專利名稱：百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超低溫保存領(lǐng)域，具體涉及一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法。
背景技術(shù)：
百子蓮(Agapanthus praecox ssp. orientalis)又稱‘藍(lán)百合’，為多年生根莖類花卉，原產(chǎn)非洲南部地區(qū)。百子蓮葉形秀麗，花朵姿態(tài)優(yōu)美，花色淡雅，花期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，具備抗逆性強(qiáng)，觀賞性強(qiáng)的特點(diǎn)，從其葉片及根莖的藥用成分利用到花的觀賞，從庭院栽培到切花生產(chǎn)，擁有較高的觀賞價(jià)值及應(yīng)用價(jià)值，是西方發(fā)達(dá)國(guó)家高檔鮮切花、盆花和沿海公園地被材料，也是除玫瑰花之外最能表達(dá)愛意的愛情花。為了快速繁殖引進(jìn)的優(yōu)良種質(zhì)資源，需要開展百子蓮優(yōu)良種質(zhì)資源無(wú)性擴(kuò)繁技術(shù)研究。但發(fā)現(xiàn)百子蓮胚性愈傷組織增殖速率在繼代3周左右達(dá)到最大，以后開始逐漸下降。為維持較高的細(xì)胞增殖速率，必須每隔2 3周繼代一次，但長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)繼代在高濃度激素增殖培養(yǎng)基上會(huì)引起細(xì)胞胚性喪失或胚胎敗 育等問題。而胚性細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間繼代培養(yǎng)引起胚性喪失是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生中普遍存在的一個(gè)問題。重復(fù)啟動(dòng)胚性愈傷組織誘導(dǎo)不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢，還有可能引起體細(xì)胞變異，無(wú)法為新品種的培育提供充分的材料。因此，研究建立一套細(xì)胞存活率高、遺傳性穩(wěn)定的百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存技術(shù)體系是亟待解決的技術(shù)問題。超低溫保存(Cryopreservation)是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)現(xiàn)代種質(zhì)資源離體保存技術(shù)。通常在液氮中保存，被保存材料細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，處在相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)，達(dá)到長(zhǎng)期保存種質(zhì)的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續(xù)繼代的中長(zhǎng)期保存方式。玻璃化法(Vitrification)超低溫保存是將細(xì)胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護(hù)劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結(jié)晶的玻璃化態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。該方法具有簡(jiǎn)便、成本低、保存材料遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外先后對(duì)200多種植物的不同外植體進(jìn)行了超低溫保存技術(shù)研究，但有些植物(如熱帶植物或者含水量高的植物)恢復(fù)培養(yǎng)后成活率不高或根本不能成活，百子蓮屬于熱帶植物，其胚性愈傷組織含水量較高，是較難保存的植物材料，百子蓮超低溫保存技術(shù)也尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有無(wú)性擴(kuò)繁技術(shù)的不足，提供一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，用于百子蓮種質(zhì)資源的保存，為體細(xì)胞胚發(fā)生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑，將對(duì)熱帶及含水量較高的植物資源的保存以及無(wú)性擴(kuò)繁技術(shù)體系的完善起到指導(dǎo)作用。本發(fā)明首先公開了一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，為對(duì)百子蓮胚性愈傷組織進(jìn)行低溫-高滲預(yù)處理后，依次置于裝載液和玻璃化溶液中進(jìn)行脫水處理，最后將脫水處理后的胚性愈傷組織重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中進(jìn)行保存。
較優(yōu)的，所述百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法具體步驟如下I)低溫-高滲預(yù)處理將百子蓮胚性愈傷組織置于預(yù)處理培養(yǎng)基中，4°C培養(yǎng)；2)脫水處理將步驟I)預(yù)處理后的百子蓮胚性愈傷組織置于裝載液內(nèi)脫水處理后，吸除表面的裝載液，再置于玻璃化溶液中，于0°c進(jìn)一步脫水處理；3)液氮保存除去步驟2)進(jìn)一步脫水處理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行保存。較優(yōu)的，步驟I)所述百子蓮胚性愈傷組織是指繼代培養(yǎng)20d，易碎、松散的百子蓮胚性愈傷組織。更優(yōu)的，所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有I I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基。較優(yōu)的，步驟I)所述預(yù)處理培養(yǎng)基是蔗糖含量為O. 3 O. 7M的MS固體培養(yǎng)基； 預(yù)處理的培養(yǎng)時(shí)間為I 5d。更優(yōu)的，步驟I)所述預(yù)處理培養(yǎng)基為含有O. 5M蔗糖的MS固體培養(yǎng)基；預(yù)處理的培養(yǎng)時(shí)間為2d。步驟I)所使用的預(yù)處理培養(yǎng)基的其他成分與MS固體培養(yǎng)基相同，僅將MS固體培養(yǎng)基中3wt%的蔗糖含量替換為O. 3 O. 7M的蔗糖含量。較優(yōu)的，步驟2)所述裝載液為含有2M丙三醇、O. 4M蔗糖、IOmM KNOj^MS培養(yǎng)液。較優(yōu)的，步驟2)所述玻璃化溶液為含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt% 二甲基亞砜、O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。較優(yōu)的，步驟2)裝載液脫水處理的時(shí)間為20 80min，玻璃化溶液脫水處理的時(shí)間為20 80min。更優(yōu)的，步驟2)裝載液脫水處理的時(shí)間為60min，玻璃化溶液脫水處理的時(shí)間為40mino本發(fā)明另一方面公開了一種針對(duì)上述百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存的解凍及恢復(fù)培養(yǎng)方法，為將玻璃化超低溫保存的胚性愈傷組織從液氮中取出，置于35 40°C水浴中快速解凍，然后用洗滌液洗滌，再吸干表面的洗滌液，最后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。較優(yōu)的，35 40°C水浴中快速解凍的時(shí)間為I 2min，優(yōu)選的為2min。較優(yōu)的，所述洗滌液為含有I. 2M蔗糖和IOmM KNO3的MS培養(yǎng)液。較優(yōu)的，使用洗滌液洗滌2 4次，每次8 12min。優(yōu)選的，使用洗滌液洗滌3次，每次lOmin。較優(yōu)的，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基。更優(yōu)的，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基。本發(fā)明所使用的恢復(fù)培養(yǎng)基的其他成分與MS固體培養(yǎng)基相同，僅增加了 I
I.5mg/L含量的毒莠定。較優(yōu)的，所述恢復(fù)培養(yǎng)的條件為黑暗環(huán)境，恢復(fù)培養(yǎng)的溫度為23 27°C。更優(yōu)的，所述恢復(fù)培養(yǎng)的條件為黑暗環(huán)境，恢復(fù)培養(yǎng)的溫度為25°C。本發(fā)明所述MS固體培養(yǎng)基的組成為現(xiàn)有的MS固體培養(yǎng)基組成，本發(fā)明所述MS培養(yǎng)液的組成比MS固體培養(yǎng)基的組成少了蔗糖和瓊脂兩種成分，其他組成不變；并且本發(fā)明的MS培養(yǎng)液還可以根據(jù)需要添加外源物質(zhì)，例如醇類、蔗糖等。
本發(fā)明所使用的MS固體培養(yǎng)基為IL培養(yǎng)基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mgKH2P04，370mg MgSO4 ·7Η20，440mg CaCl2 ·2Η20，37. 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 ·7Η20，IOOmg肌醇,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸批B多醇,O. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸,O. 83mgKI,6. 2mgH3BO3, 22. 3mg MnSO4 ·4Η20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mg Na2MoO4 *2H20,0. 025mg CuSO4 · 5H20,0. 025mg CoCl2 · 6H20，30g蔗糖，IOg瓊脂粉，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5. 8。本發(fā)明所使用的MS培養(yǎng)液為IL培養(yǎng)基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mgKH2PO4, 370mg MgSO4 · 7H20,440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20,IOOmg肌醇,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸批B多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸,0. 83mgKI,6. 2mgH3BO3, 22. 3mg MnSO4 *4H20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mg Na2MoO4 *2H20,0. 025mg CuSO4 · 5H20,0. 025mgCoCl2 · 6H20，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.8。在液氮中保存時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)胚性愈傷組織存活率沒有影響，因此，可以實(shí)現(xiàn)百子蓮胚性愈傷組織長(zhǎng)期保存的目的。 本發(fā)明通過對(duì)玻璃化超低溫保存過程中處理方法、條件、試劑的特殊設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了百子蓮胚性愈傷組織的超低溫保存，為百子蓮種質(zhì)資源的保存提供了技術(shù)保證，為體細(xì)胞胚發(fā)生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑，將對(duì)熱帶或含水量較高的植物資源的保存以及無(wú)性擴(kuò)繁技術(shù)體系的完善起到指導(dǎo)作用。


圖I :恢復(fù)培養(yǎng)30d胚性愈傷組織增殖狀態(tài)圖2 :恢復(fù)培養(yǎng)65d胚性愈傷組織增殖狀態(tài)
具體實(shí)施例方式在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例II.實(shí)驗(yàn)材料I. I實(shí)驗(yàn)對(duì)象百子蓮胚性愈傷組織在含有I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基中，25°C增殖20d，獲得的易碎、松散的胚性愈傷組織作為玻璃化超低溫保存的實(shí)驗(yàn)對(duì)象(制備方法可參考文獻(xiàn)“藍(lán)百合快速繁殖技術(shù)的研究”，范現(xiàn)麗，2009，上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文)。I. 2實(shí)驗(yàn)試劑I. 2. I裝載液為含有2M丙三醇、O. 4M蔗糖、IOmM KNO3的MS培養(yǎng)液。I. 2. 2玻璃化溶液為含有30 七％丙三醇、15wt%乙二醇、15wt% 二甲基亞砜、O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。I. 2. 3洗滌液為含有I. 2M蔗糖和IOmM KNO3的MS培養(yǎng)液。1.2.4預(yù)處理培養(yǎng)基是蔗糖含量分別為O. 3M、0. 5M、0. 7M的MS固體培養(yǎng)基I. 2. 5恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基。I. 2. 6MS 固體培養(yǎng)基IL培養(yǎng)基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4,370mgMgS04 · 7H20，440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌酉享,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸卩比卩多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3,22. 3mgMnS04 ·4Η20,8. 6mg ZnSO4 ·7Η20,0. 25mg Na2MoO4 ·2Η20,0. 025mg CuSO4 ·5Η20,0. 025mgCoCl2 · 6H20，30g蔗糖，IOg瓊脂粉，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.8。I. 2. 7MS 培養(yǎng)液1L 培養(yǎng)基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4,370mgMgS04 · 7H20，440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌酉享,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸卩比卩多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3,22. 3mgMnS04 ·4Η20，8· 6mg ZnSO4 ·7Η20，0· 25mg Na2MoO4 ·2Η20，0· 025mg CuSO4 ·5Η20，0· 025mgCoCl2 · 6Η20，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5. 8。2.實(shí)驗(yàn)方法2. I低溫-高滲預(yù)處理培養(yǎng)基的篩選
通過蔗糖調(diào)節(jié)預(yù)處理培養(yǎng)基的滲透壓，使預(yù)處理培養(yǎng)基成分為分別含有O. 3、0. 5、O. 7M蔗糖的MS培養(yǎng)基，取三份相同的百子蓮胚性愈傷組織分別在上述三種含不同蔗糖濃度的MS培養(yǎng)基中4°C條件下預(yù)處理2d后，放入裝載液中室溫下脫水處理40min，吸除愈傷組織表面的裝載液，再放入玻璃化溶液中于0°C進(jìn)一步脫水40min、換上新的玻璃化溶液后，迅速放入液氮保存lh。超低溫保存Ih后，將三組胚性愈傷組織從液氮中取出，置于40°C水浴中快速解凍，然后用培養(yǎng)液洗滌3次，再用無(wú)菌濾紙吸干表面的培養(yǎng)液，最后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)為黑暗條件25°C。表I不同滲透壓培養(yǎng)條件對(duì)玻璃化超低溫保存百子蓮胚性愈傷組織相對(duì)存活率的影響
權(quán)利要求
1.一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，為對(duì)百子蓮胚性愈傷組織進(jìn)行低溫-高滲預(yù)處理后，依次置于裝載液和玻璃化溶液中進(jìn)行脫水處理，最后將脫水處理后的胚性愈傷組織重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中進(jìn)行保存。
2.如權(quán)利要求I所述的超低溫保存方法，其特征在于，具體步驟如下 1)低溫-高滲預(yù)處理將百子蓮胚性愈傷組織置于預(yù)處理培養(yǎng)基中，4°C培養(yǎng)； 2)脫水處理將步驟I)預(yù)處理后的百子蓮胚性愈傷組織置于裝載液內(nèi)脫水處理后，吸除表面的裝載液，再置于玻璃化溶液中，于0°C進(jìn)一步脫水處理； 3)液氮保存除去步驟2)進(jìn)一步脫水處理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行保存。
3.如權(quán)利要求2所述的超低溫保存方法，其特征在于，步驟I)所述百子蓮胚性愈傷組織為繼代培養(yǎng)20d，易碎、松散的百子蓮胚性愈傷組織。
4.如權(quán)利要求3所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有I I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求2所述的超低溫保存方法，其特征在于，步驟I)所述預(yù)處理培養(yǎng)基是蔗糖含量為O. 3 O. 7M的MS固體培養(yǎng)基；預(yù)處理的培養(yǎng)時(shí)間為I 5d。
6.如權(quán)利要求I或2任一權(quán)利要求所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述裝載液為含有2M丙三醇、O. 4M蔗糖、IOmM KNO3的MS培養(yǎng)液；所述玻璃化溶液為含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt% 二甲基亞砜、O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。
7.如權(quán)利要求I或2任一權(quán)利要求所述的超低溫保存方法，其特征在于，裝載液脫水處理的時(shí)間為20 80min，玻璃化溶液脫水處理的時(shí)間為20 80min。
8.一種針對(duì)權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法的解凍及再培養(yǎng)方法，為將玻璃化超低溫保存的百子蓮胚性愈傷組織從液氮中取出，置于35 40°C水浴中快速解凍，然后用洗滌液洗滌，再吸干表面的洗滌液，最后轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求8所述的解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述洗滌液為含有I.2M蔗糖和IOmM KNO3的MS培養(yǎng)液。
10.如權(quán)利要求8所述的解凍及再培養(yǎng)方法，其特征在于，所述恢復(fù)培養(yǎng)基為含有I .1.5mg/L毒莠定的MS固體培養(yǎng)基，所述恢復(fù)培養(yǎng)的條件為黑暗環(huán)境，恢復(fù)培養(yǎng)的溫度為.23 27。。。
全文摘要
本發(fā)明涉及超低溫保存領(lǐng)域，具體涉及一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，為對(duì)百子蓮胚性愈傷組織進(jìn)行低溫-高滲預(yù)處理后，依次置于裝載液和玻璃化溶液中進(jìn)行脫水處理，最后將脫水處理后的胚性愈傷組織重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中進(jìn)行保存。本發(fā)明通過對(duì)玻璃化超低溫保存過程中處理方法、條件、試劑的特殊設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了百子蓮胚性愈傷組織的超低溫保存，為百子蓮種質(zhì)資源的保存提供了技術(shù)保證，為體細(xì)胞胚發(fā)生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑，將對(duì)熱帶或含水量較高的植物資源的保存以及無(wú)性擴(kuò)繁技術(shù)體系的完善起到指導(dǎo)作用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102823582SQ201210349629
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者申曉輝, 李曉丹, 任麗, 張荻 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)