)GeneBank登錄號(hào)為EU815629。(二)小菜蛾線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因siRNA的設(shè)計(jì)和合成Si-UQCR_001 GCAAGTCCGTCACCTTCAA (19nt)正義鏈(5，-3，)5'GCAAGUCCGUCACCUUCAA dTdT 3’SEQ ID NO. I反義鏈(3，-5，)3’dTdT CGUUCAGGCAGUGGAAGUU 5’SEQ ID NO. 2、Si-UQCR_002 CATCCAGTGTAGTGAGCAA (19nt)正義鏈(5，-3，)5’CAUCCAGUGUAGUGAGCAAdTdT 3’SEQ ID NO. 3反義鏈(3，-5，)3’dTdT GUAGGUCACAUCACUCGUU 5’SEQ ID NO. 4Si-UQCR_003 CAACAACCTCTGAGAAGTT (19nt)正義鏈(5，-3，)5，CAACAACCUCUGAGAAGUUdTdT 3，SEQ ID NO. 5反義鏈(3，-5，)3’dTdT GUUGUUGGAGACUCUUCAA 5’SEQ ID NO. 6上述SEQ ID NOl — 6的siRNA的3’末端設(shè)有兩個(gè)TT的懸掛堿基。以上述每對(duì)siRNA做為有效成份，DEPC水稀釋?zhuān)苽涑伤錾镛r(nóng)藥。(三)將上述以siRNA為活性成份的生物農(nóng)藥均勻涂布于甘藍(lán)葉片并喂食小菜蛾二齡幼蟲(chóng)將siRNA用DEPC (diethypyrocarbonate)水稀釋成濃度為IOOppm的溶液(生物農(nóng)藥)，然后均勻涂布于甘藍(lán)葉片上，葉面濃度為3. Oii g/cm2，將該葉片喂食二齡小菜蛾。每對(duì)siRNA處理30頭蟲(chóng)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，并用DEPC水作為陰性對(duì)照組。之后，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分別調(diào)查蟲(chóng)子的死亡數(shù)，計(jì)算死亡率。(四)用熒光定量PCR的方法檢測(cè)昆蟲(chóng)體內(nèi)ISP基因mRNA的沉默水平待調(diào)查完蟲(chóng)子的死亡數(shù)，便收集表現(xiàn)出顯形癥狀的昆蟲(chóng)，如表現(xiàn)出死亡性狀的個(gè)體，提取總RNA，反轉(zhuǎn)成第一鏈cDNA，用于qRT-PCR的模板。之后用熒光定量PCR儀配套軟件計(jì)算出相對(duì)表達(dá)值。熒光定量PCR引物EU815629_FP GTTGTGAGGTCAGGGCATTT SEQ ID NO. 31EU815629_RP GGAGAGGCTGAGACACCAAC SEQ ID NO. 32(五)用WB檢測(cè)飼喂了siRNA的昆蟲(chóng)體內(nèi)目的蛋白的表達(dá)待昆蟲(chóng)飼喂特定的siRNA，如Si-UQCR_003 (SEQ ID NO 5 和 6) siRNA 后，在 12h，24h，48h，72h 收集表現(xiàn)出顯性癥狀的個(gè)體，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白濃度，在調(diào)整上樣總蛋白量一致的情況下，用15%SDS-PAGE凝膠電泳分離各樣品的總蛋白，之后，經(jīng)一抗、二抗孵育后，曝光顯影，得到如圖3結(jié)果。(六)飼喂了siRNA的昆蟲(chóng)體內(nèi)ATP量的檢測(cè)待昆蟲(chóng)飼喂特定的的siRNA，如51-即0 _0038丨1 應(yīng)后，在611，1211，2411，3611，4811，7211收集活體昆蟲(chóng)樣品，并同時(shí)收集飼喂了DEPC水的活體昆蟲(chóng)樣品，之后用碧云天公司生產(chǎn)ATP檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)S0026)測(cè)定其ATP的含量。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)自然飼喂涂有選定基因的SiRNA葉片后，昆蟲(chóng)體內(nèi)的線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因的表達(dá)沉默，目的基因mRNA表達(dá)水平降低，同時(shí)蛋白表達(dá)水平也受到抑制，進(jìn)而阻斷昆蟲(chóng)電子傳遞，抑制ATP的形成，從而導(dǎo)致昆蟲(chóng)個(gè)體顯著死亡。表I :飼喂涂有含ISP基因siRNA的生物農(nóng)藥甘藍(lán)葉片后對(duì)小菜蛾死亡率的對(duì)比統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種生物農(nóng)藥，其特征是，以針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)靶標(biāo)基因的siRNA為有效成份，所述siRNA為體外化學(xué)合成17-50nt的雙鏈RNA,所述祀標(biāo)基因?yàn)閅 -氨基丁酸受體基因、或?yàn)閅-氨基丁酸受體基因和乙酰膽堿酯酶基因和、或?yàn)閅 -氨基丁酸受體基因和線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因、或?yàn)閅 -氨基丁酸受體基因和線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因以及乙酰膽堿酯酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物農(nóng)藥，其特征是，還包括有陽(yáng)離子聚合物為有效成份。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物農(nóng)藥，其特征是，所述陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺、殼聚糖、聚賴氨酸或明膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求I一 3任一項(xiàng)所述的生物農(nóng)藥，其特征是，所述siRNA經(jīng)化學(xué)修飾或siRNA3’末端還設(shè)有以兩個(gè)脫氧核苷的組合的懸掛堿基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I一 3任一項(xiàng)所述的生物農(nóng)藥，其特征是，針對(duì)線粒體復(fù)合物III IFe-S亞基基因的 siRNA 為 SEQ ID NO. I 及 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 及 SEQ IDNO. 4、SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6中的一對(duì)或多對(duì)；針對(duì)乙酰膽堿酯酶基因的siRNA為SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10,SEQID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18 中的一對(duì)或多對(duì)；針對(duì)Y-氨基丁酸受體基因的siRNA為SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20、SEQ IDNO. 21 和 SEQID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 中的一對(duì)或多對(duì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I一 3任一項(xiàng)所述的生物農(nóng)藥，其特征是，所述鱗翅目昆蟲(chóng)為小菜蛾。
7.—種昆蟲(chóng)防治方法，其特征是，將權(quán)利要求I 一 6任一項(xiàng)所述的生物農(nóng)藥喂食鱗翅目昆蟲(chóng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的昆蟲(chóng)防治方法，其特征是，所述喂食方式為將所述生物農(nóng)藥直接噴霧在鱗翅目昆蟲(chóng)食用的農(nóng)作物的葉片上，讓昆蟲(chóng)自然取食，所述siRNA的葉面濃度大于 0. I u g/cm2。
9.一種用于制備針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的生物農(nóng)藥的siRNA，其特征是，所述siRNA包括有針對(duì)Y -氨基丁酸受體基因的siRNA為SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20、SEQID NO. 21和SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24 中的一對(duì)或多對(duì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于制備針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的生物農(nóng)藥的siRNA，其特征是，所述siRNA還包括有針對(duì)線粒體復(fù)合物III Fe-S亞基基因的siRNA為SEQ IDNO. I及SEQ IDNO. 2、SEQ ID NO. 3 及 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ IDNO. 6 中的一對(duì)或多對(duì)，和 / 或針對(duì)乙酰膽堿酯酶基因的siRNA為SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9及SEQ IDNO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ IDNO. 18 中的一對(duì)或多對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種昆蟲(chóng)防治方法，該方法為將針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)特定基因的siRNA與陽(yáng)離子聚合物配伍喂食鱗翅目昆蟲(chóng)，所述siRNA為體外化學(xué)合成17-50nt的雙鏈RNA，陽(yáng)離子聚合物為聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖、聚賴氨酸和明膠。本發(fā)明還涉及了一種生物農(nóng)藥，該農(nóng)藥以針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)特定基因的siRNA為有效成。本發(fā)明涉及通過(guò)飼喂含有昆蟲(chóng)特異基因如干擾昆蟲(chóng)線粒體復(fù)合物ⅢFe-S亞基基因、乙酰膽堿酯酶基因、γ-氨基丁酸受體基因等的siRNA對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的基因表達(dá)進(jìn)行抑制，從而干擾昆蟲(chóng)正常的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲(chóng)的有效治理；進(jìn)一步通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示這是一類(lèi)高效的生物殺蟲(chóng)劑。
文檔編號(hào)A01N57/16GK102960363SQ20121040880
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者張必良, 龔亮, 胡美英 申請(qǐng)人:廣州市銳博生物科技有限公司