專(zhuān)利名稱(chēng)：一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，植物病害防治主要依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)中做出了巨大貢獻(xiàn)，但化學(xué)農(nóng)藥普遍使用和農(nóng)藥用量的增加產(chǎn)生了一系列問(wèn)題，如病原菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題。這些問(wèn)題增加了農(nóng)田生產(chǎn)成本，同時(shí)也使本身具有優(yōu)良品質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品因農(nóng)藥的過(guò)度使用而受影響。新的防治技術(shù)和病害防治手段成為植?？萍脊ぷ髡咛剿鞯姆较?，其中利用枯草芽孢桿菌防治植物病害成為研究熱點(diǎn)?？莶菅挎邨U菌是一種有益的土壤細(xì)菌，具有發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。枯草芽孢桿菌對(duì)多種病原菌具有拮抗性能，生產(chǎn)中用于防治多種植物病 害。例如用來(lái)防治芒果軟腐病、辣椒炭疽病、蘋(píng)果輪紋病、水稻紋枯病、水稻白葉枯病和一些鐮刀菌引起的病害，相關(guān)研究比較深入，取得了顯著的研究進(jìn)展。以水稻為例，受到多種病原菌的危害。植物病害水稻是我省主要的糧食作物，優(yōu)質(zhì)稻米在我省種植面積有擴(kuò)大的趨勢(shì)，其中以粳稻類(lèi)品種所占面積甚大，這些密植、大穗型、優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)稻米為病蟲(chóng)害的發(fā)生提供了充裕的營(yíng)養(yǎng)和繁殖條件。近年來(lái)我省水稻主要病害的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。稻瘟病在全省范圍內(nèi)均有發(fā)生。生產(chǎn)上，水稻稻瘟病的防治主要以三環(huán)唑、多菌靈、還有一些以有機(jī)磷為主的化學(xué)農(nóng)藥為主，有機(jī)磷類(lèi)的農(nóng)藥在高溫時(shí)施藥容易造成人畜中毒。江蘇省水稻稻瘟病的防治采取的是預(yù)防為主的防治思路，分別在苗期和孕穗期進(jìn)行防治，大量農(nóng)藥的投入，給農(nóng)民造成了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)也對(duì)稻米的品質(zhì)和稻田生態(tài)環(huán)境造成了不良影響。江蘇省水稻稻瘟病的防治面積大約在7000萬(wàn)畝左右(次/年)，僅每年在防治水稻稻瘟病上的開(kāi)支在I. 75億元人民幣，給農(nóng)民造成了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，病害的發(fā)生和大量化學(xué)農(nóng)藥的使用嚴(yán)重的影響了稻米品質(zhì)。江蘇省抗白葉枯病育種已經(jīng)缺乏有效的抗病基因，水稻白葉枯病在我省的淮安地區(qū)、宿遷地區(qū)和連云港均有發(fā)生。江蘇省的氣候特點(diǎn)適宜水稻白葉枯病菌的發(fā)生，前水稻白葉枯病防治相對(duì)較難，沒(méi)有特效藥劑，主要利用農(nóng)用鏈霉素、葉菌靈、葉枯寧、消病靈、菌毒清和拌種靈等殺菌劑用來(lái)防治。農(nóng)用抗菌素的使用目前也受到許多爭(zhēng)議。保障無(wú)公害、優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的供給和實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用是本世紀(jì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的最大挑戰(zhàn)。但是，化學(xué)農(nóng)藥的預(yù)防性過(guò)度使用，尤其在孕穗期使用，對(duì)稻米品質(zhì)造成潛在的影響。利用生物防治技術(shù)防治水稻稻瘟病和白葉枯病，國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)研究，但未見(jiàn)開(kāi)發(fā)出相對(duì)成熟的產(chǎn)品應(yīng)用于生產(chǎn)。通過(guò)引進(jìn)枯草芽孢桿菌■ /況i7is)控制植物病害的流行是目前植病生防研究中十分活躍的研究領(lǐng)域。美國(guó)已有四株枯草芽孢桿菌經(jīng)環(huán)保局(EPA)批準(zhǔn)進(jìn)入商品化或有限商品化應(yīng)用，如GB03、MBI600、QST7。陳志誼，許志剛，劉永鋒等開(kāi)發(fā)了新型的微生物殺菌劑“紋曲寧”，說(shuō)明利用枯草芽孢桿菌防治植物病害切實(shí)可行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株枯草芽孢桿菌，它可以作為生物農(nóng)藥防治植物多種病害，也可以作為生物肥料促進(jìn)作物增產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillussubti I is) T-500是從南京50份水稻田土壤樣品中分離獲得，已于2012年5月2日被中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC受理保藏，保藏編號(hào)為CGMCC NO :6058，拉丁學(xué)名為Bacillus subtilis T-500。其生物學(xué)性狀記載為T(mén)_500在YPGA培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)24h的菌落4-5mm，菌落圓形，四周光滑，米色，表面有皺褶。革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，細(xì)胞形狀為桿狀，細(xì)胞直徑大于lMffl，嚴(yán)格好氣，L 一阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、淀粉水解、明膠液化等利用反應(yīng)均為陽(yáng)性。 本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) T-500的培養(yǎng)方法,包括如下步驟
1)、菌株活化將枯草芽孢桿菌T500移入YPGA斜面培養(yǎng)基上，在28-32°C下培養(yǎng)24"72h ；
2)、種子培養(yǎng)將步驟I)活化后的菌株，移入YPG培養(yǎng)液中，120轉(zhuǎn)/分，28-32°C下培養(yǎng)24 72h ；
3)、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟2)中種子罐中的發(fā)酵液壓入發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28-32°C；轉(zhuǎn)速適當(dāng)；酸堿度7. 0-7. 4，待到菌體有90%變?yōu)檠挎吆?，檢測(cè)菌含量達(dá)到2X 101(lCfu/ml時(shí)出罐。步驟I)中YPGA斜面培養(yǎng)基組分為胰蛋白胨3-10g、酵母膏l(xiāng)-10g、葡萄糖l-10g，瓊脂 5-15g，水 IOOOml ；
步驟2)中YPG培養(yǎng)液組分為胰蛋白胨3-10g、酵母膏l(xiāng)-10g、葡萄糖l-10g，瓊脂5_15g,水 IOOOml ；
步驟3)中所用發(fā)酵培養(yǎng)基組分為碳源5-10g .171，氮源5-18 g -L'微量元素1-4. 5g L_\ pH=7. 0-7. 4 ;所述碳源為蔗糖或者淀粉中的一種或兩種混合，所述氮源為黃豆粉、豆餅粉、玉米槳中的一種或幾種種混合，所述微量元素為牛肉浸出膏、酵母膏或者魚(yú)粉中一種或兩種混合，以碳酸鈣調(diào)節(jié)pH?？莶菅挎邨U菌T-500在防治植物病害中的應(yīng)用。所述植物病害包括水稻稻瘟、水稻紋枯、水稻白葉枯病、水稻稻曲病、水稻細(xì)菌性條斑病，辣椒疫病以及由禾谷鐮刀菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌引起的儲(chǔ)藏期病害。枯草芽孢桿菌T500發(fā)酵出罐后，將發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)使用，也可以和三環(huán)唑、葉枯唑、鏈霉素、多菌靈、福美雙、嘧霉胺、甲霜靈等化學(xué)藥劑復(fù)配，菌劑質(zhì)量比占20-80%，在水稻苗期或者成熟期噴施，用于防治水稻病害。也可在辣椒等蔬菜苗期灌根?？莶菅挎邨U菌T-500也可在水稻促生增產(chǎn)方面進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明有益效果本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) T-500可以作為生物農(nóng)藥防治植物多種病害，也可以作為生物肥料促進(jìn)作物增產(chǎn)。尤其是對(duì)水稻病害有較好的防治效果，枯草芽孢桿菌T-500對(duì)水稻稻瘟菌、水稻紋枯菌、水稻白葉枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、禾谷鐮刀菌、黃曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，可以用于防治水稻稻瘟、水稻紋枯、水稻白葉枯病、水稻稻曲病、水稻細(xì)菌性條斑病，辣椒疫病以及由禾谷鐮刀菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌引起的儲(chǔ)藏期病害。在水稻葉面稀釋200-500倍防治水稻葉部病害、浸種后可防治水稻惡苗?。还喔煞乐问卟说鹊耐羵鞑『?。


圖I. T500和鏈霉素、葉枯唑復(fù)配防治水稻細(xì)菌性條斑病防治效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :枯草芽孢桿菌T500的發(fā)酵方法 枯草芽孢桿菌T500的發(fā)酵包括如下步驟
1)、菌株活化將枯草芽孢桿菌T500移入YPGA斜面培養(yǎng)基上，在28°C下培養(yǎng)48h；
2)、種子培養(yǎng)將步驟I)活化后的菌株，移入YPG培養(yǎng)液中，120rpm，28°C下培養(yǎng)48h。3)、發(fā)酵培養(yǎng)步驟2)中種子罐菌含量達(dá)到101(lCfU/ml時(shí)，將種子罐中的發(fā)酵液壓入發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28-32°C ;轉(zhuǎn)速80-150轉(zhuǎn)/分；酸堿度7. 0-7. 4，泡沫較多時(shí)可適量加入消泡劑，每隔2小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，觀(guān)察菌含量和測(cè)定發(fā)酵液的酸堿度。待到菌體有 90%變?yōu)檠挎吆?，檢測(cè)菌含量達(dá)到2X 101(lCfu/ml時(shí)出罐；出罐后將發(fā)酵液按照總量的2%加入苯甲酸防腐劑、攪拌均勻，進(jìn)行分裝即可應(yīng)用。步驟I)中YPGA斜面培養(yǎng)基組分為胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，瓊脂15g，水IOOOml ;步驟2)中YPG培養(yǎng)液組分為胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，水IOOOml ;步驟3)中所用發(fā)酵培養(yǎng)基組分為見(jiàn)表I。表I :5個(gè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)用培養(yǎng)基配方實(shí)例(單位Kg/噸)
組分I j Ii I ni
黃豆粉__5__9__7
酵母膏__2__I__0.8
魚(yú)粉__15__=__4
CaCQ3__QJ5__0J5__1.0
玉米茱__二__9__I
可溶性淀粉__5__二__6.
蔗糖__5__5__—
室內(nèi)檢測(cè)藍(lán)含量>2 X IQio個(gè)活芽孢
實(shí)施例2 T500對(duì)植物病害的抑菌作用
對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性測(cè)定將9mm水稻紋枯病菌菌餅接于PDA培養(yǎng)基平板中央，對(duì)峙三點(diǎn)放置6 mm無(wú)菌濾紙片，吸取10 UL枯草芽孢桿菌發(fā)酵液于濾紙片上，置于28 V恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。設(shè)未接枯草芽孢桿菌處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，待空白對(duì)照病原菌長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑制率。對(duì)禾谷鐮刀菌、黃曲霉及黑曲霉的抑菌活性測(cè)定方法與水稻稻曲病菌的抑菌活性測(cè)定方法相同。水稻稻曲病菌的抑菌活性測(cè)定將稻曲病菌接入PDA液體培養(yǎng)基中，置于140 r/min、28 °〇搖床培養(yǎng)5 7 d，待孢子量達(dá)到I X IO6 cfu/mL，吸取330 UL于PDA平板上，使用無(wú)菌L棒涂布均勻，對(duì)峙三點(diǎn)放入6 mm無(wú)菌濾紙片，吸取10 UL枯草芽孢桿菌發(fā)酵液于濾紙片上，置于28 1恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。設(shè)無(wú)枯草芽孢桿菌處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，待對(duì)照病原菌長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑制率。對(duì)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的抑菌活性測(cè)定將白葉枯病菌、細(xì)菌性條斑病菌接于NB培養(yǎng)液中，置于140r/min、28°C搖床培養(yǎng)36h、吸取330 U L病原菌菌液于NA培養(yǎng)基平板，使用無(wú)菌L棒將菌液涂布均勻，對(duì)峙三點(diǎn)放入6 mm無(wú)菌濾紙片，吸取10ml枯草芽孢桿菌T-500發(fā)酵液于濾紙片上，置于28 1恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。設(shè)無(wú)枯草芽孢桿菌處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，待對(duì)照病原菌長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑制率，結(jié)果見(jiàn)表2.
表2、T-500對(duì)8中植物病原菌的抑菌活性
對(duì)植物病原菌的抑制率(％) m水稻稻稻白葉水稻紋稻_差水稻想禾谷鐮黑曲黃曲 瘟病菌枯病菌枯病菌趣蘊(yùn).曲病菌刀菌霉菌霉菌
T500 61.1 40.8 74.0 62.5 48.6 27.06 61.4 35.7 實(shí)施例3、枯草芽孢桿菌與三環(huán)唑的相容性
在無(wú)菌的條件下，將枯草芽孢桿菌T500接入NB培養(yǎng)液中置于28°C，140r/min搖床培養(yǎng)48 h。稱(chēng)取適量20%三環(huán)唑，配置成含有三環(huán)唑濃度分別為100 iig/mL、500 u g/mLU000iig/mL、2000 iig/mL、3000 u g/mL,4000 u g/mL,5000 ii g/mL 的馬鈴薯平板和不含三環(huán)唑的馬鈴薯平板，定點(diǎn)放入濾紙片，濾紙片上含有10 y L培養(yǎng)好的T500發(fā)酵液，以不含三環(huán)唑的馬鈴薯平板中放入的濾紙片為對(duì)照，28°C培養(yǎng)2天后觀(guān)察并記錄菌落生長(zhǎng)情況。結(jié)果見(jiàn)表3，表明枯草芽孢桿菌T500在三環(huán)唑濃度為4000 U g/mL的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，在培養(yǎng)基含三環(huán)唑5000 u g/mL時(shí)菌落較小，生長(zhǎng)受到一定的抑制?？辜?xì)菌與20%三環(huán)唑相容性測(cè)定結(jié)果表明，T500與三環(huán)唑的相容性較好，對(duì)三環(huán)唑的敏感程度較低，可以與三環(huán)唑復(fù)配使用。表3枯草芽孢桿菌與三環(huán)唑的相容性測(cè)定結(jié)果
菌襪三零Iig-HiL
Strains 100 500 1000 2000 3000 4000 5000T500 -H-+ +++ +++ +++ -H-+ +++ -H-
注+++ :菌落生長(zhǎng)很好；++ :菌落生長(zhǎng)較好；+ :菌落略有生長(zhǎng)；一菌落不生長(zhǎng)(生長(zhǎng)情況與對(duì)照相比)
實(shí)施例4、枯草芽孢桿菌T-500對(duì)水稻白葉枯病的防治效果
將水稻白葉枯感病品種金剛30的水稻種子在無(wú)菌水中28°C下浸種48 h，除去無(wú)菌水進(jìn)行保濕催芽48 h，將催芽后的水稻播種在塑料盆缽中，待水稻苗長(zhǎng)到四葉一心時(shí)期，采用剪葉接種，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液葉面噴霧處理。水稻白葉枯病菌浙173菌液培養(yǎng)將白葉枯病菌接入NB液體培養(yǎng)基中，置于28°C，140 r/min搖床培養(yǎng)24 h，菌液濃度達(dá)I X IO6 cfu/mL為接種體。采用剪刀沾取水稻白葉枯病菌菌液在第五葉片葉尖處剪口接種，隨后使用濃度為lX108cfu/ml的待測(cè)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行葉面噴霧處理。每處理重復(fù)3次，采用空白培養(yǎng)液為對(duì)照處理。接種后3周調(diào)查，每處理調(diào)查30株水稻苗。白葉枯病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算防治效果。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is、T-500,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)CGMCC NO :6058。
2.權(quán)利要求I所述的枯草芽孢桿菌T-500在防治植物病害中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌T-500在防治植物病害中的應(yīng)用，其特征在于所述植物病害包括水稻稻瘟、水稻紋枯、水稻白葉枯病、水稻稻曲病、水稻細(xì)菌性條斑病，辣椒疫病以及由禾谷錸刀菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌引起的儲(chǔ)藏期病害。
4.權(quán)利要求I所述的枯草芽孢桿菌T-500在水稻促生增產(chǎn)方面的應(yīng)用。
全文摘要
一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T-500，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)CGMCC NO6058。本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T-500可以作為生物農(nóng)藥防治植物多種病害，也可以作為生物肥料促進(jìn)作物增產(chǎn)?？莶菅挎邨U菌T-500對(duì)水稻稻瘟菌、水稻紋枯菌、水稻白葉枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、禾谷鐮刀菌、黃曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，并對(duì)其引起的病害有較好的防控作用。在水稻葉面稀釋200-500倍防治水稻葉部病害、浸種后可防治水稻惡苗??；灌根可防治蔬菜等的土傳病害。
文檔編號(hào)A01N63/00GK102816725SQ20121032871
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者劉永鋒, 陳志誼, 于俊杰, 劉郵洲, 聶亞鋒 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院