專利名稱：用于rna提取的橡膠樹葉片短期保存方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種葉片組織保存方法，具體是一種用于RNA提取的橡膠樹葉片短期保存方法。
背景技術：
橡膠樹(Hevea spp.)是大戟科(Euphorbiaceae)橡膠樹屬(Hevea)多年生的異花授粉喬木，為熱帶地區(qū)產膠的特種林木，是一類重要的經濟作物。我國已具規(guī)模的天然橡膠基地主要分布在海南、云南和廣東3省。從上世紀90年代開始，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，橡膠樹的研究也逐漸進入分子水平。從轉錄水平上對橡膠樹產量、抗逆、生長發(fā)育和代謝等相關基因表達及調控進行研究，是橡膠樹表達數(shù)量性狀基因座(expressionquantitative traitlocus, eQTL)定位、轉基因育種、轉基因品種鑒定、輔助育種等工作的 一種重要手段，而獲取高質量的總RNA是開展分離基因和分析基因表達特性等分子生物學研究的重要基礎。目前，提取橡膠樹葉片基因組RNA的常規(guī)方法主要有熱硼酸/蛋白酶K法和CTAB/酸酚法，兩種方法所提RNA濃度和純度均能達到后續(xù)的cDNA文庫構建或PCR擴增等分子生物學實驗的要求。離子型去污劑SDS、D0C和CTAB都是通過使蛋白質變性，破壞膜結構及解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。但用熱硼酸/蛋白酶K法提取的RNA的純度更高、質量更好，原因是橡膠樹組織富含酚類物質，而選用硼酸緩沖液體系的RNA提取液有利于去除組織中的酚類物質，其中的硼酸可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復合物，抑制了酚類物質的氧化及其與RNA的結合。在提取植物葉片RNA的研究中，常規(guī)方法多采用新鮮或冷凍的材料。提取RNA的材料應當盡量保持新鮮，樣品保存的好壞，將直接影響RNA的提取效果。因此膠園采集新鮮材料時最好攜帶液氮罐、干冰箱、冰盒或冰桶，但在實際工作中，有時由于遠距離采樣無法攜帶液氮罐，而可攜帶的干冰箱、冰盒或冰桶的缺點是維持時間短，不能滿足取樣的需要，此時植物樣品的保存成為決定其中的RNA的結構保持完整與否的一個關鍵步驟。冷凍是保持植物樣品組織成分最有效的方式之一，目前冷凍主要集中在超低溫保存，-80°C冰箱保存的樣品所提的總RNA的質量和數(shù)量都與新鮮葉片相當。而野外攜帶液氮或干冰采樣存在價格昂貴、罐體笨重、操作繁瑣、易揮發(fā)、危險性高等缺點，未能達到簡單、經濟、安全、高效等效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足而提供一種用于RNA提取的橡膠樹葉片短期保存方法，其利用儲藏緩沖液與低溫冷藏結合的方法保存橡膠樹葉片組織，可有效地實現(xiàn)短時間保持橡膠樹葉片的新鮮度，便于遠距離采樣、材料運輸和貯存，有效地提高了樣品RNA提取質量的保險性。本發(fā)明所采用的技術原理硼酸鹽緩沖液(四硼酸鈉，Sodium Borate, SBX,PH9. O)提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞，研究表明，提取緩沖液中含有的硼酸在弱堿性條件下可以與酚類以氫鍵形成復合物，抑制酚類物質的氧化及其與RNA的結合，同時具有防腐朽菌、蛀蟲作用，用于橡膠木的濃度為30 50mM;EGTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制RNase活性；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一種高分子合成樹脂，可溶于水、乙醇及氯仿，工業(yè)上常用作澄清劑、穩(wěn)定劑，能絡合多酚類物質，防止多酚物質氧化成醌類物質，避免溶液變褐而具有抗氧化作用；二硫蘇糖醇(DTT)是常用還原劑，具有與β_巰基乙醇同樣的抗氧化作用，可有效地防止橡膠樹葉片中酚類物質的氧化，避免褐變，有助于酚的去除，但DTT和β -巰基乙醇相比，DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比β -巰基乙醇低很多，而且DTT比β-巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近，僅DTT價格略高一些。蔗糖(Sucrose)為葉片提供碳源，離體葉片自養(yǎng)能力較差，就難免會影響其生理代謝，蔗糖經熬煮和高壓滅菌后就會分解成葉片細胞能夠直接吸收的葡萄糖和果糖形式。本發(fā)明所采用的技術方案一種用于RNA提取的橡膠樹葉片短期保存方法，是采集處于小古銅期、大古銅期、變色期或淡綠期的橡膠樹嫩葉，裝進10 50ml離心管，分2次加入5 25ml儲藏緩沖液，然后將離心管放入裝有冰塊、溫度為O 4°C的冰盒或冰桶中，帶回實驗室后，擱置在溫度為O 4°C的冰塊上，待用。所述儲藏緩沖液是將Sodium Borate、Na-EGTA, PVP-40、DTT和蔗糖加入到無菌水中配制而成，其中各組分的含量為Sodium Borate 150 250mM、Na EGTA 7· 5 12. 5mM、PVP 2 4% (ff / V),DTT 10 20mM、蔗糖 3 5% (W / V)，其中PVP、蔗糖含量為質量體積比含量。根據保存周期長短確定樣品處理方式I、短期保存需將樣品管裝入封口袋內，寫上標簽，待所有樣品處理完畢統(tǒng)一放置。對于試驗安排在異地進行的研究，材料的寄送是不可缺少的一個環(huán)節(jié)，針對在RNA水平上進行基因組學研究的實驗，只要將上述準備好的樣品放置配備了冰袋的泡沫箱里(O 4 °C),蓋嚴箱子，用膠帶密封，即使路上耽誤，高溫天氣，冰袋也溶化，一周后，收到的樣品仍然保持綠色。2、長期保存倒去儲藏緩沖液，旋緊管蓋，放入盛有液氮的容器，該處理主要是保護RNA不降解，待所有樣品充分冷凍后統(tǒng)一放置-70 -80°C冰箱；樣品隨時可取用，具備攜帶液氮取樣_80°C保存或液氮冷凍過的新鮮葉片同樣的效果。本發(fā)明利用儲藏緩沖液與低溫冷藏結合的方法保存橡膠樹葉片組織，可有效地實現(xiàn)短時間保持橡膠樹葉片的新鮮度，便于遠距離采樣、材料運輸和貯存，具有工藝簡單、成本低、效果好等特點，提高了樣品RNA提取質量的保險性。


圖I為利用熱硼酸/蛋白酶K法提取的橡膠樹葉片組織總RNA電泳圖譜。圖中1為新鮮葉片，2為采用本發(fā)明方法短期保存葉片。圖2為利用CTAB/酸酚法提取的橡膠樹葉片總RNA效果檢測圖。圖中1為采用攜帶液氮采樣后經超低溫長期保存的葉片，2為采用本發(fā)明儲藏緩沖液短期保存及液氮速凍后經超低溫長期保存的葉片。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、緩沖液調配為提高儲藏緩沖液的質量，緩沖液需要調配，對配方中五個主要因素各按三個水平進行試驗(見表I)。尋求到最佳的水平組合，保證緩沖液有效、經濟。采用該組配方配制葉片組織保存儲藏緩沖液。儲藏緩沖液配制后，在121°c的高壓下蒸氣滅菌15 min，但因DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理，DTT配制后過濾除菌，PVP-40和DTT臨用前加入儲藏緩沖液。表I儲藏緩沖液五因子正交試驗設計表
權利要求
1.一種用于RNA提取的橡膠樹葉片短期保存方法，其特征是采集處于小古銅期、大古銅期、變色期或淡綠期的橡膠樹嫩葉，裝進10 50ml離心管，分2次加入5 25ml儲藏緩沖液，然后將離心管放入裝有冰塊、溫度為0 4°C的冰盒或冰桶中，帶回實驗室后，擱置在溫度為0 4°C的冰塊上，待用；所述儲藏緩沖液是將Sodium Borate、Na-EGTA、PVP-40、DTT和蔗糖加入到無菌水中配制而成，其中各組分的含量為Sodium Borate 150 250mM、Na EGTA 7. 5 12. 5mM、PVP 2 4%、DIT 10 20mM、蔗糖 3 5%，其中 PVP、蔗糖含量為質量體積比含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于RNA提取的橡膠樹葉片短期保存方法，是采集處于小古銅期、大古銅期、變色期或淡綠期的橡膠樹嫩葉，裝進離心管中，加入儲藏緩沖液，然后將離心管放入裝有冰塊、溫度為0～4℃的冰盒或冰桶中，帶回實驗室后，擱置在溫度為0～4℃的冰塊上，待用。本發(fā)明利用儲藏緩沖液與低溫冷藏結合的方法保存橡膠樹葉片組織，可有效地實現(xiàn)短時間保持橡膠樹葉片的新鮮度，便于遠距離采樣、材料運輸和貯存，具有工藝簡單、成本低、效果好等特點，提高了樣品RNA提取質量的保險性。
文檔編號A01N3/00GK102805078SQ20121029780
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月20日 優(yōu)先權日2012年8月20日
發(fā)明者吳春太, 黃華孫, 李維國, 高新生, 張曉飛, 王祥軍 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所