專利名稱：月季試管苗試管內(nèi)開花及雌蕊單性開花的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種月季試管苗試管內(nèi)開花及雌蕊單性開花的方法及其培養(yǎng)基，屬植物生物技術領域或植物遺傳育種或迷你花卉生產(chǎn)領域。
背景技術：
月季(R.chinenSiS)，被稱為花中皇后又稱“月月紅”，薔薇科(Rosaceae)薔薇亞科，薔薇屬(Rosa)。常綠或半常綠低矮灌木，四季開花，多紅色，偶有白色，可作為觀賞植物，可作為藥用植物，也稱月季花。自然花期5至11月，花大型，有香氣，廣泛用于園藝栽培和切花。月季花種類主要有切花月季、食用玫瑰、藤本月季、地被月季等。中國是月季的原產(chǎn)地之一。陜北地區(qū)野生月季一般花較小在當年6月中旬開始開花，花期隨溫度變化較大。月季組培和快繁報道較多，呂汰(2000)研究發(fā)現(xiàn)適宜豐花月季離體側芽分花 的培養(yǎng)基為 MS+6-BA2. 00mg/L+NAA0. 10 O. 50mg/L,生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA0. 30 O. 50mg/L，其生根率在95%以上；在蛭石與營養(yǎng)土的雙層基質(zhì)中，生根試管苗的移栽成活率達90%。葉貽勛(1999)研究了月季組培過程中節(jié)省成本的辦法。莫磊興(1998)通過對5個切花月季品種組培快繁技術的研究，探討了品種、植物生長調(diào)節(jié)劑、溫度和光照強度等對外植體腋芽萌發(fā)、嫩莖增殖和生根的影響。莖段腋芽誘導適宜的條件是:MS+BA3 -Omg/L+NAA0 · 15mg/L，溫度 26°C左右。在 MS+BA3 · 0mg/L+IAA0 · 15mg/L 培養(yǎng)基上，嫩莖增殖達4倍以上。30001uX左右的自然散射光對增殖階段形成健壯嫩芽有利。小苗移植到沙子與椰糠混合的基質(zhì)上，成活率達80%以上。李啟任(1997)以月季為材料，進行較大規(guī)模組培快繁技術研究，改進了表面滅菌，發(fā)現(xiàn)MS+BA0. 5mg/誘導腋芽萌發(fā)成枝較好；MS+BA1. Omg/L+NAA0. lmg/L用于伊麗莎白及黃和平增殖較好，MS+BA2mg/L+NAA0. lmg/L用于黃玫瑰增殖較好，薩蔓莎及維莎則用MS+BA3mg/L+NAA0. lmg/L較好；MS+BA0. lmg/L 0. 2mg/L+NAA0. Img/用于各品種月季壯苗效果都理想；1/2MS+IBA0. 2mg/L 0. 5mg/L+活性炭5g/L能較好誘導各品種試管苗生根，但黃玫瑰用ΝΑΑ0. 2代替IBA效果更理想。李海燕(2004)通過誘導芽分化和誘導愈傷兩種途徑，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度、對月季外植體萌發(fā)和生根的影響。發(fā)現(xiàn)，細胞分裂素6-BA分別與3種生長素NAA，IAA, IBA配合使用均能誘導月季出芽。月季開花也有報道秦賀蘭(2004)報道了植物生長調(diào)節(jié)劑對露地月季盛夏開花的影響，發(fā)現(xiàn)激素處理可以有效促進腋芽萌發(fā)和增加萌芽數(shù)量。洪燕萍(2004)報道了月季以月季莖段在MS+NAA0. 5mg/L+BA5mg/L’中進行誘導培養(yǎng)在MS+NAA0. lmg/L+BA3mg/L增技培養(yǎng)，在培養(yǎng)基MS+NAA0. l/mgL+BA2mg/L，大苗開花。周俊輝(2008)用微型月季莖段誘導培養(yǎng)無菌不定芽苗為材料，研究生根與愈傷組織情況、不同氮磷比、不同濃度的蔗糖、2-iP、ABA等處理對離體培養(yǎng)下花芽誘導的影響。結果表明生根不長愈傷組織的無菌不定芽苗的花芽誘導率最低，不生根、長愈傷組織誘導率最高；不同的氮磷比對花芽的誘導率不同，高磷低氮有助于花芽的形成；55g/L的蔗糖濃度較其他濃度對花芽的誘導效果最好；外源激素處理中，2-P和ABA均不利于花芽的誘導。
目前報道的為不論是組培還是試管內(nèi)開花都不是陜北月季，他們沒有做到試管內(nèi)二倍體和單倍體同時開花的層次。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是。本發(fā)明的技術方案如下一種月季試管苗試管內(nèi)開花及雌蕊單性開花的方法，包括以下步驟(1)將適合陜北地區(qū)栽種的月季品種“月月紅”當年生的莖段，經(jīng)過無菌處理接入人工制作的MS培養(yǎng)基中，通過初代培養(yǎng)獲得第一代無根試管苗；然后在MS培養(yǎng)基中加入I. 2mg/L的6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)，在光照強度為I 5001x+2001x、相對濕度70% ±5%、溫度為24°C的條件下繼代培養(yǎng)25d ;獲得繁殖系數(shù)不低于6. 8的無根試管苗； (2)將繼代培養(yǎng)獲得的無根試管苗轉(zhuǎn)接在不含外源激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 8d，再轉(zhuǎn)入含脫落酸和O. 02mg/L的MS培養(yǎng)基中；通過變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為前5d在散光照射下培養(yǎng)，溫度維持早晨8:00 14:00持續(xù)升溫從18°C到26°C，26°C維持2h，然后逐步降溫從16:00 19:00溫度降到20°C，從19:00至晚上23:00溫度降到12°C，維持12°C至次日8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。從第6d開始轉(zhuǎn)為8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)；(3)將月季試管苗接入誘導開花的培養(yǎng)基中，采取變溫培養(yǎng)，前7d散光培養(yǎng)在光照強度為15001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;從第8d開始轉(zhuǎn)為8:00 20:00恒溫250C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)；二倍體開花后重復變溫培養(yǎng)方式8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% 5%，約5d后由雌蕊形成單性花蕾，轉(zhuǎn)為維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)；培養(yǎng)約2 5d后開放；所述誘導開花的培養(yǎng)基成分如下氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L,硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亞鐵(FeSO4. 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L,硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L，硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L，鑰酸鈉(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸紙卩多辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸O. 6mg/L,肌醇120mg/L,氨基己酸5. Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L, 6-卞氨基腺嘌呤(6_BA)0. 5mg/L,脫落酸(ABA)O. OOlmg/L，3-吲哚乙酸(IBA) O. 2mg/L, pH = 5. 8 ;蔗糖25g/L，瓊脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。與現(xiàn)有 MS培養(yǎng)基相比氯化鈣、硝酸氨、硝酸鉀、硫酸鎂等大量元素的含量降低，微量元素和有機元素的含量增減。所述的方法,所述的月季(R.chinensis)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa),在陜北野生的月季花。一種月季試管苗二倍體花雌蕊誘導開花的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L,硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L,鑰酸鈉(NaZMoO4 · 2H20)0. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸毗哆辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸 O. 6mg/L,肌醇 120mg/L,氨基己酸 5. Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L,6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH=5. 8。該方法可使二倍體試管苗開花率達到50%左右；可使二倍體花和雌蕊單倍體花呈塔式開放并且同時存在20 35d、開花率達到30%左右。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。步驟一將月季當年生的莖短剪成長約5cm帶回實驗室。先在自來水下沖洗5 IOmin后，再用84消毒液15ml加蒸懼水到IOOml中浸泡6 8min。然后轉(zhuǎn)入凈化工作臺備用。在凈化工作臺中，將月季莖段用75%乙醇+1滴吐溫20滅菌10 15s，然后轉(zhuǎn)入O. 1%氯化汞+1滴吐溫20中滅菌6min，滅菌結束后用無菌水清洗3 5次。剪掉浸毒部位，余下的部分至少含一個芽體，接入準備好的MS培養(yǎng)基中。等接入的莖段中的液體萌發(fā)并長到3 5cm長后，將新形成的芽體取出，轉(zhuǎn)接到在MS培養(yǎng)基中加入I. 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)的培養(yǎng)基中，在光照強度為I 5001x±2001x、相對濕度70% ±5%、溫度為24°C的條件下培養(yǎng)25d。通過三次連續(xù)實驗，第一次共接入35個液體，獲得了 261個新芽體，第二次實驗共接入28個芽體獲得了 191個新芽體，第三次實驗共接入69個芽體獲得了 471個新芽體。繁殖系數(shù)均不低于6. 8。步驟二將繼代培養(yǎng)獲得的無根試管苗在不含激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)一次，培養(yǎng)時間為6 8d，培養(yǎng)結束后將植株轉(zhuǎn)入含脫落酸和O. 02mg/L的MS培養(yǎng)基中。采用變溫培養(yǎng)的方式培養(yǎng)。通過變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為前5d在散光照射下培養(yǎng)，溫度維持早晨8:00 14:00持續(xù)升溫從18°C到26°C，26°C維持2h，然后逐步降溫從16:00 19:00溫度降到20V，從19:00至晚上23:00溫度降到12°C，維持12°C至次日8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。從第6d開始轉(zhuǎn)為8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16 °C，維持16 °C至8:00 ;在光照強度為I5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)。一般可形成50%左右的試管花卉。第一次實驗150株，獲得76株開花試管苗、第二次實驗230株獲得109株開花試管苗、第三次300株獲得157株開花試管苗。上述培養(yǎng)基配方為
氯化鈣(CaCl2·2Η20) 315mg/L、原MS 培養(yǎng)基中為 440mg/L ;硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,原MS培養(yǎng)基中為1600mg/L ;硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L、原MS培養(yǎng)基中為1900mg/L ;硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)300mg/L、原 MS 培養(yǎng)基中為 370mg/L ;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L、原 MS培養(yǎng)基中為170mg/L ;硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L、原MS培養(yǎng)基中為27. 8mg/L ；己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L、原 MS 培養(yǎng)基中為 37. 3mg/L ；硼酸(H3BO3) 20mg/L、原 MS培養(yǎng)基中為6. 2mg/L ;硫酸錳(MnSO4. H2O) 120. Omg/L、原MS培養(yǎng)基中為22. 3mg/L ;硫酸鋅(ZnSO4 ·7Η20) 11. Omg/L、原MS培養(yǎng)基中為8. 6mg/L ;，鑰酸鈉(NaZMoO4. 2H20)O. 30mg/L、原MS培養(yǎng)基中為O. 25mg/L ;硫酸銅(CuSSO4 · 5H20)O. 030mg/L、原MS培養(yǎng)基中為O. 025mg/L ;鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L、原MS培養(yǎng)基中為O. lmg/L ;鹽酸毗哆辛(維生素B6) O. 6mg/L、原MS培養(yǎng)基中為O. 5mg/L ;煙酸O. 6mg/L、原MS培養(yǎng)基中為O. 5mg/L ;肌醇120mg/L、原MS培養(yǎng)基中為100mg/L ;氨基己酸5. Omg/L、原MS培養(yǎng)基中為2. Omg/L ;蔗糖25g/L，瓊脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L,脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L, pH = 5· 8ο步驟四將步驟二中獲得的月季試管苗接入上述培養(yǎng)基中，采取變溫培養(yǎng)，前7d散光培養(yǎng)在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;從第8d開始轉(zhuǎn)為8:00 20:00恒溫25 V，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)；二倍體開花后重復變溫培養(yǎng)方式8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%，約5d后由雌蕊形成單性花蕾，轉(zhuǎn)為維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)。培養(yǎng)約2 5d后開放。該方法可獲得30%左右的雙層花。第一次試驗共接種122株，獲得二倍體和雌蕊單倍體開花的植株43株；第二次實驗共接種150株，獲得二倍體和雌蕊單倍體開花的植株55株；第一次試驗共接種136株，獲得二倍體和雌蕊單倍體開花的植株42株。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種月季試管苗試管內(nèi)開花及雌蕊單性開花的方法，其特征在于，包括以下步驟(I)將適合陜北地區(qū)栽種的月季品種“月月紅”當年生的莖段，經(jīng)過無菌處理接入人工制作的MS培養(yǎng)基中，通過初代培養(yǎng)獲得第一代無根試管苗；然后在MS培養(yǎng)基中加入I. 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)，在光照強度為I 5001x±2001x、相對濕度70% ±5%、溫度為24°C的條件下繼代培養(yǎng)25d ;獲得繁殖系數(shù)不低于6. 8的無根試管苗； (2)將繼代培養(yǎng)獲得的無根試管苗轉(zhuǎn)接在不含外源激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 8d，再轉(zhuǎn)入含脫落酸和O. 02mg/L的MS培養(yǎng)基中；通過變溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為前5d在散光照射下培養(yǎng)，溫度維持早晨8:00 14:00持續(xù)升溫從18°C到26°C，26°C維持2h，然后逐步降溫從16:00 19:00溫度降到20°C，從19:00至晚上23:00溫度降到12°C，維持12°C至次日8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。從第6d開始轉(zhuǎn)為8:00 20:00恒溫25 V，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)； (3)將月季試管苗接入誘導開花的培養(yǎng)基中，采取變溫培養(yǎng)，前7d散光培養(yǎng)在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;從第8d開始轉(zhuǎn)為8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18 °C，0:00 4:00溫度降到16 °C，維持16 °C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)；二倍體開花后重復變溫培養(yǎng)方式8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%，約5d后由雌蕊形成單性花蕾，轉(zhuǎn)為維持日夜恒溫24°C培養(yǎng)；培養(yǎng)約2 5d后開放； 所述誘導開花的培養(yǎng)基成分如下氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L，硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L,硫酸鎂(MgSO4. 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L，硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L，鑰酸鈉(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸紙卩多辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸O. 6mg/L,肌醇120mg/L,氨基己酸5.Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L, 6-卞氨基腺嘌呤(6_BA)0. 5mg/L,脫落酸(ABA)O. OOlmg/L，3-吲哚乙酸(IBA) O. 2mg/L, pH = 5. 8 ;蔗糖25g/L，瓊脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的月季(R.chinensis)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa),在陜北野生的月季花。
3.一種月季試管苗二倍體花雌蕊誘導開花的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L,硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L,鑰酸鈉(NaZMoO4. 2H20)0. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸毗哆辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸 0. 6mg/L,肌醇 120mg/L,氨基己酸 5. Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L,6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ΑΒΑ) 0. 001mg/L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L, pH=5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種月季試管苗試管內(nèi)開花及雌蕊單性開花的方法及其培養(yǎng)基，包括以下步驟①繼代培養(yǎng)獲得的無根試管苗；②月季無根試管苗二倍體試管內(nèi)開花；③月季試管苗二倍體花雌蕊誘導開花；該方法可使二倍體試管苗開花率達到50％左右；可使二倍體花和雌蕊單倍體花呈塔式開放并且同時存在20～35d、開花率達到30％左右。
文檔編號A01H4/00GK102870681SQ20121040832
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優(yōu)先權日2012年10月22日
發(fā)明者齊向英, 陳宗禮, 張向前, 陳國梁, 薛皓, 孫志宏 申請人:延安大學